Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Streszczenie

Mikroskopia krioelektronowa (cryoEM) polega na błyskawicznym zamrożeniu cienkiej warstwy próbki na podłożu, a następnie wizualizacji próbki w stanie zamrożonym, uwodnionym za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Można to osiągnąć przy bardzo małej ilości białka i w wybranym buforze, bez użycia jakiegokolwiek barwienia, co jest bardzo przydatne do określania korelacji struktura-funkcja makrocząsteczek. W połączeniu z przetwarzaniem obrazów pojedynczych cząstek, technika ta znalazła szerokie zastosowanie w określaniu struktury 3D oczyszczonych makrocząsteczek.

Przedstawiony tutaj protokół wyjaśnia, jak przeprowadzić krioEM i bada przyczyny najczęściej napotykanych problemów w celu racjonalnego rozwiązywania problemów; przestrzeganie wszystkich tych kroków powinno prowadzić do uzyskania wysokiej jakości obrazów krioEM. Technika ta wymaga dostępu do mikroskopu elektronowego i urządzenia do witryfikacji. Znajomość koncepcji rekonstrukcji 3D i oprogramowania jest również potrzebna do komputerowego przetwarzania obrazu. Co ważne, wysoka jakość wyników zależy od znalezienia odpowiednich warunków oczyszczania prowadzących do uzyskania jednolitej populacji nienaruszonych strukturalnie makrocząsteczek.

Zdolność cryoEM do wizualizacji makromolekuł w połączeniu z wszechstronnością przetwarzania obrazów pojedynczych cząstek okazała się bardzo skuteczna w określaniu strukturalnym dużych białek i maszyn makromolekularnych w ich stanie zbliżonym do natywnego, identyfikacji ich wielu składników za pomocą mapowania różnic 3D oraz tworzeniu struktur pseudo-atomowych poprzez dokowanie struktur rentgenowskich. Nieustanny rozwój oprzyrządowania krioelektromagnetycznego i technik przetwarzania obrazu w ciągu ostatnich 30 lat zaowocował możliwością generowania de novo rekonstrukcji 3D na poziomie rozdzielczości atomowej.

Wprowadzenie

Celem cryoEM jest uzyskanie mikroskopijnych obrazów makrocząsteczek w ich naturalnym stanie uwodnionym. Dzięki osadzeniu makrocząsteczki w zeszklonej wodzie, zamrożona próbka uwodniona może być bezpośrednio wprowadzona i zwizualizowana w urządzeniu TEM. Witryfikacja, osiągana przez błyskawiczne zamrażanie (10 000 ^oC/s), zamraża próbkę bez krystalizacji wody i zapewnia, że przegrupowania molekularne podczas zamrażania są nieznaczne. Nadmierne rozproszenie elektronów próbki w stosunku do otaczającego buforu zapewnia niewielki, ale wystarczający kontrast, aby zobaczyć makrocząsteczkę przy braku jakiegokolwiek barwienia ¹. Komputerowe przetwarzanie obrazu może być następnie wykorzystane do odtworzenia struktury 3D makrocząsteczki. Duże makrocząsteczki w zakresie ~500 kDa- multi MDa są idealnymi próbkami do krioEM (stanowią ponad 80% wpisów w Banku Danych Mikroskopii Elektronowej (EMDB)); Należą do nich białka, kompleksy białkowe, kompleksy białko-kwasy nukleinowe i białka błonowe osadzone w dwuwarstwie. Te makrocząsteczki są mniej podatne na krystalizację (z mniej niż 2% wpisami w bazie danych PDB), ale często zdarza się, że mniejsze cząstki rozwiązane za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub NMR mogą być zadokowane w otoczce 3D utworzonej przez krioEM. Z drugiej strony, niektóre z największych struktur rozwiązanych przez krioEM można zidentyfikować w całej komórce za pomocą cienkiego przekroju TEM ². W ten sposób cryoEM skutecznie wypełnia lukę w wielkości i rozdzielczości między strukturami subkomórkowymi i atomowymi.

CryoEM lepiej odzwierciedla natywną strukturę makrocząsteczki niż bardziej klasyczna metoda barwienia ujemnego (NS), gdzie makrocząsteczka jest odwodniona i otoczona warstwą barwnika z metali ciężkich, dzięki czemu obszar wykluczenia plamy tworzy silnie skontrastowany "negatywny" obraz ³. W obu przypadkach wiązka elektronów wytwarza obrazy projekcyjne 2D makrocząsteczek, zwanych cząstkami, gdzie kształt zależy od orientacji makrocząsteczki w stosunku do wiązki elektronów. Wiele cząstek, co najmniej ~1000 i bez górnego limitu, może być analizowanych na komputerze za pomocą oprogramowania do analizy pojedynczych cząstek (SPA) w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu (SNR) poprzez uśrednianie i znalezienia parametrów orientacji przestrzennej cząstki potrzebnych do odtworzenia struktury 3D makrocząsteczki przez projekcję wsteczną ^4-7. NS, o wyższym SNR, jest używany do wstępnej charakterystyki próbki i do generowania rekonstrukcji 3D de novo; jego rozdzielczość rzadko przekracza 20 A, co jest narzucone przez odwodnienie i wielkość ziarna metalu ciężkiego. Ogólnie rzecz biorąc, w celu określenia struktury krioEM 3D, najpierw uzyskuje się rekonstrukcję 3D o niskiej rozdzielczości z NS, a następnie cryoEM wykorzystuje się do udoskonalenia tej początkowej mapy o niskiej rozdzielczości w celu dalszego badania makrocząsteczki w jej naturalnym stanie uwodnionym, aby zobaczyć jej wewnętrzną strukturę i zwiększyć jej rozdzielczość. Należy zauważyć, że jeśli model NS był zniekształcony (najczęstszym przykładem jest spłaszczenie wynikające z odwodnienia ⁸), a cząstki krioEM miały niski SNR, wówczas zniekształcenie może przenieść się do modelu cryoEM (artefakt odchylenia modelu, który jest powszechny w zestawach danych o niskim SNR ⁹). Zniekształcenia strukturalne skutkowałyby niedopasowaniem między surowymi cząstkami NS i krioEM oraz między surowymi cząstkami krioEM a odpowiadającymi im rzutami modelu 3D prostopadłymi do kierunku spłaszczania. Odchylenie modelu może ustąpić samoistnie, gdy model 3D jest poddawany kolejnym cyklom udoskonalania. Jeśli tak się nie stanie, co zostanie wykryte jako brak zgodności między surowymi cząstkami krioEM a odpowiadającymi im projekcjami z modelu 3D, należy skonstruować model de novo na podstawie danych krioEM. Dobrym podejściem może być użycie algorytmu rekonstytucji kątowej ¹⁰, który może dać kilka możliwych objętości 3D, a następnie użycie modelu 3D NS w celu wybrania najlepszego możliwego modelu krioEM, który będzie dalej dopracowywany ¹¹. Jeszcze lepszą strategią jest zwiększenie SNR zestawu danych cryoEM (patrz dedykowana sekcja w Dyskusji).

