Artykuł metodologiczny

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

DOI:

10.3791/52333

⸱

17 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczne protokoły różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnych tkanek w połączeniu z technologiami -omicznymi otworzyły nowe horyzonty dla badań toksyczności in vitro potencjalnych leków. Aby zapewnić solidną podstawę naukową dla takich testów, ważne będzie uzyskanie informacji ilościowych na temat przebiegu rozwoju w czasie oraz na temat mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw podejść opartych na biologii systemowej. W związku z tym dwa testy zostały tutaj dostrojone do tych wymagań. W systemie testowym UKK ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) (lub inne komórki pluripotencjalne) pozostawia się do spontanicznego różnicowania przez 14 dni w ciałach zarodkowych, aby umożliwić wytworzenie komórek wszystkich trzech listków rozrodczych. System ten podsumowuje kluczowe etapy wczesnego rozwoju embrionalnego człowieka i może przewidzieć specyficzną dla człowieka wczesną toksyczność/teratogenność embrionalną, jeśli komórki są narażone na działanie substancji chemicznych podczas różnicowania. System testowy UKN1 opiera się na różnicowaniu hESC do populacji komórek progenitorowych neuroektodermalnych (NEP) przez 6 dni. System ten podsumowuje wczesny rozwój neuronalny i przewiduje wczesną neurotoksyczność rozwojową oraz zmiany epigenetyczne wywołane przez substancje chemiczne. Oba systemy, w połączeniu z badaniami mikromacierzy transkryptomowych, są odpowiednie do identyfikacji biomarkerów toksyczności. Co więcej, mogą być one wykorzystywane w połączeniu do generowania danych wejściowych do analizy biologii systemowej. Te systemy testowe mają przewagę nad tradycyjnymi badaniami toksykologicznymi wymagającymi dużej liczby zwierząt. Systemy testowe mogą przyczynić się do obniżenia kosztów opracowywania leków i oceny bezpieczeństwa chemicznego. Ich połączenie rzuca światło zwłaszcza na związki, które mogą wpływać na rozwój neurologiczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do różnicowania się w różne typy komórek otworzyła nową erę badań toksyczności in vitro 1, modelowania chorób i medycyny regeneracyjnej2. Komórki macierzyste są obdarzone zdolnością do samoreplikacji, utrzymywania stanu pluripotencjalnego i różnicowania się w wyspecjalizowane komórki3,4. Właściwości hESC (zdolność do różnicowania się do wszystkich głównych typów komórek) występują również w innych ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych, takich jak ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) lub komórki powstałe w wyniku transferu jądrowego5. Na przykład wiele różnych linii hESC zostało zróżnicowanych w neurony6, komórki nerkowe7, komórki grzebienia nerwowego8, kardiomiocyty9-12 lub hepatocyty podobne do komórek13,14. Co więcej, hESC może spontanicznie różnicować się w komórki wszystkich trzech listków rozrodczych15-18 w ciałach zarodkowych (EB)19,20. Wczesny rozwój embrionalny jest regulowany przez zróżnicowaną ekspresję różnych genów związanych z różnymi listkami zarodkowymi, która została wychwycona na poziomie mRNA przez transkryptomikę przy użyciu technologii mikromacierzy15. Wysiłki te zaowocowały ustanowieniem specyficznych dla narządu modeli toksykologicznych opartych na analizie hESC/hiPSC i transkryptomicznej (zob. przegląd patrz 21,22). Modele te mają przewagę nad tradycyjnym wykorzystywaniem zwierząt laboratoryjnych do badań toksykologicznych, ponieważ badania przedkliniczne z udziałem zwierząt laboratoryjnych nie zawsze przewidują bezpieczeństwo ludzi. Toksyczność wywołana lekiem występująca u pacjentów jest często związana z procesami metabolicznymi lub sygnalizacyjnymi, które różnią się między ludźmi a zwierzętami doświadczalnymi. Różnice gatunkowe uniemożliwiły wiarygodne wczesne wykrycie toksyczności rozwojowej u ludzi, a na przykład leki takie jak talidomid23,24 i dietylostilbestrol25,26 zostały wycofane z rynku ze względu na teratogenność. Talidomid nie wykazywał żadnej toksyczności rozwojowej u szczurów i myszy. Chemikalia środowiskowe, takie jak metylortęć27, powodowały prenatalną toksyczność rozwojową w odniesieniu do układu nerwowego u różnych gatunków, ale objawy u ludzi były trudne do modelowania u zwierząt. Aby rozwiązać problem specyficzności gatunkowej, naukowcy pracujący w ramach różnych projektów opartych na komórkach macierzystych, takich jak ReProTect, ESNATS, DETECTIVE itp., są zaangażowani w rozwój różnych modeli toksyczności embrionalnej, neurotoksyczności, kardiotoksyczności, hepatotoksyczności i nefrotoksyczności przy użyciu substancji toksycznych dla ludzi, co do których istnieje podejrzenie, że wpływają na ludzi. W ramach projektu europejskiego konsorcjum "Embryonic Stem cell-based Novel Alternative Testing Strategies (ESNATS)" stworzono pięć systemów testowych. Jeden system testowy, tak zwany system testowy UKK (Universitätsklinikum Köln), częściowo rejestruje wczesny rozwój embrionalny człowieka. W tym systemie ludzkie embrionalne komórki H9 są różnicowane w trzech listkach rozrodczych (ektodermie, endodermie i mezodermie)15, a sygnatury specyficzne dla listka rozrodczego zostały wychwycone za pomocą profilu transkryptomicznego przy użyciu platformy mikromacierzy Affymetrix. W tym systemie przetestowano różne toksyczne czynniki rozwojowe, takie jak talidomid28, kwas walproinowy, metylortęć16,17 lub arabinozydcytozyny 15 i uzyskano toksyczne sygnatury genów. W drugim systemie testowym, tak zwanym systemie testowym UKN1 (University of Konstanz) 1, komórki H9 są różnicowane do neuroektodermalnych komórek progenitorowych (NEP) przez 6 dni. Świadczy o tym wysoka ekspresja markerów genów neuronalnych, takich jak PAX6 i OTX2. Podczas różnicowania przez 6 dni komórki NEP były wystawione na działanie neurotoksycznych substancji rozwojowych, takich jak VPA, metylortęć. Specyficzne dla substancji toksycznych zderegulowanych profili transkryptomicznych uzyskano również przy użyciu platformy mikromacierzy Affymetrix16,29.

