Artykuł metodologiczny

Strategie przygotowania próbek do obrazowania spektrometrią mas modeli 3D kultur komórkowych

19.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52313

⸱

5 grudnia 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 2Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Unieśmiertelnione linie komórek rakowych mogą być hodowane jako hodowle komórek 3D, co jest cennym modelem dla badań biologicznych. Protokół ten opisuje obrazowanie hodowli komórkowych 3D za pomocą spektrometrii mas, w tym ulepszenia platformy przygotowania próbek. Celem tego protokołu jest poinstruowanie użytkowników, jak przygotować hodowle komórek 3D do analizy obrazowania metodą spektrometrii mas.

Streszczenie

Trójwymiarowe hodowle komórkowe są atrakcyjnymi modelami do badań biologicznych. Łączą one elastyczność i opłacalność hodowli komórkowej z pewną złożonością przestrzenną i molekularną tkanki. Na przykład wiele linii komórkowych tworzy struktury 3D w odpowiednich warunkach in vitro. Linie komórkowe raka jelita grubego tworzą sferoidy hodowli komórkowych 3D, naśladujące in vitro jałowe guzki guza. Podczas gdy immunohistochemia i inne klasyczne metody obrazowania są popularne w monitorowaniu dystrybucji określonych analitów, obrazowanie spektrometryczne mas bada rozkład klas cząsteczek w sposób bezstronny. Podczas gdy obrazowanie spektrometryczne mas MALDI zostało pierwotnie opracowane do badania próbek uzyskanych z modeli ludzkich lub zwierzęcych, niniejszy raport opisuje analizę trójwymiarowych hodowli komórkowych in vitro, w tym ulepszenia w strategiach przygotowywania próbek. W niniejszym dokumencie opisano metody wzrostu, zbioru, cięcia, mycia i analizy kultur komórkowych 3D za pomocą obrazowania z matrycową desorpcją/jonizacją i spektrometrią mas (MALDI-MS). Wykorzystując hodowle komórek 3D raka jelita grubego jako system modelowy, protokół ten demonstruje zdolność do monitorowania analitów w sposób bezstronny w całym systemie hodowli komórkowych 3D za pomocą MALDI-MSI.

Wprowadzenie

Obrazowanie spektrometrii mas (MSI) to potężna technika do badania rozkładu gatunków molekularnych w próbkach będących przedmiotem zainteresowania. Za pomocą tej techniki naukowcy zobrazowali próbki biologiczne od całych zwierząt aż po pojedyncze komórki. 1–4 Korzystając z MSI, można obrazować setki analitów w tym samym czasie, zamiast technik z pojedynczym substratem wymagających opracowania dodatkowych fluoroforów do tradycyjnej mikroskopii konfokalnej lub barwienia do histologii. 5–7 Ponadto MSI może być stosowany w sposób ukierunkowany lub oparty na odkryciach, co czyni go atrakcyjnym podejściem do badania nakładania się rozmieszczenia związków chemicznych. Przedstawiono metody wzrostu, przygotowania i obrazowania metodą jonizacji/desorpcji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI) małych próbek (o średnicy ~1 mm) trójwymiarowych wielokomórkowych kultur komórkowych. 8–11

3D hodowle komórkowe są szczególnie interesujące dla społeczności biologicznej jako pośrednik między tradycyjną hodowlą jednowarstwową a nowotworami in vivo. Jak sama nazwa wskazuje, hodowle komórkowe 3D są niejednorodnymi agregatami komórkowymi, które zawierają wiele gradientów chemicznych w mikrośrodowisku obserwowanych w małych beznaczyniowych guzkach guza, co czyni je bardziej realistycznym systemem modelowym dla natywnego środowiska guza niż hodowla jednowarstwowa. 10 Wiele ludzkich linii komórkowych może być hodowanych jako hodowle 3D, w tym linie komórkowe pochodzące z tkanek okrężnicy, piersi, jajnika, prostaty, nerek i płuc. 10 Obrazowanie trójwymiarowych kultur komórkowych wiąże się z nieodłącznymi wyzwaniami, ponieważ są one mniejsze niż wiele próbek powszechnie stosowanych do obrazowania metodą spektrometrii mas i dlatego wymagają starannego przygotowania próbki. 7 Do zalet tych elastycznych systemów modelowych należy jednak niższy koszt oraz szybszy wzrost i czas analizy w porównaniu z modelami zwierzęcymi. W rezultacie, badania obejmujące trójwymiarowe hodowle komórkowe mogą być bardziej przepustowe niż tradycyjne badania na zwierzętach. 12–14