Biochemiczna jakość oczyszczonej makrocząsteczki ma największy wpływ na końcowy wynik. Makrocząsteczka, oczyszczona z tkanki lub ulegająca ekspresji w układach heterologicznych, musi mieć wysoki stopień czystości i być strukturalnie nienaruszona. Nie powinien on ani tworzyć agregatów, ani ich dezagregować. Aby zdefiniować konkretną konformację, warunki przygotowania powinny sprzyjać jednolitemu stanowi konformacyjnemu. Do badania kompleksów optymalne jest, aby ich k_D mieściło się w zakresie nM, w przeciwnym razie z powodzeniem stosuje się utrwalacze do stabilizacji oddziaływań o niższym powinowactwie ^12,13.

Nieprzetworzone obrazy cryoEM dostarczają cennych informacji o wymiarach, ogólnym zarysie, stanie agregacji/multimeryzacji, jednorodności i wewnętrznej strukturze makrocząsteczki. Niemniej jednak potencjał tej techniki jest znacznie zwiększony dzięki przetwarzaniu obrazu. Struktura 3D ujawnia ogólną architekturę makrocząsteczki, lokalizację 3D ligandów i podjednostek, zmiany konformacyjne i umożliwia dokowanie struktur atomowych określonych za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub NMR. Ilość informacji o rekonstrukcji 3D wzrasta stopniowo wraz ze wzrostem rozdzielczości: na ogół rozdzielczość 15-20 A pozwala na jednoznaczne dokowanie struktur atomowych, przy 9-10 A helisy alfa są widoczne jako pręty, przy 5 A możliwe jest rozpoznanie arkuszy beta, a przy rozdzielczościach 3,5 A i lepszych możliwe jest zbudowanie modelu atomowego ¹⁴.

Możliwość uzyskania obrazów informacyjnych i rekonstrukcji 3D za pomocą SPA ze stosunkowo małych ilości próbek sprawia, że cryoEM jest atrakcyjną techniką, ponieważ 3-5 μl co najmniej 0,05 mg/ml jest wystarczające do przygotowania jednej siatki TEM. Minimalne wymagania instrumentalne dla krioEM to domowy lub komercyjny kriotłok, mikroskop elektronowy z ultra wysoką próżnią, nośniki do zapisu obrazu i zestaw do niskiej dawki, kriouchwyt ze stacją pompowania, aparat do wyładowań jarzeniowych i parownik. Nieistotnymi, ale dodatkowo pożądanymi funkcjami TEM są kamera CCD (obecna we wszystkich nowoczesnych TEM) lub bezpośredni detektor elektronów, pistolet do emisji pola (FEG), filtrowanie energii i oprogramowanie do zbierania danych o wysokiej przepustowości. Oprogramowanie to zasadniczo umożliwia zbieranie dziesiątek tysięcy cząstek w jednej sesji krioelektromagnetycznej ¹⁵, jednak należy wziąć pod uwagę zwiększone potrzeby w zakresie przechowywania danych i późniejszy nadzorowany czas przetwarzania końcowego. FEG w połączeniu z korekcją funkcji transferu kontrastu (CTF) leży u podstaw większości rekonstrukcji 3D, które osiągnęły rozdzielczość wystarczającą do wizualizacji helis alfa. W tym momencie poziom rozdzielczości jest również zależny od próbki: osiągnięcie rozdzielczości 10 A jest mniej powszechne w przypadku białek błonowych, podczas gdy jeśli występuje wysoki porządek symetrii, rozdzielczość atomowa jest bardziej osiągalna. Niedawny rozwój bezpośrednich detektorów elektronów umożliwił uzyskanie rozdzielczości atomowej nawet dla makrocząsteczek o niskiej (4x) symetrii lub bez symetrii, gdzie jakość map gęstości elektronów krioEM odpowiada jakości uzyskanej z danych dyfrakcji rentgenowskiej ^16,17.

Praktyczne przykłady ilustrujące możliwości tej techniki są tutaj podane dla czterech ważnych typów makromolekuł, w których krioEM odgrywa główną rolę w ich strukturalnym determinowaniu. (i) Dzięki ich dwudziestościennej symetrii, która zwiększa zbiór danych 60-krotnie, i ich dużym rozmiarom, który pozwala na wierne i powtarzalne wyrównanie, struktury kilku wirusów dwudziestościennych zostały rozwiązane do rozdzielczości bliskiej atomowej przez krioEM, a następnie SPA ¹⁸. Pokazujemy przykład klasy wirusów dwudziestościennych, wirusów związanych z adenowirusami (AAV), dla których istnieją struktury prawie atomowe za pomocą krioEM i hybrydowych metod krioEM/rentgenowskich ^19,20. (ii) Makrocząsteczki o strukturze spiralnej obejmują mikrotubule, włókna i wirusy. Ich powtarzalne jednostki wzdłuż osi mogą być analizowane przez bardziej złożoną wersję SPA dostosowaną do geometrii śrubowej ²¹. W przykładzie pokazujemy wirusa mozaiki tytoniu (TMV), wirusa RNA, który został rozwiązany do rozdzielczości atomowej przez cryoEM ²². (iii) Duże rozpuszczalne białka zostały obszernie przebadane. Wśród nich makrocząsteczki tworzące symetryczne cylindry multimeryczne stanowią powtarzającą się architekturę, często rozwiązywaną w rozdzielczości subnanometrowej ^23,24. Tutaj pokazujemy obrazy KLH, nośnika tlenu bezkręgowców, gdzie stworzono hybrydowy model molekularny z hybrydowych metod kriogenografii EM/krystalografii rentgenowskiej ²⁵. (iv) Białka błonowe są ważną klasą białek; Stanowią one około 1/3 białek kodowanych przez ludzki genom, jednak są trudne do scharakteryzowania strukturalnie ze względu na złożoność związaną ze stabilizacją domeny transbłonowej ²⁶, stanowiąc mniej niż 1,5% struktur rozwiązanych za pomocą dowolnej techniki strukturalnej łącznie. Rola cryoEM i rekonstrukcji 3D w ich determinacji strukturalnej jest zilustrowana za pomocą receptora ryanodine (RyR), dużego eukariotycznego wewnątrzkomórkowego kanału Ca²+ ważnego w skurczu mięśni i sygnalizacji mózgowej. Struktury krioEM o najwyższej do tej pory, o rozdzielczości 10 A, ujawniają strukturę ^{drugorzędową 27}.

