Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

4 stycznia 2015

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Streszczenie

Sztywne tkanki nowotworowe są silnie zaangażowane w regulację migracji i inwazji komórek rakowych. Inwazyjna migracja przez usieciowane tkanki jest ułatwiona przez bogate w aktynę wypukłości zwane inwadopodiami, które proteolitycznie degradują macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Wykazano, że aktywność inwadopodii jest zależna od sztywności ECM i sił kurczliwości komórek rakowych, co sugeruje, że sygnały sztywności mogą regulować te struktury subkomórkowe poprzez kurczliwość aktomiozyny. Właściwości inwazyjne i kurczliwe komórek nowotworowych można skorelować in vitro za pomocą inwadopodiów i testów siły trakcyjnej opartych na żelach poliakrylamidowych (PAA) o różnej sztywności. Właściwości inwazyjne i kurczliwe komórek nowotworowych można skorelować in vitro za pomocą inwadopodiów i testów siły trakcyjnej opartych na żelach poliakrylamidowych (PAA) o różnej sztywności. Chociaż istnieją pewne różnice między tymi dwoma testami, przedstawiony tutaj protokół zapewnia metodę tworzenia PAA, które mogą być używane w obu testach i można je łatwo dostosować do specyficznych potrzeb biologicznych i technicznych użytkownika.

Wprowadzenie

Sztywność ECM związanego z nowotworem została zidentyfikowana jako istotny czynnik napędzający złośliwe zachowanie poprzez zwiększenie kurczliwości aktomiozyny1-3. Chociaż efekt ten wykazano przede wszystkim w przypadku komórek raka piersi, stwierdzono, że sztywność macierzy zmienia właściwości inwazyjne komórek pochodzących z różnych nowotworów4-8, co sugeruje, że sztywność guza może odgrywać rolę w innych typach nowotworów. Aby przeniknąć do usieciowanych tkanek podczas inwazyjnej migracji, komórki rakowe wykorzystują bogate w aktynę wypukłości adhezyjne, znane jako inwadopodia, które lokalizują proteinazy w celu ogniskowej degradacji ECM9. Invadopodia są uważane za cechę charakterystyczną komórek inwazyjnych i są zaangażowane w inwazję komórek nowotworowych i przerzuty10,11. Wcześniejsze prace wykazały, że sztywność matrycy może regulować liczbę inwadopodiów i związaną z nią degradację ECM4,12 poprzez aktywność miozyny II i białka mechanowrażliwe12. Biorąc pod uwagę korelację między gęstością guza a agresywnością raka13,14, wyniki te sugerują mechanizm, dzięki któremu komórki rakowe mogą reagować na sztywne tkanki nowotworowe, aby napędzać inwazję i przerzuty poprzez kurczliwość aktomiozyny.

Wykazano, że sztywność ECM in vitro i gęstość tkanek in vivo regulują inwazyjne zachowanie komórek nowotworowych1,15-17. Podczas gdy kurczliwość aktomiozyny wydaje się być ważna w tym procesie, obecne badania są sprzeczne co do tego, czy zdolność przerzutowa jest skorelowana ze zwiększonymi lub zmniejszonymi siłami skurczu6,18-20. Co więcej, nie wiadomo, czy siły te bezpośrednio pośredniczą w aktywności inwadopodiów21. Niedawno odkryliśmy, że siły kurczliwe komórek rakowych były zależne od sztywności matrycy i przewidywały degradację ECM przez inwadopodia5. Wyniki te sugerują, że siły komórkowe mogą odgrywać ważną rolę w progresji nowotworu, pośrednicząc w aktywności inwadopodiów w odpowiedzi na właściwości mechaniczne mikrośrodowiska guza.