Wszystkie te zalety spowodowały wzrost popularności trójwymiarowych hodowli komórkowych w badaniach biologicznych; istnieje odpowiednia potrzeba opracowania nowych strategii analitycznych w celu zbadania zarówno składu, jak i przestrzennego rozmieszczenia cząsteczek w tych systemach. 12,15–21 Celem pracy jest opisanie adaptacji metod obrazowania metodą spektrometrii mas i przygotowania próbek do trójwymiarowych hodowli komórkowych.

Protokół

1. 3D Hodowla komórkowa i przygotowanie do obrazowania

  1. Hodowla odpowiedniej linii komórkowej, tj. linii komórkowej raka jelita grubego HCT116, w dwuwymiarowej, jednowarstwowej hodowli.
  2. Hoduj komórki HCT 116 w kolbie T-25 z pożywką McCoy's 5A + 10% płodowej surowicy bydlęcej w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 do 50-70%, co zwykle trwa kilka dni.
  3. Uwolnij komórki za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i policz część komórek za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym, aby sprawdzić gęstość i żywotność komórek.
  4. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki kompletną pożywką, aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu 6 000 komórek/dołek lub 30 000 komórek/ml.

2. Przygotuj 96-dołkowe płytki pokryte agarozą

  1. Dodać 0,19 g agarozy do 10 ml wzorcowej pożywki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (1,5% roztwór agarozy w pożywce) 10. Zapewnić mieszanie przez delikatne mieszanie. Autoklawować agarozę w łaźni wodnej przez 20 minut.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej odessać 50 μl mieszaniny agaroza + pożywka do 60 środkowych dołków płaskodennej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Ponieważ studzienki na obwodowych krawędziach płytki mają nieco większą szybkość parowania, dodaj 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zamiast agarozy do tych krawędzi
    3. .
  3. Po dodaniu mieszaniny agarozy do studzienek wewnętrznych, przed dodaniem komórek należy odłożyć płytkę do ostygnięcia do temperatury ~37 °C.

3. Zasiewaj i pielęgnuj trójwymiarową kulturę

UWAGA: Można zasiać więcej lub mniej komórek w zależności od wymagań danej hodowli, ale ustalono, że te warunki skutkują powstawaniem struktur hodowli komórkowych 3D o średnicy około 1 mm po 10-14 dniach hodowli (dane nie pokazane).

  1. Dodać 200 μl odpowiedniego roztworu komórkowego (rozcieńczonego tak, aby zawierał ~6 000 komórek) do pokrytej agarozą płytki 96-dołkowej. Przykryć płytkę i umieścić w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C w celu wzrostu komórek.
  2. Zmieniaj nośnik komórkowy co najmniej co 48 godzin lub gdy wydaje się, że nośnik zmienia kolor.
    1. Zmień pożywkę, ostrożnie odsysając stare pożywki z okolic małej hodowli komórkowej 3D (widocznej gołym okiem w 2 dniu) na dnie agarozy. Delikatnie dodaj 200 μl świeżej pożywki na hodowlę komórkową 3D.
    2. (Krok opcjonalny) Podczas tych zmian pożywki dodaj chemioterapeutyki lub inne leki do testów. Rozcieńczyć wybrany lek do końcowego stężenia kompletnymi pożywkami i dodać wymagane 200 μl do każdego dołka.
    3. Monitoruj wzrost kultur komórkowych 3D za pomocą mikroskopu optycznego, aż kultury komórkowe 3D osiągną średnicę około 1 mm.

4. Zbieranie kultur komórkowych 3D

  1. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml delikatnie usunąć kulturę komórkową 3D ze złoża agarozy.
  2. Przemyć 3D kultury komórkowe PBS, delikatnie pipetując je do około 1 ml PBS na 24-dołkowej płytce.
  3. Przenieś zebrane kultury komórkowe 3D za pomocą pipety serologicznej do probówek wirówkowych w celu ekstrakcji białek lub metabolitów lub umieść je w podłożu tnącym, aby pomóc w krojeniu do zastosowań obrazowych.