Protokół

1. Przygotowanie i konserwacja komory kriogenicznej

UWAGA: Sucha przepompownia, składająca się z turbo stacji pomp i jednego lub więcej kontrolerów zimnego etapu, jest przede wszystkim używana do trzech celów: a) Jest to bezpieczne miejsce do przechowywania uchwytów kriogenicznych, gdy nie są używane. Właściwym sposobem przechowywania uchwytów jest pozostawienie ich w stacji pod próżnią. b) Aby odparować nagromadzenie szronu i wilgoci, które występuje, gdy ciekły azot jest usuwany z dewara i odsłonięta jest końcówka uchwytu kriogenicznego; Osiąga się to dzięki cyklowi rozgrzewania. c) Aby zregenerować środek osuszający zeolitowy i osiągnąć wysoką próżnię w krioholderze Dewara. Jest to konieczne do utrzymania stałej temperatury podczas wykonywania kriomikroskopii elektronowej.

1. Cykl rozgrzewki.
   1. Włóż uchwyt kriogeniczny do jednego z króćców pompowych przepompowni. Podłącz jedną z rurek ewakuacyjnych do metalowego wylotu pod zaworem podciśnieniowym uchwytu. Upewnij się, że wszystkie zawory na stacji (V1, V2 i V3) oraz na uchwycie kriogenicznym są zamknięte.
   2. Włącz zimny stage kontroler i podłącz go do uchwytu za pomocą przewodu sterującego. Włącz wyłącznik zasilania przepompowni turbo.
   3. Uruchom opcję Cykl rozgrzewania w zimnym stage kontrolerze. Gdy podciśnienie w przepompowni turbo wskaże ^10-3 Torr lub więcej, otwórz przepustnicę V2, poczekaj, aż podciśnienie się ustabilizuje, a następnie otwórz przepustnicę V1.
   4. Uruchom cykl rozgrzewania na około 30 minut, aż temperatura w uchwycie ustabilizuje się powyżej 20 °C. Zamknij V1, a następnie zatrzymaj cykl.
2. Cykl zeolitowy. Uruchom cykl zeolitu między 4 godzinami a O/N przed sesją krioEM i raz w tygodniu, jeśli nie jest używany.
   1. Uruchom opcję cyklu zeolitu i wybierz niezbędny czas do osiągnięcia dobrej próżni w zakresie 1-2 x ^10-4 Torr, a tym samym długiego czasu podtrzymania. Gdy próżnia osiągnie ^10-3 Torr, otwórz zawór spustowy Dewara, V3. Przepompownia następnie opróżni linię do uchwytu; Poczekaj, aż podciśnienie się ustabilizuje.
   2. Otwórz zawór na uchwycie krio. Po zakończeniu cyklu zamknij zawory w odwrotnej kolejności, w jakiej zostały otwarte: zawór na uchwycie, następnie V3, V2 i na końcu V1. Wyłącz stację pompowania turbo i sterownik zimnego etapu i odłącz uchwyt kriogeniczny od sterownika zimnego etapu i stacji pomp turbo.

2. Przygotowanie siatki

1. Czyszczenie.
   UWAGA: W przypadku korzystania z komercyjnych siatek dziurawych zaleca się ich wyczyszczenie przed użyciem, aby usunąć wszelkie pozostałości polimeru, który został użyty w procesie produkcji. Zrób to na szklanej szalce Petriego z 5 warstwami bibuły filtracyjnej ułożonej na dnie.
   1. Umieść kratki na bibule filtracyjnej dziurawą stroną z węgla skierowaną do góry.
   2. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zwilż papier kilkoma kroplami chloroformu wokół siatek, aż zaczną unosić się na wodzie.
   3. Przykryj szalkę Petriego z lekko uchyloną pokrywką w dygestoriach O/N.
2. UWAGA: cienką podporę węglową (kroki 2.2-2.3) można pominąć, ponieważ warstwa lodu może być uformowana bezpośrednio w poprzek małych otworów w dziurawej siatce węglowej.
   1. Za pomocą pęsety rozetnij kawałek miki, aby odsłonić dwie nowe powierzchnie. Umieść nowe odsłonięte powierzchnie miki stroną zadrukowaną do góry na białym kartce papieru na szalce Petriego.
   2. Umieść szalkę Petriego w słoiku dzwonowym parownika węglowego. Rozpocznij sekwencję pompowania w dół, aż podciśnienie spadnie poniżej 2 x ^10-6 Torr. Aby odparować wszelkie zanieczyszczenia na powierzchni pręta węglowego, należy przeprowadzić wstępne odparowanie z przykrytą szalką Petriego. Następnie przewietrz słoik i zdejmij pokrywkę z szalki Petriego.
   3. Wykonaj sekwencję pompowania w dół, aż próżnia spadnie poniżej ^10-6 Torr i pokryj mikę cienką warstwą (~5 nm) węgla. Używaj ochrony oczu podczas parowania węgla. Monitoruj grubość filmu węglowego na podstawie powstałej ciemności na papierze, który został umieszczony pod arkuszami miki.
3. Przenieś cienki węgiel do siatki TEM.
   1. Wytnij kawałek powlekanej miki o wymiarach 0,5 x 1 cm i wynieś węgiel na płaską powierzchnię przefiltrowanej, zdejonizowanej wody. Użyj papieru do soczewek optycznych, aby uzyskać płaską powierzchnię wody. Za pomocą pęsety umieść dziurawą węglową stronę siatki w kontakcie z górną powierzchnią pływającej warstwy węgla i podnieś ją.
   2. Powtarzać kroki 2.3.1 i 2.3.2, aż zostanie przygotowana wystarczająca liczba siatek.
4. Wyładowanie jarzeniowe.
   UWAGA: Wyładowanie jarzeniowe przekształca naturalnie hydrofobową warstwę węglową siatek w hydrofilową. Ten krok jest opcjonalny.
   1. Umieść kratki stroną z włókna węglowego skierowaną do góry na szkiełku o wymiarach 7,5 x 2,5 cm pokrytym Parafilmem. Umieść go w komorze urządzenia jarzeniowego i zamknij komorę.
   2. Pompuj słoik dzwonowy i wyładowanie jarzeniowe przez 20 sekund przy 25 mA i 7 x ^10-2 mbars.
      UWAGA: W tym czasie widoczna staje się jasnofioletowa poświata. Zdejmij szkiełko z kratkami i zużyj je w ciągu 1 godziny, w przeciwnym razie będą musiały zostać ponownie rozładowane jarzeniowo.