Nowa wizja toksykologii XXIwieku przewiduje, że systemy testowe nie tylko dostarczają opisów fenotypowych, takich jak histopatologia in vivo, czy zmiany transkryptomu pod koniec długotrwałych inkubacji toksycznych. Sugeruje raczej, że testy dostarczają informacji mechanistycznych3 i że informacje te można odwzorować do tak zwanych ścieżek niepożądanych skutków (AOP), które dostarczają naukowego uzasadnienia dla niebezpiecznych skutków30. Aby dostarczyć takich informacji, stosowane systemy testowe muszą być ściśle kontrolowane pod względem jakości31, co jest na przykład udokumentowane solidnymi standardowymi procedurami operacyjnymi. Co więcej, zmiany zależne od czasu muszą być odwzorowywane z wysoką rozdzielczością. Wymaga to systemów testowych ze zsynchronizowanymi zmianami32. Opisane tutaj systemy testowe UKN1 i UKK zostały zoptymalizowane pod kątem tych wymagań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół został przeprowadzony przy użyciu ludzkiej linii embrionalnych komórek macierzystych (hESC) H9. Ta linia komórkowa była rutynowo hodowana na mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w pożywkach hodowlanych hESC uzupełnionych bFGF, a następnie hodowana w pożywkach z komórek macierzystych na 6-centymetrowych płytkach Petriego pokrytych macierzą błony podstawnej, taką jak matrigel, w celu pozbycia się MEF. Do dalszego pasażu wykorzystano komórki H9 z >80% zlewających się płytek. Do tworzenia EB wykorzystano komórki H9 hodowane na płytkach macierzy błony podstawnej. Wszystkie procedury wymienione w poniższym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu standardowych metod aseptycznych i dobrych praktyk hodowli komórkowych.

Część 1. System testowy UKK

1. Hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

  1. Rozdzielanie i konserwacja H9 na ogniwach zasilających
    1. Odpipetować 2 ml 0,1% żelatyny na każdą płytkę o średnicy 6 cm i inkubować przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5%CO2). Odessać roztwór żelatyny za pomocą sterylnej pipety Pasteura.
    2. Dodać 2 ml pożywki MEF zawierającej 0,1 x 106 komórek MEF/ml do dwóch płytek pokrytych żelatyną i inkubować je w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) O/N.
    3. Następnego dnia wyjąć fiolkę z komórkami H9 ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu za pomocą kleszczy i rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C za pomocą długich kleszczy.
    4. Wyjąć fiolkę z łaźni wodnej, wykąpać ją w 70% etanolu, wysuszyć na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 15 do 30 sekund i przenieść komórki do 15 ml probówki sokoła.
    5. Powoli dodawać 9 ml pożywki H9 na wewnętrzną ściankę i odwirowywać komórki przy 200 x g przez 5 minut.
    6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 6 ml pożywce hodowlanej zawierającej inhibitor ROCK (10 μM, Y27632) i delikatnie pipetować do wymieszania. Odessać pożywkę MEF z płytki o średnicy 6 cm i dodać 3 ml zawiesiny komórek do każdej płytki. Zmieniaj podłoże w 3 dniu, a następnie co drugi dzień. Subkultura >80% zlewających się komórek płytki o stosunku podziału 1:3,
      Uwaga: Zwykle w ciągu 5 do 7 dni płytka staje się zlewna. Stosowane karmniki są pozyskiwane z zarodka myszy CF1 i inaktywowane przez ekspozycję na promieniowanie γ.
  2. Hodowla komórek H9 na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej
    1. Rozmrozić pożywkę z komórkami macierzystymi (5x) w temperaturze pokojowej i dodać 100 ml do 400 ml podłoża podstawowego w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie. Dodać sugerowaną objętość matrycy błony podstawnej (patrz certyfikat analizy dla każdej partii) w 24 ml schłodzonej pożywki podstawowej DMEM/F-12 na dwanaście płytek o średnicy 6 cm. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
    3. Dodaj 2 ml do każdej płytki o średnicy 6 cm. Trzymaj płytkę w pozycji RT przez 1 godzinę. Usuń pożywkę i dodaj 2 ml pożywki z komórek macierzystych.
    4. Wyjmij cztery zlewające się płytki H9 na MEF-ach. Usunąć zróżnicowane kolonie za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml pod mikroskopem stereoskopowym umieszczonym w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    5. Odessać pożywkę i przemyć komórki 4 ml PBS i dodać 2 ml pożywki z komórek macierzystych do każdej płytki. Pokrój niezróżnicowane kolonie igłą 26 G na 6 do 9 kawałków każda.
    6. Delikatnie zbierz komórki w probówce sokoła o pojemności 50 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
    7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 12 ml pożywki z komórkami macierzystymi. Policz grudki, umieszczając 20 μl na szkiełku podstawowym pod mikroskopem i dostosuj objętość do 150 grudek na ml. Dodać 2 ml zawiesiny do każdej płytki o średnicy 6 cm.
    8. Przesuwaj płytki w przód iw tył oraz na boki, aby uzyskać równomierny rozkład grudek, a następnie inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ).
    9. Usuń zróżnicowane kolonie i podawaj zmianę co drugi dzień.