5. Osadź hodowle komórkowe 3D w żelatynie

  1. Przygotować roztwór ~175 mg/ml żelatyny w wodzie o wysokiej czystości (preferowane 18 MΩ). 22,23 Żelatynę energicznie wymieszać. Obserwuj, jak roztwór staje się lepki i trudny do manipulowania. Umieścić stożkową probówkę zawierającą żelatynę w łaźni wodnej o temperaturze ~60 °C i ogrzewać, aż roztwór stanie się klarowny i łatwy do przyswojenia.
    UWAGA: Ciepły roztwór żelatyny szybko twardnieje w miarę stygnięcia, dlatego przed zamrożeniem szybko wykonaj wszystkie poniższe czynności.
  2. Po podgrzaniu należy natychmiast zanieść żelatynę do okapu do hodowli komórkowych. Probówkę z żelatyną przechowywać w zlewce z wodą podgrzaną do około 60 °C, aby uniknąć stwardnienia roztworu żelatyny.
  3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml wlać 0,6 ml ciepłego roztworu żelatyny do dołka na płaskodennej płytce o 24 rozmiarach. Ta objętość jest wystarczająca, aby pokryć dno cienką warstwą. Delikatnie umieść hodowle komórkowe 3D bezpośrednio na warstwie żelatyny za pomocą innej pipety o pojemności 2 ml, aby uniknąć pęknięcia struktury 3D.
    UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby nie umieszczać PBS w żelatynie. Jeśli jednak tak się stanie, usuń PBS z wierzchu żelatyny za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  4. Po umieszczeniu kultur komórkowych 3D na powierzchni warstwy żelatyny, ostrożnie odpipetować kolejne 0,6 ml ciepłej mieszaniny żelatyny na hodowle komórkowe 3D, aby nie zakłócić położenia kultur. Po nałożeniu drugiej warstwy zamrozić zatopione w żelatynie kultury komórkowe 3D w temperaturze -80 °C.

6. Plastrowanie i rozmrażanie Zamontuj zatopione w żelatynie hodowle komórkowe 3D do obrazowania metodą spektrometrii mas

  1. Wyjąć z zamrażarki płytkę 24-dołkową zawierającą 3D kultury komórkowe. Ogrzej dno talerza ciepłem z dłoni, aż pęseta lub skalpel delikatnie zsunie się po ścianie studni.
  2. Płynnie przesuwaj pęsetę lub skalpel, uwalniając żelatynę bez rozmrażania środka. Weź kroplę wody do wspornika kriostatu i użyj jej, aby przykleić krążek żelatyny do podpory.
    1. Hodowle komórkowe 3D zanurzone w żelatynie są najbardziej podatne na krojenie w temperaturze -30 °C. Przed użyciem wyczyść ostrze kriostatu i szkło 70% etanolem. Użyj innej części ostrza lub nowego ostrza dla każdego krążka 3D z żelatyną do hodowli komórek, aby zapobiec stępieniu ostrza.
  3. Za pomocą kriostatu delikatnie zlicuj nadmiar żelatyny, aż kultury komórkowe 3D staną się widoczne.
  4. W tym momencie powoli pokrój kultury komórkowe 3D płynnym ruchem na odcinki 12-16 μm.
    UWAGA: Czynniki krytyczne dla krojenia obejmują odległość szkła od ostrza, kąt ostrza, temperaturę kriostatu i kąt dysku na wsporniku, więc wszystkie te czynniki należy sprawdzić, aby zapewnić spójne wyniki.
  5. Ostrożnie rozmrozić plastry i umieścić je na szkiełkach pokrytych tlenkiem indu tytanu (ITO), odpowiednio oznaczonych i przechowywać w eksykatorze. Użyj plastrów tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać maksymalną jakość.