3. Zamrażanie próbki metodą wgłębną

UWAGA: Używaj okularów ochronnych i odpowiedniego obuwia podczas korzystania z tego instrumentu, aby chronić przed rozpryskami ciekłego azotu i etanu.

1. Włącz urządzenie do zamrażania wgłębnego. Napełnij zbiornik nawilżacza wodą destylowaną. Ustaw żądaną temperaturę, wilgotność względną i warunki zanurzania dla czasu osuszania, siły kleksa i czasu adsorpcji (22 °C, 95%, 2 sekundy, 2 i 40 sekund w przedstawionym tutaj przykładzie). Umieść nową bibułę filtracyjną do bibuły.
2. Schłodzić pojemnik na etan, napełniając zewnętrzny zbiornik ciekłym azotem, aż do osiągnięcia stabilności (około 10 min). Gdy ciekły azot przestanie wrzeć, umieść końcówkę rurki wychodzącej ze zbiornika etanu w komorze wewnętrznej i bardzo powoli otwórz zawór. Skroplić etan w komorze wewnętrznej i napełnić go do 1 mm od góry. Unikaj zamrażania etanu. UWAGA: etan jest skrajnie łatwopalny i wybuchowy.
3. Upewnij się, że pęseta jest wyrównana w aparacie do zamrażania wgłębnego.
4. Włącz wilgotność. Załaduj siatkę na pęsetę i załaduj 3-5 μl próbki na węglową powierzchnię (stronę) dziurawej siatki. Poczekaj, aż próbka zaadsorbuje się na siatce i wykonaj osuszanie, aby uzyskać cienką warstwę cieczy.
5. Błyskawiczne zamrożenie siatki poprzez zanurzenie jej w ciekłym etanie. Wyjmij zespół pęsety-siatki z ciekłego etanu, trzymając stabilnie pęsetę, i przenieś go do zewnętrznej komory z ciekłym azotem. Przenieś siatkę do małego pudełka siatkowego zanurzonego w ciekłym azocie. Upewnij się, że zeszklona próbka jest przechowywana w ciekłym azocie przez cały czas podczas przenoszenia do zbiornika magazynowego lub do uchwytu kriogenicznego.
   UWAGA: Skrzynki siatkowe można przechowywać w dewarze z ciekłym azotem o dużej pojemności (35-50 l) przez co najmniej 1 rok. Dla wygodnego przechowywania można je umieścić w tubie Falcon o pojemności 50 ml z dwoma wywierconymi otworami u góry i żyłką przymocowaną do nasadki, którą można wyciągnąć z ust dewara.

4. Przenieś krio-siatkę do TEM

1. Włóż uchwyt kriogeniczny do stacji roboczej do kriotransferu. Uważaj, aby nie uszkodzić końcówki uchwytu podczas wkładania. Sprawdź, czy na pręcie i O-ringu uchwytu kriogenicznego nie ma małych włókien i kurzu, za pomocą lupy usuń ją papierem do soczewek optycznych.
2. Napełnij dewar uchwytu kriogenicznego i naczynia stacji roboczej ciekłym azotem. Unikaj rozlewania ciekłego azotu, korzystając z uwięzionego lejka dołączonego do stacji roboczej.
3. Podłącz uchwyt kriogeniczny do sterownika zimnego sceny, aby monitorować temperaturę i dodawać ciekły azot, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie około -194 °C. Upewnij się, że poziom ciekłego azotu jest poniżej poziomu uszczelki próżniowej zarówno w naczyniu stacji roboczej, jak i w uchwycie kriogenicznym Dewara. Wstępnie schłodzić pęsetę do siatki, pierścień zaciskowy i koniec narzędzia do pierścienia zaciskowego na stacji roboczej. Schłodź również zestaw dużych pęset i śrubokręt w innym dewarze wypełnionym ciekłym azotem.
4. Za pomocą dużej pęsety szybko przenieś pojemnik z siatką kriogeniczną zawierającą zamrożone uwodnione siatki do ciekłego azotu w stacji roboczej. Otwórz pudełko z siatką kriogeniczną za pomocą śrubokręta, weź zamrożoną uwodnioną siatkę i umieść ją w gnieździe uchwytu na próbkę.
5. Umieść pierścień zaciskowy na siatce i delikatnie dociśnij go końcem narzędzia do pierścienia zaciskowego, aż zostanie mocno osadzony na miejscu. Zamknij migawkę kriogeniczną. Wyjmij narzędzia i skrzynkę z siatką kriogeniczną ze stacji roboczej.
6. Przenieść całe stanowisko pracy z uchwytem i siatką do konsoli mikroskopu, aby zminimalizować czas transferu siatki do powietrza w pomieszczeniu.
7. Uzupełnij środek przeciw skażeniu TEM ciekłym azotem, który został wcześniej napełniony i schłodzony przez co najmniej 20 minut. Wstępnie przechyl stolik mikroskopu do -60°.
   UWAGA: Zminimalizuje to utratę ciekłego azotu podczas wkładania uchwytu do śluzy powietrznej.
8. Rozpocznij cykl śluzy powietrznej przed pompą w mikroskopie. Upewnij się, że zawór do pistoletu elektronowego jest zamknięty (zwłaszcza jeśli jest to FEG TEM). Poczekaj na zakończenie sekwencji śluzy powietrznej przed pompą (około 2 minut) przed włożeniem uchwytu kriograficznego.
   UWAGA: Jest to sygnalizowane przez czerwone światło na stage gasze.
9. Włóż uchwyt do śluzy powietrznej i obróć go o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara; Podłącz przewód sterownika zimnego etapu do uchwytu kriogenicznego, aby monitorować temperaturę. Poczekaj ponownie, aż czerwone światło zgaśnie i obróć zarówno stage, jak i uchwyt z powrotem do pozycji 0°, aby włożyć uchwyt do kolumny wysokiego podciśnienia TEM.
10. Upewnij się, że temperatura nigdy nie przekracza -160 °C, aby uniknąć tworzenia się krystalicznego lodu.
11. Napełnij dewar uchwytu kriogenicznego. Odczekaj 15 – 45 minut, aż uchwyt zrównoważy termicznie, a próżnia TEM zostanie przywrócona przed zapisaniem obrazów.
12. W przypadku wykrycia bulgotania ciekłym azotem zmień wysokość napełniania ciekłym azotem lub delikatnie dotknij źródła bulgotania bawełnianym wacikiem.