2. Tworzenie ciał embrionalnych (EBs)

Wykonaj wszystkie poniższe procedury zgodnie z zasadami aseptycznych środków ostrożności i w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Dzień 0 – Posiewanie komórek H9 na płytkach dolnych w kształcie litery V
    1. Przygotuj 5% kopolimer blokowy, taki jak Pluronic F 127 w PBS i przefiltruj przez system filtracji sterowanej podciśnieniem za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm.
    2. Pokryć V dolne 96-dołkowe płytki 40 μl 5% kopolimeru blokowego na dołek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
    3. Usunąć zlewające się płytki macierzy błony podstawnej z komórkami H9 z inkubatora i usunąć zróżnicowane kolonie za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml pod mikroskopem stereoskopowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Odessać pożywkę i przemyć komórki 4 ml PBS. Dodać 2 ml pożywki do losowego różnicowania (pożywka H9 bez bFGF, pożywka RD) do każdej płytki. Użyj narzędzia do pasażu i pokrój kolonie komórek H9 w grudki o jednolitym rozmiarze i kształcie, obserwując pod mikroskopem stereoskopowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie delikatnie zeskrob skrobakiem do komórek.
    5. Zebrać grudki do probówki sokoła o pojemności 50 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórkę w pożywce RD, aby uzyskać 1 000 grudek na ml.
    6. Zassać kopolimer blokowy z dolnych płytek V. Wlać grudki do sterylnej kwadratowej płytki i za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl zawiesiny do każdego dołka dolnej płytki V.
    7. W celu agregacji sił grudek należy odwirować dolne płytki V w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 400 x g. Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) przez cztery dni.
  2. Dzień 4 - Odbiór EB
    1. Zebrać EBs na sterylnej kwadratowej płytce z dolnych płytek V za pomocą pipety wielokanałowej i końcówek o szerokim otworze 200 μl.
    2. Pobrać EB ze sterylnej płytki kwadratowej do probówki Falcon o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Pozwól EB osiąść przez 2 minuty. Odessać supernatant i przemyć EB 5 ml PBS.
    3. Pozostawić EB do ustabilizowania się na 2 minuty i odessać supernatant. Ponownie zawiesić EB w 5 ml pożywki RD.
    4. Odpipetować 10 ml pożywki RD na 10 cm płytki bakteriologiczne. Przenieś EB na 10 cm płytkich bakteriologicznych.
    5. Inkubować płytki bakteriologiczne na wytrząsarce poziomej (ruch posuwisto-zwrotny 50/min) przechowywane w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) przez wymagany okres czasu. Podawać zmianę (15 ml pożywki RD) co drugi dzień.
      Uwaga: Podczas hodowli hESC wymagane jest delikatne obchodzenie się z ludzkimi zarodkami. Wielkość EB zmienia się w 4 dniu. Wybierz EBs o jednolitym rozmiarze (± 20%), obserwując pod mikroskopem stereoskopowym w celu dalszego eksperymentu. Około 50% EB utworzonych tą metodą ma jednolitą wielkość. Przenoszenie EB na wytrząsarkę skutkuje jednolitym kształtem.