7. Aplikacja matrycy i przygotowanie próbki do obrazowania MALDI

  1. Przed obrazowaniem MALDI należy przygotować plastry z odpowiednią matrycą.
    1. W przypadku analizy małych cząsteczek na ogół nie są wymagane żadne etapy mycia. Aby wykryć nienaruszone białko, umyj plastry w zimnym 100% acetonie, płynie Carnoya lub 70%/95% izopropanolu, aby usunąć małe cząsteczki, takie jak lipidy, które mogłyby maskować sygnał. 24–26
    2. Delikatnie pierz nie dłużej niż 30 sekund na raz. Nie naruszaj żadnych plastrów.
  2. Przygotować matrycę w roztworze rozpuszczalnika organicznego i wody z 0,1% TFA. W przypadku małych cząsteczek, takich jak kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA), użyj 60% ACN:40% H2O:0,1% TFA (10 mg / ml). Do wykrywania białek, takich jak kwas synapinowy (30 mg/ml), należy użyć tego samego roztworu rozpuszczalnika. W celu uzyskania optymalnej rozpuszczalności kwasu synapinowego, należy go najpierw rozpuścić w acetonitrylu przed dodaniem roztworu TFA:H2O. W razie potrzeby można stosować inne matryce.
    UWAGA: Matrycę można nakładać kilkoma różnymi metodami, ale należy zauważyć, że stwierdzono, że niektóre matryce krystalizują z żelatyną, takie jak kwas ferulowy, co sprawia, że próbka staje się bezużyteczna. Mniejsze kryształy wytwarzają bardziej spójne widma masowe, co pozwala na wykrycie większej liczby gatunków molekularnych i przypisanie ich różnicom biologicznym, a nie efektom matrycy.
  3. Nakładaj matrycę metodą handspotting.
    1. Za pomocą strzykawki z cienką końcówką nanieść 0,5 μl roztworu matrycy na wycinek kultury komórkowej 3D i pozostawić matrycę do krystalizacji.
  4. Alternatywnie użyj metody aerografu. Napełnij komercyjny aerograf roztworem matrycy.
    1. Trzymaj opryskiwacz w odległości 8-12 cali od szkiełka, skieruj drobny spray na plasterek. Pomiędzy przejściami pozostaw matrycę do wyschnięcia na 1 minutę, aby umożliwić najlepsze tworzenie się kryształów. Do wytworzenia optymalnej warstwy matrycy22 wymagane jest do 10-20 przejść aerografu.
  5. Alternatywnie użyj metody sublimacji opisanej w innym miejscu. Pytania z dnia 25,27
    6. na drugi guzik
  6. Suszyć szkiełka w eksykatorze przez co najmniej 30 minut przed zastosowaniem MALDI-MSI, niezależnie od metody aplikacji matrycy. 25

8. Analiza MALDI-MSI przy użyciu systemu MALDI-TOF (np. AutoFlex III)

UWAGA: Ta sekcja zawiera instrukcje i porady dotyczące ustawiania parametrów dla eksperymentu obrazowania MALDI-TOF. W zależności od producenta urządzenia i używanego oprogramowania proces ten może się różnić.