5. Zbieranie danych o niskiej dawce

UWAGA: Technika zbierania danych o niskiej dawce jest stosowana w celu zminimalizowania uszkodzeń próbki spowodowanych promieniowaniem elektronowym poprzez ograniczenie ekspozycji do 20 elektronów/A². Osiąga się to poprzez naprzemienne korzystanie z trzech konfiguracji: "wyszukiwania", z małym powiększeniem (~5 000X) i szerokim polem widzenia, "ostrości", z dużym powiększeniem (~150 000X) i małym polem widzenia oraz "ekspozycji", z pożądanym powiększeniem końcowym i zawierającym obszar zainteresowania, który ma zostać zarejestrowany. Wygaszaj wiązkę między trybami.

1. Konfiguracja TEM i programu niskiej dawki
   1. Schować żaluzję kriogeniczną i otworzyć zawory kolumny.
   2. Wyśrodkuj scenę i ustaw wysokość eucentryczną (Z) za pomocą woblera alfa, aby rozkołysać scenę ± 15°. Dostosuj pozycję Z, aż nie będzie zauważalnego ruchu, gdy stage się kołysze. Aktywuj program niskiej dawki i wybierz detektor dla każdego trybu.
   3. W trybie ekspozycji znajdź obszar siatki, który nie zawiera węgla, dostosuj oświetlenie, wybierając optymalną przysłonę kondensora i rozmiar plamki, tak aby obszar do nagrania był w pełni oświetlony. Pamiętaj, aby rozłożyć wiązkę w kierunku nadmiernej kondensacji.
   4. W trybie wyszukiwania znajdź małą cechę, którą będzie łatwo zidentyfikować przy większym powiększeniu. W trybie ekspozycji wyśrodkuj tę funkcję za pomocą joysticka (kontroler x-y stage). Rozpocznij od mniejszego powiększenia, jeśli obiekt nie znajduje się w polu view.
   5. W trybie wyszukiwania przenieś tę funkcję na środek pola za pomocą elementów sterujących przesunięciem obrazu x-y o niskiej dawce. Przejdź do trybu ekspozycji i przesuń obiekt wzdłuż osi pochylenia za pomocą joysticka, aż znajdzie się poza obszarem, który ma być nagrywany (0,5 - 3 mikrony). Przejdź do trybu ostrości i wyśrodkuj funkcję za pomocą elementów sterujących przesunięciem obrazu x-y. Rozpocznij od mniejszego powiększenia, jeśli obiekt nie znajduje się w polu view.
   6. Utrzymuj belkę wyśrodkowaną przez cały czas.
2. Gromadzenie danych
   1. Schować żaluzję kriogeniczną i otworzyć zawory kolumny. Aktywuj program niskiej dawki.
   2. W trybie wyszukiwania zidentyfikuj kwadrat siatki zawierający cienki, jednorodny lód.
   3. Wybierz odpowiedni otwór i umieść go na środku pola. Przełącz się w tryb ostrości i ustaw ostrość obrazu. Następnie pod kątem ostrości obrazu w zakresie od 0,5 do 4,5 mikrona.
   4. Przełącz się w tryb ekspozycji i nagraj obraz.
   5. Przełącz się w tryb wyszukiwania i powtórz kroki 5.2.3-5.2.4. Poruszaj się po kwadracie siatki, unikając wstępnego odsłaniania dobrych do nagrania.
   6. Zakończ kwadrat siatki i przejdź do innego dobrego.
   7. Ponownie wyreguluj wysokość (Z) i kontynuuj zbieranie danych.