3. Test cytotoksyczności do oznaczania IC10

  1. Przenoszenie EB na optycznych płytach dolnych
    1. Rozmrozić 0,1% żelatyny w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut i pokryć dolne płytki optyczne 50 μl 0,1% żelatyny na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Po inkubacji odessać żelatynę z optycznych płytek dolnych.
    2. Wyjmij EB pobrane w 4 dniu na 10 cm płytkę bakteriologiczną zawierającą pożywkę RD.
    3. Utrzymuj dolne płyty optyczne w pozycji pochylonej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść dwie EB o jednakowej wielkości w pożywce 100 μl RD na studzienkę na płytkę z 96 dołkami optycznymi, obserwując pod mikroskopem stereoskopowym. Pozostaw 12. kolumnę pustą.
    4. Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) przez 24 godziny.
  2. Narażenie na lek od 5 do 14 dnia
    1. Zważyć badany związek i uzyskać najwyższe stężenie w znanym rozpuszczalniku.
    2. Przeprowadzić półlogarytmiczne rozcieńczenie badanego związku szeregowo do 8 rozcieńczeń w rozpuszczalniku zawierającym probówki sokoła ponumerowane od A do H, zachować probówkę nr. I jako kontrola pojazdu, rura nr J jako kontrola ujemna (pożywka RD) i rura nr K jako kontrola dodatnia (70% etanolu).
    3. Rozmrażać pożywkę RD w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Wyjmij 5 ml pożywki RD w 11 sterylnych probówkach sokoła oznaczonych od 1 do 11.
    4. Przenieść 5 μl roztworu z probówki A do probówki K do probówki 1 do 11 i zawirować probówki. Wyjąć dolną płytkę optyczną z inkubatora i ostrożnie usunąć pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej.
    5. Dodać 200 μl pożywki z probówki nr 1 do 11 do odpowiednich kolumn dolnej płyty optycznej. Podawaj pożywkę/lek co drugi dzień.
      Uwaga: W przypadku rozcieńczeń półlogarytmicznych należy pobrać 6,48 μl rozpuszczalnika w 7 probówkach oznaczonych od 2 do 8. Z probówki o najwyższym stężeniu nr 1 przenieś 3 μl do probówki nr 2, wiruj i szeregowo przenieś 3 μl do następnej probówki. Zachowaj rurkę nr 9 do kontroli pojazdu i rurkę nr 10 do kontroli ujemnej. Rurka nr 11 składa się w 70% z etanolu.
  3. Dzień 14 : Ekspozycja na resazurynę i pomiar fluorescencji
    1. Rozmrażać pożywkę RD w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Wykonać wszystkie poniższe procedury przy braku światła w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Pobrać 10 ml pożywki RD do probówki (A) o pojemności 15 ml i dodać zalecaną objętość odczynnika rezazuryny i wymieszać pipetując. Wyjmij dolną płytkę optyczną z inkubatora i ostrożnie usuń całe podłoże za pomocą pipety wielokanałowej.
    3. Dodać 100 μl pożywki z probówki A do każdej studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) przez 90 minut.
    4. Zmierzyć fluorescencję za pomocą spektrofotometru (560Ex/590Em).
  4. Wyznaczanie wartości IC10
    1. Zaimportuj wartości w pryzmacie podkładki wykresu po odjęciu pustych wartości. Ustaw oś x jako dawkę, a oś y jako jednostki fluorescencji.
    2. Znormalizuj wartości, aby uzyskać wartość procentową na osi y i przekształć wartości (oś x jako skala logarytmiczna). Obliczyć wartość IC50 przy użyciu parametru odpowiedzi na dawkę sigmoidalną (zmienne nachylenie). Oblicz wartości logarytmu IC10, używając następującego równania:
      F = 10 logEC50 = logECF - (1/HillSlope)*log(F/(100-F))
      Y = Dół + (Góra-Dół)/(1+10^((LogEC50-X)*Nachylenie wzgórza))
    3. Określ wartości IC10, które należy wziąć pod uwagę do dalszych badań.

4. Badanie biomarkerów na podstawie mikromacierzy

  1. Dzień 0 do dnia 5:
    1. Formowanie ciała zarodka i przenoszenie na płytki bakteriologiczne o średnicy 10 cm – należy postępować zgodnie z etapami opisanymi w pkt 2 w celu utworzenia ciała zarodka.
      Uwaga: Do każdego badania należy użyć trzech powtórzeń biologicznych. Podzielić każdą replikę biologiczną na dwie części — leczenie farmakologiczne przy stężeniu IC10 i kontrola nośnika. Przygotować stężenie leku 10 000 razy większe niż stężenie IC10 w podłożu i z tego dodać 10 μl do 100 ml pożywki RD z grudkami komórek H9 w 50 ml probówki Eppendorfa, dobrze wymieszać i wysiać na dolne płytki w kształcie litery V. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla grupy kontrolnej pojazdu.
  2. W przypadku ekspozycji na lek w dniach od 5 do 14 należy pobrać EB i przenieść je na 10 cm płytki bakteriologiczne w dniu 4, zgodnie z krokami wymienionymi w punkcie 2. Przenieść płytki na wytrząsarce poziomej (ruch posuwisto-zwrotny 50/min) w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) przez 14 dni. Dawaj średnie drobne co drugi dzień.
  3. W celu pobrania próbki, w dniu 14, należy pobrać EB z 10 cm płytek do 15 ml probówki sokoła za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Pozwól EB osiąść przez 2 minuty. Odessać supernatant i przemyć EB 5 ml PBS. Pozostawić EB do ustabilizowania się na 2 minuty i odessać supernatant. Zawiesić EB w 1 ml roztworu RNAlater lub odczynniku TRIzol, odwirować i przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    Uwaga: Wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy wykonywać zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Obracaj płytki ruchem okrężnym wokół środka, aby wszystkie EB znalazły się w środku, odessać pożywkę z otoczenia za pomocą sterylnej szklanej pipety pastewnej, dodać 15 ml pożywki RD, a następnie dodać 15 μl leku / nośnika dla odpowiedniej grupy.