  1. Zamontuj szkiełka w adapterze wykonanym w celu bezpiecznego trzymania szkiełek o wymiarach 75 mm x 25 mm, aby zobrazować wycinki 3D hodowli komórkowych przymocowane do szkiełek z powłoką ITO. Załaduj adapter suwakowy do instrumentu.
  2. Przygotować przyrząd do MALDI-MSI, wybierając odpowiedni wzorzec kalibracyjny dla danego zakresu masy. Do badania małych cząsteczek wykryte sygnały, które odpowiadają zastosowanej matrycy, α-CHCA, są jedną powszechną grupą kalibrów. Do analizy białek wybiera się znane wzorce białek (tj. ubikwitynę, trypsynogen) w zakresie masowym będącym przedmiotem zainteresowania i umieszcza się je w sąsiedztwie kultur komórkowych 3D jako kalibranty. Skalibruj przyrząd przed przystąpieniem do opracowywania metody.
  3. Przed przystąpieniem do obrazowania należy opracować metody pozyskiwania danych dla wybranego zakresu masy, korzystając z oprogramowania dostarczonego przez producenta urządzenia. Na rysunkach 1 i 2 przedstawiono obrazowanie małych cząsteczek i białek. W przypadku obrazowania małych cząsteczek należy użyć trybu reflektronu, aby uzyskać najwyższą rozdzielczość masy.
    1. Dostosuj zakres mas dla akwizycji danych o małych cząsteczkach w zakresie 100-1 000 m/z i dla białek w zakresie 8 000-25 000 m/z. Dostosuj zakres masy, aby objąć wybrany obszar, zapewniając jednocześnie najwyższą możliwą rozdzielczość masy dla instrumentu.
    2. Dostosuj moc lasera, częstotliwość, liczbę strzałów laserowych i rozmiar plamki za pomocą roztworu kalibracyjnego i pobliskiego "ofiarnego" wycinka hodowli komórkowej 3D. Przestrzegać tych ustawień w głównym oprogramowaniu sterującym instrumentem. Jako zalecany punkt wyjścia użyj następujących ustawień: 60% mocy, 400 strzałów laserowych, bardzo mały rozmiar plamki. Ustawienia te będą się różnić w zależności od instrumentów i metod, więc zoptymalizuj parametry instrumentu, aby uzyskać najwyższą jakość widm dla każdego konkretnego instrumentu. Inne parametry, które można regulować, to wzmocnienie detektora, częstotliwość próbkowania i wzmocnienie elektroniczne. Zapisz tę metodę do użycia w oprogramowaniu do obrazowania (tj. metodę AutoExecute, z której będzie korzystać FlexImaging).
      UWAGA: Tłumić jony poniżej zakresu masy zainteresowania (ponownie znajdującego się w sterowaniu instrumentem), aby nie zakłócać wykrywania.
    3. Opracowanie metod pozyskiwania danych o białkach dla wybranego zakresu masy. Wykonaj te same czynności, które opisano powyżej, ale dla średnich i wysokich zakresów mas, powyżej około 3 kDa, użyj trybu liniowego.
      UWAGA: Ustawienia będą się różnić od tych używanych w przypadku metod małocząsteczkowych.
  4. Ustaw określone parametry instrumentu MS za pomocą oprogramowania do obrazowania dostarczonego przez producenta urządzenia, takiego jak FlexImaging dla systemów Bruker MALDI-TOF.
    1. Utwórz nowy plik i folder obrazowania, korzystając z metod opracowanych wcześniej i zapisanych. Wybierz parametry urządzenia, takie jak rozmiar plamki rastrowej (zmiana z domyślnej około 200 μm na 50 μm), skonfiguruj metodę sterowania instrumentem (konfiguracja w kroku 8.3.2 lub 8.3.3) i pozycję, w której chcesz zeskanować hodowlę komórkową 3D.
    2. Wybierz trzy odpowiednie punkty uczenia na próbce, przesuwając laser do każdego z nich po kolei. Uzyskaj zdjęcie optyczne z oprogramowania sterującego laserem MALDI-TOF za pomocą 'print screen'.
      UWAGA: Wiele programów do obrazowania wymaga optycznego zdjęcia próbki, aby "nauczyć" oprogramowanie, gdzie znajduje się laser, co można uzyskać za pomocą skanera lub często kamery instrumentalnej.
  5. Następnie rozpocznij proces obrazowania z poziomu oprogramowania do obrazowania (nie sterownika instrumentu) i uzyskaj widma masy z każdego wycinka. Obserwuj większość mas w kulturze komórkowej 3D i inne zlokalizowane w określonych obszarach.