Wyniki

Staranne wykonanie wszystkich kroków protokołu opisanych na rysunku 1 umożliwia wizualizację zamrożonych, uwodnionych, niebarwionych makromolekuł. Przedstawiono wyniki dla czterech reprezentatywnych próbek o różnych cechach strukturalnych. Porównano ich obrazy mikroskopowe uzyskane metodami NS i cryoEM (ryc. 2). (i) Obrazy NS AAV5 ujawniają cząsteczki wirusopodobne o średnicy około 130 A. Współistnienie pełnych i pustych struktur odpowiada odpowiednio uszkodzonym (które umożliwiają wnikanie plamy) i strukturalnie nienaruszonym kapsydom. CryoEM pokazuje jednolicie puste struktury; Rzeczywiście, te cząsteczki wirusa nie zawierają materiału genetycznego ²⁸. NS pokazuje dominujące cząstki okrągłe, podczas gdy cryoEM pokazuje głównie cząstki sześciokątne, odzwierciedlające ich dwudziestościenną formę. (ii) Obrazy spiralnego TMV pokazują pręty o średnicy 180 A i zmiennej długości, często dłuższe niż 0,1 μm, z powtórzeniem spiralnym 23 A widocznym zarówno w NS, jak i w cryoEM. Kanał centralny o natężeniu 40 A jest wypełniony plamą na obrazach NS i pusty na obrazach krioEM. (iii) Rodzimy KLH, didecamer o średnicy 8 MDa, montowany w charakterystycznych beczkach o średnicy 350 A i długości 400 A. NS i cryoEM odsłaniają prostokątne widoki boczne KLH i okrągłe widoki na końcu. Obie techniki ujawniają sześć prążków prostopadłych do osi symetrii i równomiernie rozmieszczone jednostki morfologiczne w obrębie każdego poziomu. CryoEM odsłania pustą strukturę wewnętrzną. (iv) Receptor Ryanodine, duży tetrameryczny kanał wewnątrzkomórkowy o długości 2,26 MDa, jest widziany jako kwadrat o wymiarach 275 x 275^A2. Skomplikowane cechy powierzchni, takie jak centralny krzyż i centralne zagłębienie, objawiają się akumulacją plam przez NS i obszarami o niższej gęstości przez cryoEM. Podczas gdy NS wykazuje podobny kontrast we wszystkich czterech badanych próbkach, porównanie paneli cryoEM ujawnia niższy SNR (kontrast) RyR1 ze względu na obecność detergentu do rozpuszczania tego białka błonowego.

Typowe przykłady artefaktów cryoEM są pokazane dla RyR1: krystaliczny lód, zanieczyszczenie lodem, astygmatyzm i struktury przypominające pajęczynę (Rysunek 3). Ich przyczyny i zapobieganie są bardziej szczegółowo opisane w sekcji dyskusji.

SPA i rekonstrukcja 3D zamrożonego i uwodnionego RyR1 ujawnia jego czterokrotnie symetryczną strukturę, która odzwierciedla homotetrameryczną organizację białka (Rysunek 4A). Domena cytoplazmatyczna tworzy kwadratowy pryzmat o wymiarach 275 x 275 x 120^A3 i zawiera kilka powtarzalnych domen kulistych tworzących strukturę przypominającą rusztowanie. Domena transbłonowa tworzy mniejszy stożkowy kwadratowy pryzmat o maksymalnych wymiarach 115 x 115 x 60 ų. Przy rozdzielczości 10 A możliwa jest wizualizacja helis alfa (ryc. 4B). Mapowanie różnic 3D może ujawnić położenie ważnych ligandów, w tym przypadku mapa różnic 3D FKBP12, białka o masie 12 kD uważanego za podjednostkę RyR1, jest nakładana na RyR1 (Figura 4C) ²⁹. Wreszcie, zmiany konformacyjne zapewniają dynamiczny widok makrocząsteczki. W tym przypadku RyR1 wcześniej ustabilizowany w warunkach zamkniętych lub otwartych ujawnia masową translokację ze stanu zamkniętego do otwartego (Rysunek 4D) ²⁷.

Rysunek 1. Schemat przepływu techniki kriomikroskopii elektronowej. Na diagramie przedstawiono główne etapy protokołu.

Rysunek 2. Porównanie NS i cryoEM dla różnych próbek. (A) AAV5, wirus dwudziestościenny. (B) TMV, wirus spiralny. Wstawki pokazują powtórzenie spiralne wynoszące 23 A. (C) Rodzimy KLH. d) RyR1; Wyróżnione są widoki reprezentatywne (F, Widok czterokierunkowy i S, Widok z boku). Wszystkie próbki są obrazowane w warunkach niskiej dawki i przy tym samym powiększeniu 50 000X i przy napięciu przyspieszającym 200 kV. Podziałka liniowa, 10 nm. Wszystkie próbki NS znajdują się na nośniku węglowym, próbki krioEM A, C, D znajdują się na cienkim węglu nad folią kwantową, a próbka krioEM B znajduje się bezpośrednio nad otworami kwantowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Galeria zdjęć przedstawiających typowe artefakty krioEM na próbce krioEM RyR1. (A) Lód krystaliczny. (B) Zanieczyszczenie lodem (strzały). (C) Astygmatyzm. RyR1 na obrazie astygmatycznym są ledwo widoczne. Wstawka po prawej stronie pokazuje spektrum mocy obrazu z asymetrycznymi pierścieniami Thon. Wstawka po lewej stronie pokazuje spektrum mocy obrazu bez astygmatu w celach informacyjnych. (D) Struktury sieciopodobne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. CryoEM i rekonstrukcja 3D receptora ryanodine. (A) Reprezentacja izopowierzchni. (B) dokowanie struktury krystalicznej N-końca ³⁰ RyR1 wykazujące dobrą zgodność między współrzędnymi atomowymi a otoczką krioEM; Strzałki wskazują dwie helisy alfa, które wystają z konstrukcji. Grot strzałki wskazuje jedną z czterech helis otaczających pory kanału jonowego. Przerywane linie wskazują granice membrany. (C) RyR1 i lokalizacja 3D liganda FKBP12 (kolor pomarańczowy). (D) Zmiany konformacyjne RyR1 w przechodzeniu od konformacji zamkniętej (pomarańczowej) do otwartej (siatka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