Aby skorelować inwazyjne i kurczliwe właściwości komórek nowotworowych5, zmodyfikowaliśmy protokół tworzenia PAA o różnych sztywnościach, który wcześniej był używany do badania zależnej od sztywności aktywności inwadopodiów4,12,22. Poprzez chemiczne sieciowanie fibronektyny ludzkiego osocza w PAA, te zmodyfikowane hydrożele mogą być używane jako podstawa zarówno do testów inwadopodii, jak i siły pociągowej, aby zapewnić, że komórki doświadczyły tych samych sztywności w obu eksperymentach5. W testach inwadopodiów fibronektyna zapewnia naturalną domenę wiążącą żelatynę, która łączy nałożony ECM z PAA w celu wykrycia degradacji matrycy. W testach siły pociągowej fibronektyna zapewnia ligand do bezpośredniej adhezji komórkowej w celu wykrycia przemieszczeń mikrosfery używanych do obliczania komórkowych sił trakcyjnych. Ta metoda daje to, co nazwaliśmy miękkimi, twardymi i sztywnymi PAA, które są związane ze szklanymi naczyniami dennymi i mają moduły sprężystości E 1,023, 7,307 i 22,692 Pa5, które obejmują zakres właściwości mechanicznych zgłaszanych dla tkanek normalnych i nowotworowych23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych dla PAA

  1. Szkiełka nakrywkowe o grubości 12 mm należy czyścić chusteczkami o niskiej zawartości kłaczków.
  2. Podpal szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm i szkiełko nakrywkowe o średnicy 14 mm w mikrostudzience każdego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm, przepuszczając je przez płomień palnika Bunsena za pomocą pęsety.
  3. Mikrostudzienki należy traktować 200 μl 0,1 N NaOH przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zassać i wysuszyć mikrostudzienki na powietrzu przez 30 minut.
  5. Mikrostudzienki należy traktować 50-100 μl 3-aminopropylotrimetoksysilanu przez 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Ta substancja chemiczna reaguje z plastikiem; Dlatego należy używać szklanych pipet i nie napełniać całkowicie mikrostudzienek, aby uniknąć kontaktu z plastikowym naczyniem.
  6. Myj mikrostudzienki ultraczystą wodą przez około 10 minut, aż 3-aminopropylotrimetoksysilan stanie się klarowny.
  7. Opłucz mikrostudzienki dwukrotnie ultraczystą wodą za pomocą wyciskanej butelki.
  8. Myj mikrostudzienki 2 ml ultraczystej wody o temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na średnią prędkość (~1 Hz) przez 10 minut.
  9. Zassać i wysuszyć mikrostudzienki na powietrzu przez 30 minut.
  10. Potraktuj mikrostudzienki 2 ml 0,5% roztworu aldehydu glutarowego w temperaturze pokojowej na kołysce ustawionej na średnią prędkość (~1 Hz) przez 30 minut.
  11. Umyj mikrostudzienki 2 ml ultraczystej wody o temperaturze pokojowej na kołysce ustawionym na średnią prędkość (~1 Hz) przez 10 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 30 minut.
  12. Suszyć mikrostudzienki pod ostrym kątem (60º lub większym) przez 30 min.
    Uwaga: Naczynia można przechowywać przez 2 miesiące w eksykatorze.

2. Przygotowanie PAA do testów Invadopodia

  1. Aby uzyskać 1 ml roztworu miękkiego PAA (8% akrylamidu i 0,05% BIS), należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 25 μl 2% BIS i 574 μl wody ultraczystej (tabela 1).
  2. Aby uzyskać 1 ml roztworu twardego PAA (8% akrylamidu i 0,35% BIS), należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 175 μl 2% BIS i 409 μl wody ultraczystej (Tabela 1).
  3. Aby uzyskać 1 ml roztworu sztywnego PAA (12% akrylamidu i 0,60% BIS), należy połączyć 300 μl 40% akrylamidu, 300 μl 2% BIS i 169 μl wody ultraczystej (tabela 1).
  4. Odgazuj roztwory przez 15 minut. Dodaj 200, 215 i 230 μl fibronektyny o stężeniu 1 mg/ml ludzkiego osocza w ultraczystej wodzie do odpowiednio miękkich, twardych i sztywnych roztworów PAA. Do wszystkich roztworów dodać 1 μl estru N-hydroksysukcynimidu (NHS) kwasu akrylowego o stężeniu 10 mg/ml, 5 μl nadsiarczanu amonu o stężeniu 100 mg/ml i 2 μl N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED; Tabela 1). Mieszać delikatnie pipetując i unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworach.
szt. TGL szt. TGL szt. Rozdział TGL TGL szt. szt. szt.