9. Opcjonalne metody analizy danych

  1. W celu ukierunkowanej analizy należy przeprowadzić ręczną analizę widm, klikając masę w średnim widmie lub zezwolić oprogramowaniu do obrazowania na automatyczne wybieranie mas powyżej określonego progu (np. pików powyżej górnego progu 20%). W celu kontroli jakości należy zbadać rozkład pików matrycy lub średnie widmo.
  2. Wykonuj analizy statystyczne na podstawie wyodrębnionych zestawów danych w oprogramowaniu matematycznym, takim jak R lub Matlab.
    1. Eksportuj pojedyncze widma w formacie ASCII, czytelnym pliku tekstowym, w celu załadowania do wybranego oprogramowania.
    2. Konwertuj poszczególne widma na ASCII, mzXML, w formacie mzML do odczytu przez kilka różnych programów,28–31 lub eksportuj dane jako plik w formacie Analyze (.img), który jest powszechnie używany w innych zastosowaniach do obrazowania, takich jak MRI. 32 Dwie otwarte opcje analizy to MSiReader i BioMap32,33.
    3. Po wyeksportowaniu plików do formatu możliwego do odczytania przez oprogramowanie, należy załadować zestaw danych, postępując zgodnie z instrukcjami w odpowiednim oprogramowaniu. Po załadowaniu wykonaj przetwarzanie po akwizycji, takie jak usuwanie i normalizacja linii bazowej.
    4. Za pomocą tego zestawu danych można wykonywać zabiegi statystyczne, takie jak analiza głównych składowych hierarchicznego grupowania przy użyciu niestandardowych skryptów lub wbudowanych algorytmów w oprogramowaniu, takim jak Matlab18.

Wyniki

Obrazowanie MSI ma potencjał do ujawniania wielu różnych rozkładów molekularnych w 3D kulturach komórkowych. Stosując opisaną powyżej metodę, można śledzić w kulturze cząsteczki o różnej wielkości – od małych cząsteczek (Rysunek 1) po duże białka (Rysunek 2). Przedstawione wyniki obrazują wizualizację pojedynczego jonu z wykorzystaniem darmowego narzędzia MSiReader.32 Wyniki dla wybranych pojedynczych jonów w 3D kulturze komórkowej można analizować za pomocą oprogramowania do wizualizacji, zarówno w obrębie wyznaczonego obszaru zainteresowania, jak i w całym zeskanowanym regionie. Dodatkowo większość programów automatycznie wizualizuje jony powyżej określonego przez użytkownika progu, co może wspomóc procesy odkrywcze. Po uzyskaniu map pojedynczych jonów, większość oprogramowania umożliwia nakładanie na siebie obrazów w celu analizy kolokalizacji jonów. Zarówno w podejściach opartych na odkryciach, jak i w badaniach ukierunkowanych, obrazowanie spektrometrią mas jest potężnym narzędziem do analizy 3D kultur komórkowych.