5. Izolacja RNA i testowanie integralności

  1. Izolacja RNA:
    Większość z wymienionych poniżej kroków należy wykonać w celu oczyszczenia RNA za pomocą RNeasy Mini Kit zgodnie z instrukcją obsługi. Zawsze używaj probówek bez nukleazy, końcówek do pipet i wody. Podczas pracy z TRIzol należy wykonywać wszystkie procedury w kapturze bezpieczeństwa chemicznego i nosić okulary ochronne oraz rękawice chroniące przed chemikaliami.
    1. Rozmrozić próbki na lodzie. Jeśli próbki są przechowywane w roztworze RNAlater, należy odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml odczynnika TRIzol.
    2. Rozcierać próbki za pomocą igły 24 G i strzykawki o pojemności 1 ml. Około 15-krotne tryturowanie jest wystarczające do rozerwania EB, ściany komórkowej i błon plazmatycznych.
    3. Dodać 200 μl chloroformu do każdej próbki. Wirować, aby równomiernie wymieszać zawartość. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyjmij mini kolumny wirowe RNeasy, probówki 1,5 ml i odpowiednio je oznacz.
    4. Zebrać supernatant do probówek o pojemności 1,5 ml (podczas zbierania supernatantu nie naruszać środkowej ani dolnej warstwy). Dodaj równą objętość schłodzonego 70% etanolu. Wymieszaj zawartość, delikatnie wstrząsając.
    5. Nanieść 700 μl z probówek na odpowiednie mini kolumny wirowe i odwirować je przy 12 000 x g przez 20 sekund w temperaturze pokojowej. Wszystkie dalsze kroki należy wykonać w temperaturze pokojowej.
    6. Odrzucić filtrat i nanieść pozostały roztwór na odpowiednie kolumny i odwirować je przy 12 000 x g przez 20 sekund. Wyrzucić filtrat.
    7. Nanieść 350 μl buforu RW1 na kolumnę i odwirować je przy 12 000 x g przez 20 sekund. Odrzucić filtrat i nałożyć 10 μl DNAzy i 70 μl buforu RDD na kolumnę.
    8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Nanieść 350 μl buforu RW1 na kolumnę i odwirować je przy 12 000 x g przez 20 sekund. Wyrzucić filtrat. Nanieść 500 μl buforu płuczącego RPE na kolumnę i odwirować je przy 12 000 x g przez 20 sekund. Wyrzucić filtrat. Ponownie Nanieść 500 μl buforu płuczącego RPE do kolumny i odwirować je przy 12 000 x g przez 2 minuty. Wyrzucić filtrat.
    9. Przesunąć kolumny do nowych probówek zbiorczych o pojemności 2 ml i odwirować je przy 12 000 x g przez 1 minutę. Przenieść kolumny do oznakowanej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i nałożyć 22 μl wody wolnej od nukleazy. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 1 min.
    10. Wyjmij probówkę zbiorczą i połóż je na lodzie. Określ ilościowo RNA za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy.
  2. Badanie stężenia, czystości i integralności RNA.
    Do badania czystości i integralności RNA należy użyć automatycznego systemu elektroforezy i odpowiedniego zestawu33.

6. Badania mikromacierzy

  1. Wykonaj profilowanie transkrypcji przy użyciu dostępnych na rynku chipów Human Array. Do przygotowania celu RNA, fragmentacji, hybrydyzacji34 i barwienia chipów macierzowych, mycia35 należy użyć dostępnych na rynku zestawów.
  2. Skanowanie układów scalonych macierzy i kontrola jakości przy użyciu standardowej stacji fluidycznej, skanerów matrycowych i standardowego oprogramowania operacyjnego36. W celu analizy ekspresji genów należy zaimportować pliki wygenerowane ze skanerów do standardowego dostępnego na rynku oprogramowania37, przeprowadzić korekcję tła, podsumowanie i normalizację za pomocą niezawodnej analizy wielomacierzowej (RMA).
  3. Aby uzyskać listę genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG), należy przeprowadzić jednokierunkową analizę ANOVA. Z tej listy odfiltruj geny na podstawie zmiany fałdowania (± 2) i wartości p kontrolowanej przez FDR (< 0,05). Uzyskaj analizę głównych składowych (PCA), mapę cieplną itp. za pomocą tego oprogramowania.