PAA
(1 ml)		40%
AA
(μl)		2%
BIS
(μl)		Ultrapure
Woda
(μl)		1 mg/ml
FN
(μl)		10 mg/ml
NHS Ester
(μl)		100 mg/ml
APS
(μl)
TEMED
(μl)		Elastyczny
Moduł
Panie przewodniczący, panie i panowie!
miękki20025Okręg wyborczy 57420015cyfra arabskaNumer katalogowy 1023
twardy200175Rejon 409Rozdział 21515cyfra arabskaZobacz materiał 7307
sztywny300300Rozdział 16923015cyfra arabskaNumer katalogowy: 22692

Tabela 1: Objętości składników i wynikowe moduły sprężystości dla miękkich, twardych i sztywnych PAA stosowanych w testach inwadopodiów. AA = akrylamid, FN = fibronektyna, APS = nadsiarczan amonu.

  1. Odpipetować 8,48 μl roztworu PAA do środka każdej mikrostudzienki.
    Uwaga: Objętość ta teoretycznie daje PAA o grubości 75 μm.
  2. Delikatnie opuść płomieniowaną stronę szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm na kroplę w mikrostudzience za pomocą pęsety.
  3. Pozostaw warstwowy roztwór PAA do polimeryzacji przez 15-30 minut. Sprawdź polimeryzację, sprawdzając pozostały roztwór.
  4. Dodaj 2 ml 1x PBS do każdego naczynia i usuń 12 mm szkiełka nakrywkowe pęsetą.
    Uwaga: 10x PBS jest wytwarzany w laboratorium i składa się z 0,011 M KH2PO4, 1,54 M NaCl i 0,056 M Na2HPO4.
  5. Umyj mikrostudzienki 2 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.

3. Przygotowanie PAA do testów siły trakcyjnej

  1. Aby uzyskać 1 ml roztworu miękkiego PAA (8% akrylamidu i 0,05% BIS), należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 25 μl 2% BIS i 566 μl wody ultraczystej (tabela 2).
  2. W 1 ml roztworu twardego PAA (8% akrylamidu i 0,35% BIS) należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 175 μl 2% BIS i 401 μl wody ultraczystej (tabela 2).
  3. Aby uzyskać 1 ml roztworu sztywnego PAA (12% akrylamidu i 0,60% BIS), należy połączyć 300 μl 40% akrylamidu, 300 μl 2% BIS i 161 μl wody ultraczystej (tabela 2).
  4. Odgazowywać roztwory przez 15 minut. Dodać 200, 215 i 230 μl fibronektyny w ludzkim osoczu 1 mg/ml odpowiednio do miękkich, twardych i sztywnych roztworów PAA. Sonizacja 8 μl mikrosfer czerwonej fluorescencji o długości fali 200 nm (wzbudzenie/emisja 580/605 nm) przez 30 sek. Do każdego roztworu dodać 8 μl mikrosfer czerwonej fluorescencji o długości fali 200 nm, 1 μl estru NHS kwasu akrylowego o stężeniu 10 mg/ml, 5 μl nadsiarczanu amonu o stężeniu 100 mg/ml i 2 μl TEMED (Tabela 2). Mieszać delikatnie pipetując i unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworach.
szt. TGL szt. TGL szt. Rozdział TGL TGL szt. szt. szt. szt.

PAA
(1 ml)		40%
AA
(μl)		2%
BIS
(μl)		Ultrapure
Woda
(μl)		1 mg/ml
FN
(μl)
Mikrosfery
(μl)		10 mg/ml
NHS Ester
(μl)		100 mg/ml
APS
(μl)
TEMED
(μl)		Elastyczny
Moduł
Panie przewodniczący, panie i panowie!
miękki20025Okręg wyborczy 566200815cyfra arabskaNumer katalogowy 1023
twardy200175Rejon 401Rozdział 215815cyfra arabskaZobacz materiał 7307
sztywny300300161230815cyfra arabskaNumer katalogowy: 22692

Tabela 2: Objętości składników i wynikowe moduły sprężystości dla miękkich, twardych i sztywnych PAA używanych w testach siły pociągowej. AA = akrylamid, FN = fibronektyna, APS = nadsiarczan amonu.

  1. Odpipetować 8,48 μl roztworu PAA do środka każdej mikrostudzienki.
    Uwaga: Objętość ta teoretycznie daje PAA o grubości 75 μm.
  2. Delikatnie opuść płomieniowaną stronę szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm na kroplę w mikrostudzience za pomocą pęsety.
  3. Pozostaw umieszczony warstwowo roztwór PAA do polimeryzacji przez 15-30 minut. Sprawdź polimeryzację, sprawdzając pozostały roztwór.
  4. Dodaj 2 ml 1x PBS do każdego naczynia i usuń 12 mm szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety.
  5. Umyj mikrostudzienki 2 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.