Wzrost drobnoustrojów na płytkach agarowych w skali 100 µm, obraz mikroskopowy do badań biologicznych.
Rycina 1. Reprezentatywne wyniki wzrostu i sekcjonowania 3D hodowli komórkowej. Po lewej) Obraz optyczny nienaruszonej struktury 3D hodowli komórek jelita grubego HCT-116 w 14. dniu przed zbiorem. Po prawej) Obraz optyczny przybliżonego przekroju równikowego rozmrożonej 3D hodowli komórek jelita grubego osadzonej na szkiełku pokrytym ITO w celu obrazowania. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dane spektrometrii masowej; wykres m/z i diagramy map ciepła; analiza rozkładu jonów.
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki MALDI-MSI małych cząsteczek w przekroju równikowym 3D hodowli komórkowej. Góra) Średnie widma mas uzyskiwane z użyciem α-CHCA w zakresie niskich mas (małe cząsteczki). Dół) Reprezentatywne obrazy pojedynczych mas: 327,8 m/z zlokalizowane głównie we wnętrzu 3D hodowli komórkowej oraz 429,7 m/z zlokalizowane głównie na krawędzi 3D hodowli komórkowej. Linia przerywana wskazuje przybliżoną krawędź sferoidu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza danych spektrometrii mas z wykresami m/z; mapy ciepła pokazują rozkład jonów.
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki obrazowania białek metodą MALDI-MSI w przekroju równikowym trójwymiarowej hodowli komórkowej. Góra) Średnie widma mas uzyskane z zastosowaniem kwasu sinapowego w wyższym zakresie mas (białek). Dół) Reprezentatywne obrazy dla pojedynczych mas: 10 871 m/z zlokalizowane głównie na krawędzi sferoidu oraz 12 184 m/z zlokalizowane bardziej wewnątrz sferoidu. Linia przerywana oznacza przybliżoną krawędź sferoidu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Korzystając z metod opisanych powyżej, hodowle komórkowe 3D mogą być hodowane i analizowane za pomocą MALDI-MSI. Wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych utworzy struktury 3D, jeśli zostaną odpowiednio wyhodowane. 9,10 Należy zachować ostrożność, aby hodować komórki, które nie były przepuszczane zbyt wiele razy, to znaczy mają niską liczbę pasaży. Ogólnie rzecz biorąc, komórki o liczbie pasaży wynoszącej dziesięć i mniej są optymalne do hodowli komórek 3D. Hodowla komórek 3D w tradycyjnym podłożu agarozowym stanowi opłacalny sposób dla grup badawczych zainteresowanych hodowlą komórkową 3D na wypróbowanie tego systemu. Metoda ta wykorzystuje kilka składników, które nie są jeszcze dostępne w większości laboratoriów hodowli komórek ssaków. Należy zwrócić szczególną uwagę na przygotowanie płytek agarozowych do wzrostu, tak aby hodowle komórkowe 3D były spójne pod względem wielkości i kształtu; Niektóre aspekty, które wymagają szczególnej uwagi, obejmują sprawdzenie, czy żadne pęcherzyki powietrza nie są uwięzione w mieszaninie i czy na dnie każdej studzienki tworzy się odpowiedni menisk. Jeśli łąkotka nie tworzy się prawidłowo, komórki mogą rosnąć w kształtach niesferoidalnych lub w małych kępkach. Należy również uważać, aby nie umieszczać PBS w żelatynie ze sferoidami. W takim przypadku należy usunąć PBS z górnej części żelatyny za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Jeśli koszt nie jest czynnikiem, na rynku dostępne są płyty o bardzo niskim poziomie wiązania z okrągłym dnem, które upraszczają te etapy. Podczas gdy inne metody osadzania tkanek mogą być również kosztowne i niekompatybilne ze spektrometrią mas, wykazano, że zatapianie w żelatynie jest zarówno niedrogie, jak i wszechstronne. Opisane powyżej strategie przygotowania zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli komórkowych 3D w celu uzyskania danych najwyższej jakości. Chociaż wykazano, że zatapianie żelatyny jest kompatybilne z analizą spektrometrii mas, proces ten zawęża dostępne matryce ze względu na kokrystalizację. Po zamrożeniu kultury komórkowe 3D są stabilne przez wiele miesięcy, o ile nie zostaną zamrożone i rozmrożone. Żelatyna staje się nieprzezroczysta po zamrożeniu, a hodowle komórkowe 3D mają podobny kolor, dlatego przed zamrożeniem zaleca się udokumentowanie umieszczenia hodowli komórkowej 3D, aby pomóc w krojeniu.

Podczas przygotowywania szkiełek matrycę można nakładać kilkoma różnymi metodami, ale należy zauważyć, że stwierdzono, że niektóre matryce krystalizują razem z żelatyną, takie jak kwas ferulowy, co sprawia, że próbka nie nadaje się do użytku. Kryształy o mniejszej matrycy wytwarzają bardziej spójne widma masowe. Podczas gdy ręczne nakrapianie jest najprostszą metodą aplikacji matrycy, większa objętość rozpuszczalnika może skutkować większymi rozmiarami kryształów i znaczną migracją analitu.

W dziedzinie spektrometru mas postęp w technologiach MALDI-MSI ograniczył wiedzę specjalistyczną niezbędną do rozpoczęcia analiz. Akwizycja i analiza danych jest prosta w większości systemów, dzięki czemu nawet nowicjusz może uzyskać wysokiej jakości informacje ze slajdów pokrytych powłoką ITO. Staranny dobór parametrów urządzenia, zoptymalizowanych pod kątem pobliskich kultur komórkowych 3D, które nie są warte obrazu, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych. Na przykład zwiększenie mocy lasera może zwiększyć intensywność szczytu, ale zmniejszenie mocy lasera może poprawić rozdzielczość i nadać bardziej symetryczne kształty pików. Hodowle komórkowe 3D powinny być używane szybko po pokrojeniu, aby zapewnić optymalną jakość próbki. Degradację sygnału białkowego można zaobserwować w czasie krótszym niż tydzień bez odpowiedniego przechowywania (eksykator / zamrażarka w temperaturze -80 °C), szczególnie w obszarze o dużej masie (powyżej 20 kDa). Ze względu na rosnące zapotrzebowanie opracowano wiele różnych programów do wizualizacji, które są bezpłatne dla ogółu badaczy. Większość obrazujących spektrometrów masowych ma zainstalowane oprogramowanie niezbędne do wizualizacji pojedynczych mas za pomocą zastrzeżonych formatów używanych w każdym instrumencie. Programy te mogą być używane do uzyskiwania pojedynczych obrazów masowych i eksportowania danych. Większość programów pozwala również na nakładanie dwóch lub więcej mas zainteresowania. Ponadto wiele różnych przeglądarek danych MSI można pobrać bezpłatnie, takich jak MSiReader i BioMap. 32,33 Uzyskane dane ze spektrometrii mas mogą być również z łatwością przetwarzane po ich uzyskaniu, co pozwala uzyskać bardziej użyteczne informacje.