TEM, a następnie SPA, przyczyniły się do powstania wielu makromolekularnych struktur 3D, osiągając liczbę prawie 2000 wpisów w EMDB do połowy 2014 roku. Ogólnie rzecz biorąc, dla danej makrocząsteczki najpierw określa się strukturę 3D o niskiej rozdzielczości na podstawie danych NS, po której może nastąpić struktura 3D cryoEM o wyższej rozdzielczości. Wysoki kontrast granic molekularnych zapewniany przez NS, który ułatwia pierwszą rekonstrukcję 3D, jest później udoskonalany przez cryoEM dzięki zdolności do mapowania wewnętrznej struktury makrocząsteczki w stanie w pełni uwodnionym i możliwości osiągnięcia znacznie wyższej rozdzielczości. Kolejną zaletą cryoEM jest eliminacja stresu odwodnienia, który mógłby spowodować zapadnięcie się makrocząsteczki. Ponadto istnieje możliwość pominięcia nośnika węglowego, co eliminuje możliwe efekty absorpcji powierzchniowej i pokazuje konformację, jaką makrocząsteczka przyjmuje w roztworze. Barwienie krionegatywne, połączenie krioEM i NS, zapewnia wysoki kontrast w całkowicie uwodnionej próbce i może również prowadzić do rekonstrukcji 3D za pomocą SPA, jednak jest rzadziej stosowane, z mniej niż 10 wpisami EMDB, częściowo dlatego, że samo barwienie może zakłócać integralność makrocząsteczki ³¹. Dwie inne techniki TEM sprzyjające rekonstrukcji 3D to krystalografia elektronowa 2D i tomografia elektronowa. Krystalografia elektronowa 2D wymaga kryształu płaskiego lub rurowego; dyfrakcja elektronów kryształu jest wykorzystywana do rekonstrukcji 3D, potencjalnie prowadząc do rozdzielczości atomowej ³². W tomografii elektronowej próbek zeszklonych lub tradycyjnie utrwalonych makrocząsteczka lub składnik subkomórkowy jest obracany wewnątrz TEM w celu późniejszej rekonstrukcji tomograficznej ³³, z tą zaletą, że można zrekonstruować pojedyncze obiekty; jednak obecnie technika ta ma limit rozdzielczości w zakresie od 40 do 20 A ^34,35. Spośród wszystkich tych molekularnych technik TEM, SPA danych NS i krioEM jest najczęściej stosowany. Przedstawiony tutaj protokół jest przeznaczony do uzyskiwania obrazów krioEM odpowiednich do analizy SPA; niemniej jednak większość protokołu ma również zastosowanie do krioEM kryształów 2D i próbek tomograficznych.

Udana sesja krioEM zależy od połączonego sukcesu wielu krytycznych kroków; Ważne aspekty, o których należy pamiętać, wyjaśnienie typowych artefaktów krioEM i sposobów ich unikania opisano w poniższych akapitach. W tej części opisano również wytyczne dotyczące zbierania danych w celu uzyskania wysokiej jakości rekonstrukcji 3D metodą SPA.

Unikaj przejścia do krystalicznego lodu. Kluczowym aspektem jest to, że próbka musi pozostać w stanie szklistym od momentu kriozanurzenia przez cały okres obserwacji TEM. Tak więc po zanurzeniu próbki w ciekłym etanie wszystkie kolejne etapy wykonywane są w temperaturach ciekłego azotu (-196 °C) lub ciekłego helu (-269 °C). Podgrzanie do temperatury powyżej -135 °C przekształca wodę szklistą w wodę krystaliczną; wówczas mogą zachodzić przegrupowania makromolekularne i na obrazie dominują kryształy wody (ryc. 3A); Próbkę należy wyrzucić. Przypadkowe rozgrzanie próbki może nastąpić, jeśli zanurzanie w krioterapii, przenoszenie zamrożonej siatki między pojemnikami (nawet jeśli jest ona zabezpieczona przez kratkę) i/lub wkładanie uchwytu kriogenicznego do TEM są zbyt wolne lub jeśli pęseta do obsługi nie była wystarczająco wstępnie schłodzona. Znaczne pogorszenie próżni w TEM po kriotransferze (zimna próbka zatrzymuje cieplejsze napływające powietrze) może również ogrzać próbkę. Wreszcie, nadmierne napromieniowanie próbki może również spowodować przejście do lodu krystalicznego.

Zminimalizuj zanieczyszczenie lodem. Biorąc pod uwagę małą objętość próbki (3-5 μl) zastosowaną do siatki TEM, parowanie może spowodować koncentrację składników buforowych (sól, detergenty), a tym samym wpłynąć na integralność makromolekularną, w tym utratę stanu multimerycznego. Mikrośrodowisko lub komora o wysokiej wilgotności względnej (RH) pozwala obejść ten problem. Alternatywnie, kriozanurzanie można wykonać w wystarczająco wentylowanej chłodni. Po kriozawgłębieniu wilgotność względna powinna być jak najniższa, aby zapobiec zanieczyszczeniu lodem lub kondensacji wilgoci otoczenia na kriosiacie, ponieważ sama kriosiatka działa jak zimna pułapka. Zanieczyszczenie lodem składa się z cząstek o wysokim kontraście i braku podstruktury, o rozmiarach od ~5 nm do kilku mikronów, które zakłócają lub nawet całkowicie blokują obraz. Unikaj przeciągów powietrza, mówienia/oddychania w kierunku krio-siatki podczas transportu powietrza i zmniejsz wilgotność względną otoczenia. Należy również wyrzucić otwarte pojemniki z ciekłym azotem ze skondensowaną wodą (widoczną jako białe zawieszone cząstki).

Maksymalizuj orientacje/widoki makromolekularne. W przypadku wsparcia próbki należy dokonać wyboru między prawdziwymi dziurawymi siatkami a cienkim węglem zamiast dziurawych siatek. Zależy to od (i) tego, jak próbka rozprzestrzenia się po filmie węglowym w porównaniu z otworami węglowymi, (ii) dostępnego stężenia próbki, ponieważ gołe otwory mogą wymagać stężenia 100 razy wyższego niż nośnik węglowy dla podobnej gęstości cząstek na obrazie (od ~0,02 do 2 μM) oraz (iii) jak losowy jest rozkład orientacji makrocząsteczek. Należy pamiętać, że wyładowanie jarzeniowe, które sprawia, że węgiel jest hydrofilowy, będzie miało ważny wpływ we wszystkich trzech aspektach i że będzie to zależne od próbki. Jeśli chodzi o orientację makrocząsteczki, podczas gdy widok rekurencyjny jest pożądany dla początkowego określenia struktury przez losową rekonstrukcję stożkową, losowość widoków makromolekularnych jest pożądana przy udoskonalaniu rekonstrukcji 3D do wyższych rozdzielczości. W naszym przykładzie RyR1 oddziałuje z węglem w ulubionym "poczwórnym" widoku (rysunek 2D) i wymaga dziurawych siatek dla losowości orientacji i wyższej rozdzielczości ³⁶.