4. Przygotowanie ECM do testów Invadopodia

  1. Podgrzać roztwór żelatyny (1% żelatyny i 1% sacharozy) do temperatury 37 °C.
  2. Potraktuj PAA 150 μl roztworu żelatyny przez 1 minutę, a następnie ostrożnie zassaj od dna mikrostudzienek, trzymając naczynia ze szklanym dnem pod kątem 45°.
  3. Wysuszyć pozostałą cienką warstwę żelatyny na PAA w mikrostudzienkach pod ostrym kątem (60° lub większym), aby zoptymalizować suszenie przez 60 minut.
  4. Potraktuj mikrostudzienki 2 ml schłodzonego 0,5% roztworu aldehydu glutarowego na lodzie przez 15 minut, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Umyj mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.
  6. Potraktuj mikrostudzienki 2 ml roztworu borowodorku sodu przez 1 minutę. Delikatnie postukaj w naczynia na stole, aby usunąć pęcherzyki, które tworzą się na powierzchni żelatyny.
  7. Odessać i przemyć mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórzyć jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.
  8. Rozcieńczyć roztwór fibronektyny z ludzkiego osocza znakowany FITC do 50 μg/ml za pomocą 1x PBS i odwirować przy 175 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min. Albo kup dostępną w handlu znakowaną fibronektynę, albo oznacz ją w następujący sposób:
    1. Rozpuścić 5 mg fibronektyny w 10 ml buforu boranowego (170 mM tetrahydratu metaboranu sodu i 40 mM NaCl) i umieścić w wężyku do dializy.
    2. Oznaczyć fibronektynę, umieszczając rurkę w 200 ml buforu boranowego zawierającego 6 mg rozpuszczonego FITC w temperaturze pokojowej na mieszadle magnetycznym ustawionym na najniższe ustawienie na 1,5 godziny w ciemności.
    3. Dializować za pomocą 500 ml 1x PBS na mieszadle magnetycznym ustawionym na najniższe ustawienie przez 3 dni w ciemnym chłodnym pomieszczeniu (4 °C) z dwiema zmianami objętości dziennie.
    4. Obliczyć stężenie fibronektyny znakowanej FITC na podstawie gęstości optycznej rozcieńczonych podwielokrotności (1:200) przy 280 nm i 493 nm jako [OD280 – (0,36 x OD493)] / 1,4 razy współczynnik rozcieńczenia 200 razy 2 (który odpowiada za glicerol zagęszczający fibronektynę w następnym kroku), co daje jednostki mg/ml.
    5. Dializować przez noc w 50% roztworze glicerolu na mieszadle magnetycznym ustawionym na najniższe ustawienie przez noc w ciemnym chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C.)
  9. Potraktuj mikrostudzienki 150 μl roztworu fibronektyny znakowanego FITC w temperaturze pokojowej przez 60 minut w ciemności.
  10. Ostrożnie zassać roztwór fibronektyny znakowany FITC z dna mikrostudzienek, trzymając szklane naczynia pod kątem 45°, a następnie napełnić naczynia ze szklanym dnem 70% roztworem etanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut w kapturze do hodowli ciemnych komórek w celu sterylizacji. Napełnij również szklane pokrywki naczyń lub wytrzyj do czysta chusteczkami o niskiej zawartości kłaczków nasączonymi 70% etanolem.
  11. Umyj naczynia ze szklanym dnem, napełniając je 1x PBS na 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy z 2 ml 1x PBS, w sumie przez 15 minut.