Od farmaceutyków, przez lipidy, po białka, opisany powyżej system pozwala na szybkie pozyskiwanie danych w celu oceny rozmieszczenia interesujących cząsteczek w strukturze hodowli komórkowej 3D. Sekcje szeregowe można wykonać w celu zobrazowania całej struktury 3D, budując z każdego obrazu 2D wycinek hodowli komórkowej 3D. Techniki i uwagi zawarte w protokole będą przydatne dla badaczy chcących rozpocząć trójwymiarową hodowlę komórkową jako pomost między hodowlą jednowarstwową a modelami zwierzęcymi. Po opanowaniu techniki te można zastosować do wielu rodzajów kultur komórkowych 3D, tkanek i kultur komórkowych, umożliwiając naukowcom obrazowanie dowolnych próbek, które wybiorą.

Oświadczenia

Ten artykuł jest częścią specjalnego wydania na temat multimodalnego obrazowania przedklinicznego, sponsorowanego przez Bruker Biospin. System MALDI-TOF używany do uzyskania reprezentatywnych wyników to Bruker AutoFlex III.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Walther Cancer Foundation w ramach programu Advancing Basic Cancer Research dla Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) oraz 2011 Starter Grant od Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Podziękowania należą się również pracownikom Zakładu Spektrometrii Mas i Proteomiki za przydatne dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HCT116 Linia komórkowaATCCATCC CCL-247Potencjalne zagrożenie, należy obchodzić się z
nim ostrożnie Pożywka McCoy's 5AGibco16600-108
Płodowa surowica bydlęcaHyCloneSH30071.03
0.25% roztwór trypsyny-EDTAGibco25200-056
AgarozaSigma-AldrichA9539
Fosforan Buforowana sól fizjologicznaGibco10010049
Żelatyna, bezsmakowaKnoxDostępne w większości sklepów spożywczych w pojedynczych opakowaniach
Szkiełka szklane z powłoką ITODelta Technologies, LimitedCG-90IN-S115
&alfa;-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA) Sigma-AldrichC8982
Kwas sinapowySigma-Aldrich85429
0,3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Paint Zestaw pistoletów natryskowychRoyalMax AirbrushWiele opcji dostępnych na stronach takich jak Amazon.com

Bibliografia

  1. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  2. Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).
  3. Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a, Caprioli, R. M. Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).
  4. Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry. Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).
  5. Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).
  6. Guenther, S., et al. Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).
  7. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).
  8. Kunz-Schughart, L. a, Kreutz, M., Knuechel, R. Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology. Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).
  9. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  10. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  13. Fernandes, T. G., Kwon, S. -J., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  14. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  15. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
  16. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  17. Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry. Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).
  18. Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections. Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).
  19. Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PloS one. 6 (5), 18940(2011).
  20. Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. aL. Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology. J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).
  21. He, W., Kuang, Y., et al. Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).
  22. Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).
  23. DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).
  24. Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).
  26. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  27. Gemperline, E., Li, L. MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules. J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).
  28. Deutsch, E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output). Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).
  29. Pedrioli, P. G. a, Eng, J. K., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  30. Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. What is mzXML good for. Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).
  31. Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -J., Binz, P. -A. Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).
  32. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a, Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  33. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction. Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom rekMALDI MSIzatapianie w elatynieci cie w kriosztacierak jelita grubegokom rki HCT116aplikacja matrycyanaliza spektralna
Strategie przygotowania próbek do obrazowania spektrometrią mas modeli 3D kultur komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.