Maksymalizuj SNR. Najlepszą strategią zwiększenia SNR jest zmniejszenie źródeł hałasu w tle. Nadmierna grubość lodu i (jeśli występuje) grubość warstwy węglowej wykraczająca poza to, co jest potrzebne do podtrzymania i osadzenia białka, spowoduje dodatkowy hałas. W związku z tym grubość lodu powinna zostać zmniejszona do niezbędnego minimum, kontrolując czas blottingu, ciśnienie, wilgotność względną i jakość bibuły filtracyjnej. Aby zapewnić wsparcie węglowe, cienka (~5 nm) warstwa węglowa jest nakładana na grubszą dziurawą warstwę węglową: gruby dziurawy węgiel zapewnia odporność mechaniczną, podczas gdy próbka jest obrazowana nad cienkim otworem pokrytym węglem. Z drugiej strony należy pamiętać, że bardzo cienki lód i/lub węgiel mogą powodować łatwe do złamania podparcie, które może przekształcić się w sieć (rysunek 3D). Aby zmaksymalizować SNR, należy unikać wszelkich niepotrzebnych składników bufora. W przypadku białek błonowych detergent ma znaczący wpływ na kontrast (patrz rysunek 2D, prawy panel). Ponadto, zmniejszając napięcie powierzchniowe, detergent zmienia sposób, w jaki próbka rozprowadza się na podłożu. Niektóre białka błonowe wymagają obecności lipidów oprócz detergentu, co dodatkowo zmniejsza kontrast. Aby temu zaradzić, próbkę można rozcieńczyć w buforze o niższym stężeniu detergentu i bez lipidów tuż przed kriozanurzeniem ³⁷. Nowe alternatywne detergenty ¹⁶ i zastosowanie nanodysków ³⁸ do stabilizacji składnika domeny transbłonowej wydają się być skutecznymi podejściami do obrazowania białek błonowych za pomocą cryoEM.

Dąż do wysokiej jakości obrazów i przygotuj się do korekcji CTF. Próbki zeszklone wymagają wysokich wartości rozogniskowania, aby wygenerować wystarczający kontrast obrazu (fazy), gdzie CTF, funkcja wiążąca intensywność z częstotliwością, ma kilka przejść zerowych, w którym to momencie nie ma informacji. Podczas gdy korekcja CTF nie jest konieczna w przypadku rekonstrukcji 3D w niskiej rozdzielczości, w przypadku dążenia do wyższej rozdzielczości, aby odzyskać dokładne odwzorowanie obiektu 3D, należy zebrać obrazy o różnych defoci, aby można było wykonać obliczeniową korekcję CTF. Wyznaczanie i korekcja CTF jest zawarta w głównych pakietach oprogramowania SPA ^4-7; Szczegółowe informacje można znaleźć w innym miejscu ³⁹. Aby uzyskać optymalną korekcję CTF, użyj szeregu defoci. Dobrą strategią jest naprzemienne przełączanie między 3-4 wartościami rozmycia. Wartości zależą od wielkości makrocząsteczki (większe rozmiary wymagają mniejszego rozogniskowania), grubości lodu/węgla (cieńsza próbka wymaga mniejszego rozogniskowania) i napięcia (niższe napięcie wymaga mniejszego rozogniskowania). Dla 200 kV dobry początkowy zakres wartości to rozogniskowanie 2,5, 3, 3,5 i 4 μm. CTF manifestuje się jako naprzemienne pierścienie o wysokiej i niskiej intensywności (pierścienie Thona ⁴⁰) w odwrotnej reprezentacji przestrzennej, widmie mocy. Wyświetlenie widma mocy ujawni potencjał rozdzielczości; częstotliwość najszerszego widocznego pierścienia Thona jest najbliższą a priori oszacowaną osiągalną rozdzielczością. Widmo mocy powinno być okresowo sprawdzane, a astygmatyczne (niekołowe) pierścienie Thon (ryc. 3C) powinny być korygowane za pomocą obiektywnego stygmatora. Pierścienie Thon powinny być widoczne co najmniej do pożądanej rozdzielczości.

Zestaw danych cryoEM uzyskany przy użyciu tego protokołu może być bezpośrednio przetworzony przez SPA w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D. Nawet w przypadku idealnej próbki jakość rekonstrukcji 3D będzie zależeć od wydajności i specyfikacji sprzętu TEM oraz od przetwarzania obrazu. Dzięki ciągłym ulepszeniom na obu tych frontach, a także ze szczególnym uwzględnieniem niedawno opracowanych bezpośrednich detektorów elektronów, możliwość uzyskania rekonstrukcji 3D w rozdzielczości atomowej w sposób bardziej spójny jest bliższa niż kiedykolwiek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Etan	Airgas	371745	czystość 99,99% bardzo ważne, zanieczyszczenia mogą prowadzić do zanieczyszczeń o wysokim kontraście na siatce. UWAGA: łatwopalny
ciekły azot	Airgas	27135	o czystości 99%. UWAGA: obchodzenie się z ciekłym azotem w chłodni stwarza poważne zagrożenie uduszeniem, ponieważ azot wypiera tlen bez żadnych znaków ostrzegawczych.
Dumont no. 5 Pęseta antymagnetyczna	Ted Pella	5326
Arkusze miki, 1 x 4 cm	Ted Pella	54
Pręty grafitowe, wstępnie naostrzone rozmiar 1/8" średnica x 2 i frac14; ” długa końcówka 0,039" średnica szyjki typ	Mikroskopia elektronowa Nauki	70220-45
350 ml cryo-dewars	Pope	8600
Cu 400 siatki otworowe siatki  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
Cu 400 siatki otworowe C-Flat	Protochips	CF-1.2 / 1.3-4C
Urządzenie do wyładowań jarzeniowych	Mikroskopia elektronowa Nauki	Model E7620
Przepompownia turbo	Gatan	Model 655
Parownik węglowy	Denton Vaccum	Model 502B
Tłok zamrażający	FEI	Vitrobot Mark IV
200 kV	FEI	Model Tecnai F20
CCD Kamera 4k x 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu CTFFIND3/CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
oprogramowanie do wizualizacji 3D Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyjanin	Biosyn