5. Przygotowanie i obrazowanie testów Invadopodia

  1. Dodaj 25 000 komórek rakowych w 2 ml pożywki invadopodia (1:1 DMEM i RPMI 1640 z 5% surowicą niskobiałkową, 10% płodową surowicą bydlęcą i 20 ng / ml świeżo dodanego naskórkowego czynnika wzrostu) do naczyń ze szklanym dnem i inkubuj przez noc.
  2. Odessać i potraktować mikrostudzienki 2 ml 3,7% roztworu paraformaldehydu w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut, aby utrwalić komórki.
  3. Po dwóch szybkich myciach z użyciem 2 ml 1x PBS, potraktuj mikrostudzienki 2 ml 0,1% roztworu Triton X-100 w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 minut, aby przepuszczalność komórek.
  4. Po jednym szybkim przemyciu 2 ml 1x PBS, potraktuj mikrostudzienki 3% roztworem blokującym albuminę surowicy bydlęcej w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut, aby zablokować komórki.
  5. Inkubować mikrostudzienki ze 150 μl mysiego przeciwciała antykortaktynowego (1:750) w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.
  6. Myć mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 15 minut.
  7. Inkubować mikrostudzienki ze 150 μl koziego przeciwciała anty-mysiego 633 (1:500) i 546 falloidyny (1:750) w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.
  8. Myć mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 15 minut.
  9. Dodaj sześć kropli podłoża montażowego, aby wypełnić każdą mikrostudzienkę i przykryj szkiełkami nakrywkowymi 22 x 22.
  10. Obrazowanie kortaktyny i aktyny w celu identyfikacji inwadopodiów przy użyciu filtrów wzbudzenia i emisji odpowiednio 632/647 nm i 556/570 nm, przy użyciu soczewki zanurzeniowej o wysokim NA, 40X zanurzeniu w oleju na odwróconym mikroskopie o szerokim polu. Podobnie obraz fibronektyny w celu identyfikacji degradacji ECM za pomocą filtra wzbudzenia i emisji 492/518 nm.

6. Przygotowanie i obrazowanie testów siły trakcyjnej

  1. Dodaj 15 000 komórek rakowych w 2 ml pożywki z inwadopodiami do naczyń ze szklanym dnem i inkubuj przez noc.
  2. Odessać pożywkę do naczyń ze szklanym dnem i zastąpić 2 ml pożywki L-15 tymi samymi suplementami (5% surowicy niskobiałkowej, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 20 ng/ml świeżo dodanego naskórkowego czynnika wzrostu), wstępnie podgrzanej do 37 °C.
  3. Inkubować naczynia ze szklanym dnem w komorze środowiskowej na mikroskopie odwróconym, wstępnie zrównoważonym do 37 °C przy wysokiej wilgotności przez 1 godzinę.
  4. Wykonaj cztery zestawy zdjęć za pomocą obiektywu o wysokiej NA, 40-krotnej ostrości na odwróconym mikroskopie o szerokim polu widzenia ze zautomatyzowanym stolikiem, aby oznaczyć pozycje komórek:
    1. Obrazowanie komórek na PAA za pomocą kontrastu fazowego (obraz "fazowy").
    2. Obrazuj mikrosfery fluorescencyjne za pomocą filtrów wzbudzenia i emisji 560/645 nm, skupiając się lekko pod komórkami, aż pierwsza warstwa mikrosfer na górze PAA stanie się ostra (obraz "naprężony").
    3. Ponadto skup się na dnie PAA (używając mikrosfer jako markerów) i zrób zdjęcie (obraz "dolny"). Uwaga: Celem tego obrazu jest zarejestrowanie pozycji z w celu uzyskania rzeczywistej grubości PAA w każdym położeniu do obliczeń siły pociągowej, jak opisano w Reprezentatywne wyniki.
    4. Po uzyskaniu tych obrazów w wielu pozycjach, delikatnie wymieszaj 220 μl 10% roztworu Triton-X, aby usunąć komórki. Obrazuj mikrosfery na górze PAA w każdej pozycji, jak opisano wcześniej (obraz "zerowy").

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W teście invadopodiów invadopodia są zazwyczaj identyfikowane poprzez kolokalizację markerów, takich jak aktyna i kortaktyna, w strukturach punktowych w obrębie ciała komórki (Rysunek 1). Można zliczyć zarówno aktywnie degradujące, jak i niebiodegradujące invadopodia, które odróżnia się na podstawie tego, czy struktury te kolokalizują z czarnymi obszarami pozbawionymi sygnału fluorescencyjnego w fibronektynie znakowanej FITC (Rysunek 1). Invadopodia są zliczane ręcznie, a stopień degrada...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy metodę wytwarzania PAA, która może być wykorzystana jako podstawa do testów inwadopodiów i siły trakcyjnej w celu skorelowania inwazyjnych i kurczliwych zachowań komórkowych. Podczas gdy PAA od dawna są używane do badania wpływu sztywności na komórki i obliczania sił trakcyjnych18,24,27, ten protokół jest pierwszym, w którym opracowano równoległe testy oparte na PAA o tych samych sztywnościach w celu skorelowania inwazyjnych i kurczliwych zachowań komórkowych w odpowiedzi na właściwości mechanicz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Prace te były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer K25CA143412 (Parekh). Pragniemy wyrazić wdzięczność, że dodatkowe wsparcie zostało udzielone przez Klinikę Otolaryngologii. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Podziękowania