Część 2. System testowy UKN 1

1. Utrzymanie hESC

  1. Wysiewanie MEF-ów
    1. Do różnicowania użyj linii komórkowej NSCB#8534 (H9). Hodowla komórek na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) jako komórkach żywicielskich. Pokryć kolbę T25 4 ml 0,1% żelatyny i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Rozmrozić MEF-y w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść komórki do wstępnie ogrzanego DMEM/10% FBS.
    3. Wirować 3,5 minuty z 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki, aby uzyskać 1 x 107 komórek/ml. Płytka MEF 4 x 104/cm2 w kolbach T25 na żelatynie. Opcjonalnie użyj MEF przez następne dwa dni. Jakość partii MEF jest bardzo krytyczną kwestią dla utrzymania hESC. Dlatego wskazane jest wyjaśnienie najlepszej firmy i metody przygotowania komórek H9. Używamy PMEF P3.
  2. Dzielenie i konserwacja H9
    1. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej dypazy do kolby T25 H9 i inkubować przez 9 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 2 ml pożywki do płukania, aby rozproszyć leczone komórki i pipetować 5 razy w górę iw dół za pomocą 5 ml pipety i przenieść roztwór komórek do probówki sokoła.
    3. Przemyć kolbę 9 ml pożywki do przemywania i dodać komórki do pozostałych. Wirować przez 3,5 minuty z 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki hESC.
    4. Wirować przez 3,5 minuty z 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki hESC. Dodać 0,5 ml zawiesiny komórek i 4,5 ml pożywki z hESC i płytkę do nowej (przemytej PBS) kolby T25 z MEF. Codziennie wymieniać całą pożywkę z hESC (5 ml) w kolbie.

2. Różnicowanie hESC w kierunku neuroektodermalnych komórek progenitorowych (NEP)

  1. Przygotować pożywkę z hESC i pożywkę z KCM. Pokryć jedno 10 cm naczynie żelatyną (0,1% PBS) w kolbie T25 i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć pożywkę z hESC i dodać tyle dokładności, aby pokryć całe dno kolby (1 ml na kolbę T25) i inkubować przez 25-30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować płytki pokryte matrycą błony podstawnej podczas inkubacji akutazy. Dodaj zimny DMEM / F12 do zamrożonego osadu matrycy błony podstawnej i rozpuść go w stosunku 1:20. Przefiltrować roztwór matrycy membrany podstawnej przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm. Dodać przefiltrowany roztwór na płytkę, całe dno należy przykryć (wymagany jest 1 ml na 6 dołków) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Po okresie inkubacji usunąć błonę podstawną, matrycę, supernatant i komórki nasienne z pokrytych studzienek. Po etapie akutazy (2.1) zatrzymać reakcję przez dodanie 1,5 ml pożywki HES. Zeskrobać komórki z kolby, dodać 8 ml pożywki z hESC i otrzymać roztwór jednokomórkowy, dokładnie pipetując pipetą o pojemności 10 ml. Przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 40 μm.
  4. Obracać komórki przez 3 minuty z 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml hESC. Ponownie odwirować komórki przez 3 minuty z 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w hESC zawierającym inhibitor ROCK Y-27632 w końcowym stężeniu 10 μM.
  5. Usunąć supernatant z naczynia pokrytego żelatyną. Zawiesina komórek płytki na naczyniu pokrytym żelatyną w celu usunięcia MEF i pozostawienia w inkubatorze dokładnie na 1 godz.
    UWAGA: Na tym etapie MEF-y osiądą na płytce pokrytej żelatyną, podczas gdy hESC nie może przyłączyć się do żelatyny. Dlatego ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania różnicowania bez dowozu. Jest to krytyczny krok, ponieważ zbyt długa inkubacja prowadzi do zagęszczenia się komórek macierzystych ESC, a zbyt krótka inkubacja do nieefektywnego usuwania MEF. Po 45 minutach inkubacji płytkę należy zbadać pod kątem już osiadłych MEF i grudek hESC.
  6. Po przyczepieniu się MEF-ów delikatnie zmyć nieprzylegające komórki (hESC) po inkubacji z pożywką znajdującą się już na płytce. Jeśli użyto kilku T25, aby uzyskać więcej komórek, pojedyncze komórki można teraz łączyć. Umyć płytkę raz pożywką z hESC.
  7. Odwiruj komórki przez 3 minuty z 500 x g, usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w około 4 ml KCM zawierającym 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 i 10 ng/ml FGF-2.
  8. Policz komórki w hemocytometrze za pomocą błękitu trypanowego. Płytka 18 x 103 komórki/cm2 na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej w KCM zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 i 10 ng/ml FGF-2 (w przypadku 6 dołków należy użyć 1,5 ml na studzienkę). Bardzo ważne jest, aby pokryć komórki w odpowiedniej gęstości, aby skutecznie różnicować je w NEP.
  9. Po 24 godzinach zmienić pożywkę na świeżą KCM zawierającą 10 μM inhibitor ROCK Y-27632 i 10 ng/ml FGF-2. Po upływie kolejnych 24 godzin zmienić pożywkę na świeżą KCM zawierającą 10 ng/ml FGF2.
  10. 72 godziny po wysianiu komórek różnicowanie rozpoczyna się od zmiany pożywki w kierunku pożywki KSR. Ten punkt czasowy jest określany jako dzień różnicowania 0 (DoD0). Dodawanie badanych substancji jest teraz możliwe.
  11. W DoD1 i DoD2 medium jest zmieniane dokładnie tak samo jak w DoD0. Następna średnia zmiana ma miejsce w DoD4 zawierającym 25% N2-S i 75% KSR. W DoD6 różnicowanie zostaje zatrzymane, a komórki są zbierane do analizy.

3. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) hESC i NEP

  1. Przygotowanie jąder
    1. Dodać 500 μl akutazy do każdego 6 dołków, które należy przeanalizować i inkubować przez 25 do 30 minut. Policz komórki w komorze Neubauera za pomocą błękitu trypanowego.
    2. Ponownie zawieś komórki w 1% formaldehydzie w DMEM/F12 w celu usieciowania. Dodać Tris pH 7,5 do końcowego stężenia 125 mM po 10 minutach, aby zatrzymać wiązanie.
    3. Wirować komórki przez 3 minuty z 500 x g w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w zimnym PBS.
    4. Wirować komórki przez 3 minuty z 500 x g w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu L1 / 1 x 106 komórek.
    5. Inkubować przez 5 minut na lodzie. Wirować 5 minut z 800 x g w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić jądra w 1 ml buforu L2 / 2 x 106 komórek.
  2. Sonikacja i kontrola jakości
    1. Sonikacja tak, aby powstały fragmenty DNA o długości 300–700 pz. Wirować przez 1 minutę z 10 000 x g w temperaturze 4°C. Przenieść supernatant do nowej probówki. Fragmenty muszą mieć odpowiednią wielkość, w przeciwnym razie immunoprecypitacja będzie nieefektywna, podobnie jak następujący po niej qPCR.
    2. Usunąć 50 μl i wymieszać z 50 μl buforem L2, aby sprawdzić skuteczność sonikacji, uruchamiając żel agarozowy.
    3. Odwrotne sieciowanie przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 4 godziny i 500 obr./min. Załaduj próbki 1:5 barwnikiem Orange G na 1,5% żelu agarozowym i uruchom 45 minut przy 110 V w 1x buforze TBE. Wielkość fragmentu kontrolnego (powinna wynosić od 300 do 700 pz).
  3. Immunoprecypitacja chromatyny
    1. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:5 w buforze do rozcieńczania i podwielokrotność 1 ml na IP w silikonowanych probówkach.
    2. Usunąć 5% (objętość) z rozcieńczonej próbki chromatyny (krok 3.3.1) i przechowywać w temperaturze 4 °C jako "wejście".
    3. Próbki należy inkubować z wybranymi przeciwciałami i niespecyficznymi IgG O/N w temperaturze 4 °C na rotatorze.
    4. Dodać 50 μl kulek sefarozy Protein-A/G do każdej próbki po immunoprecypitacji. Próbki inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze. Odwirować przez 1 minutę z 1 500 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    5. Umyć 1 ml koralikami do prania. Odwirować przez 1 minutę z 1 500 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz kroki od g do h. Przemyć 1 ml buforu do przemywania końcowego. Podczas etapów prania nie należy stracić żadnych kulek, ponieważ zmienia to bezpośrednio ilość eluatu.
    6. Odwirować 1 minutę z 1 500 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Dodać 125 μl buforu elucyjnego i inkubować przez 15 minut w temperaturze 65 °C przy 1 000 obr./min na wytrząsarce.
    7. Wirować przez 1 minutę z 1,500 x g i przenieść supernatant do nowej probówki Powtórzyć kroki k i l. Dodać 200 μl buforu elucyjnego do wejścia (3.3.2). Dodać proteinazę K i RNazę do każdej próbki i inkubować 30 minut w temperaturze 37 °C przy 500 obr./min na wytrząsarce, a następnie 4 godziny w temperaturze 65 °C przy 500 obr./min na wytrząsarce.
      UWAGA: Do ekstrakcji DNA użyj dostępnego na rynku zestawu ChIP DNA Clean and Concentrator Kit38.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narażenie na metylortęć w systemie testowym UKK

Test cytotoksyczności został przeprowadzony z H9 EBs w celu uzyskania wartości IC10 (zmniejszenie żywotności o 10%) dla cytotoksyczności metylortęci (Rysunek 1). Przeprowadziliśmy również badanie biomarkerów oparte na mikromacierzyach (platforma affymetrix). H9 EBs były narażone na działanie metylortęci (0,25 i 1 μM) przez 14 dni. W 14 dniu próbki pobrano za pomocą TRIzolu i wyizolowano RNA. Profilowanie transkrypcji p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne podejścia do badań toksykologicznych obejmują szeroko zakrojone badania na zwierzętach, co sprawia, że badania są kosztowne i czasochłonne. Ponadto, ze względu na różnice międzygatunkowe, przedkliniczne badania bezpieczeństwa na zwierzętach nie zawsze są miarodajne, aby przewidzieć skutki toksyczności potencjalnych leków istotnych dla ludzi. Chociaż zwierzęta z rzędu naczelnych są najbardziej przewidywalne, wciąż w nowoczesnych społeczeństwach szybko rosną wysokie wymagania etyczne i społeczno-ekonomiczne doty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy M. Kapitzie, Margit Henry, Tamarze Rotshteyn, Susan Rohani i Cornelii Böttinger za doskonałe wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty Niemieckiej Fundacji Badawczej (RTG 1331) i niemieckiego Ministerstwa Badań Naukowych (BMBF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały


Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F-12Life Technologies11320082Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco: Mieszanka składników odżywczych F-12
KOSRLife Technologies10828028Zamiennik serum nokautującego
GlutaMAXLife Technologies35050061Suplement GlutaMAX
NEAALife Technologies11140050MEM Roztwór
DPBSLife Technologies14190-0144Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu
Pożywka mTeSRStemcell Technologies5850
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
V płyta dolnaVWR734-0483Płyta, Microwell, V BTTM, 96 Well, sterylna 1 * 50 ST
V pokrywa płyty dolnejVWR634-0011Pokrywka, płytki do mikromiareczkowania, pierścień kondycyjny 1 * 50 ST
Pen/StrepLife Technologies15140-122Penicylina-Streptomycyna, Płynna
woda destylowanaLife Technologies15230-089.Sterylna woda destylowana
Ludzki FGF-2 (bFGF)MiliporowyGF003AF-100UGCzynnik wzrostu fibroblastów podstawowy, rekombinowany przez człowieka, wolny od zwierząt
Filtr 0,22 i mu; mMiliporeSCGPU02REStericup-GP, 0,22 μ m, polieterosulfon, 250 ml, sterylizowany radioaktywnie
StemPro EZPassageTM Dysponujzaawansowanym23181010
BD MatrigelTM, z kwalifikacją hESC MatrixStemcell Technologies354277fiolka 5 ml
DMSOSigmaD-2650
Roztwór do stabilizacji RNAlaterTechnologie życiaAM7020Stabilizuje i chroni integralność RNA w niezamrożonych próbkach.
70 μ m Sitko komórkoweBecton Dickinson352350Sitko komórkowe z 70 μ m Siatka nylonowa
35 μ m Sitko do komórek w pokrywie, 5  ml probówkaBecton Dickinson3522355 ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnem, z nakrętką sitka komórkowego (35  μ m)
50 ml sterylna probówka polipropylenowaGreiner Bio-One22726150 ml Probówka polipropylenowa ze stożkowym dnem, Sterylna
kolba T75Greiner Bio-One658175CELLSTAR Nasadka filtrująca Hodowla komórkowa 75 cm2 Kolby
TRIzolLife Technologies10296010
96-dołkowe optyczne płytki denneThermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
AccutasePAAL11-007
ApotransferynaSigma-AldrichT-2036
DispaseWorthington BiochemicalsLS002104
DorsomorphinTocris Bioscience3093
EDTARoth8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R& D Systems233-FB
ŻelatynaSigma-AldrichG1890-100G
GlukozaSigma-AldrichG7021-100G
GlutaMAXGibco Invitrogen35050-038
HEPESGibco Invitrogen15630-056
InsulinaSigma-AldrichI-6634
Nokaut DMEMGibco Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR& D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
ProgesteronSigma-AldrichP7556
PutrescynaSigma-AldrichP-5780
Inhibitor ROCK Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
SeleniumSigma-AldrichS-5261
β-MercaptoethanolGibco Invitrogen31350-010
[nagłówek]
Lista zestawów
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
Zestaw do hybrydyzacji, prania i barwienia GeneChipAffymetrix900721, 22, 23Ten zestaw zawiera wszystkie odczynniki wymagane do hybrydyzacji, mycia i barwienia mikromacierzy.
Zestaw DNaz bez rnazyQIAGEN79254
[nagłówek]
Lista sprzętu
Mikroskop odwróconyPiecIX71
Genechip - 645Affymetrix
Stacja Genechip Fluidics-450Affymetrix Affymetrix
Skaner chipów genowych-3000-7 GUrządzenia
Spectramax M5
 
 
[nagłówek]
Lista programów
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Narzędzia online do adnotacji funkcjonalnej
DAVID
Onto-tools Laboratorium Systemów Inteligentnych i Bioinformatyki
aminokwasów endogennych hybrydyzacyjny Olympus molekularne Affymetrix  

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
  3. Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
  4. Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
  5. Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
  6. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  7. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
  8. Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
  9. Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
  10. Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
  11. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
  12. Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
  13. Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
  14. Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
  15. Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
  16. Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
  17. Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
  20. Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
  21. Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
  22. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
  23. Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
  24. Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
  25. Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
  26. Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
  27. Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
  28. Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
  29. Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
  30. Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
  31. Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
  32. Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
  33. Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
  34. Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
  35. Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
  36. Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
  37. Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
  38. ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
  39. Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Human Pluripotent Stem CellsEmbryoid Body FormationNeuroectodermal Progenitor DifferentiationTranscriptome Microarray AnalysisEarly Embryonic DevelopmentNeural Development ToxicityToxicity Biomarker Identification

Powiązane artykuły