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-AminopropylottrimetoksysilanSigma-Aldrich281778
Akrylamid (40%)Bio-Rad161-0140
Kwas akrylowy NHSester Sigma-AldrichA8060przygotować świeżo w dygestoriach 10 mg / ml w DMSO
Alexa Fluor 546 falloidynaLife TechnologiesA22283może również stosować rodaminę
Nadsiarczan amonuBio-Rad161-0700przygotować świeży 10% roztwór w 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences18606użyć 6 kropli do napełnienia mikrostudzienek
BIS (2%)Bio-Rad161-0142
Albumina surowicy bydlęcejRPIA30075zrobić 3% dla roztworu blokującego w 1x PBS i przechowywać w 4 stopniach; C
Szkiełka nakrywkowe (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
rurki do dializySigma-AldrichD9777wstępna równowaga w buforze boranowym przez 15 - 30 min
DMEMCellgro10-013-CVsłuży do wytwarzania podłoża dla inwadopodiów
DMSOSigma-AldrichD8418służy do wytwarzania estru estru kwasu akrylowego NHS
Naskórkowy czynnik wzrostuŻycie TechnologiePHG0311zastosowanie do produkcji podłoża z inwadopodiów
EtanolPHARMCO-AAPERE200rozcieńczyć wodą ultraczystą do 70%
FBSThermo ScientificSH30070.03do produkcji podłoża inwadopodiów
FITCSigma-AldrichF7250chronić przed światłem
ŻelatynaPolysciences00639zazwyczaj sporządza się 10 ml 1% roztworu sacharozy/1% żelatyny w PBS i przechowuje w temperaturze 4 & st.; C (podgrzej PBS, aby łatwo rozpuścić żelatynę)
Naczynia ze szklanym dnem (szkiełka nakrywkowe 35 mm)SzkiełkaMatTekP35G-0-14-Csą niepowlekane
Aldehyd glutarowy (25%)Polysciences01909rozcieńczyć 1x PBS do 0,5%
Kozie przeciwciało anty-mysie Alexa Fluor 633Life TechnologiesA21050
Fibronektyna z ludzkiego osoczaLife Technologies33016-015dodać 5 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 1 mg/ml; podwielokrotność objętości w zależności od zużycia, aby uniknąć nadmiernych cykli zamrażania i rozmrażania
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-1służy do produkcji 10x PBS Przeciwciało
antykortaktynowe 4F11 myszyEMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-1służy do produkcji 10x PBS
NaClRPIS23020służy do wytwarzania 10x PBS bulionu i buforu boranowego
NaOH (1 N)Sigma-AldrichS2770rozcieńczyć ultraczystą wodą do 0,1 N
Nu-Serum (surowica niskobiałkowa)BD Biosciences355500użyć do produkcji podłoża inwadopodiów
ParaformaldehydAcros416785000zazwyczaj należy przygotować 10% zapasu w 1x PBS, przygotować w dygestorium i dodać kilka ml mocnego NaOH, aby łatwo rozpuścić paraformaldehyd, a następnie przywrócić do pH 7,4 za pomocą mocnego HCl)
PBS (sterylnego)Cellgro21-040-CVstosować do hodowli komórkowych
RPMI 1640Cellgro10-040-CVdo wytwarzania invadopodia
Borowodorek soduSigma-Aldrich452882przygotować świeże w dygestorium 1 mg / ml w 1x PBS
Tetrahydrat metaboranu soduSigma-AldrichS0251służy do wytwarzania buforu boranowego
SacharozaRPIS24060zwykle wytwarza 10 ml 1% roztworu sacharozy/1% żelatyny w PBS i przechowuje w temperaturze 4 & st; C (podgrzej PBS, aby łatwo rozpuścić żelatynę)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA16046zrobić 10% zapasu w 1x PBS i użyć bez zmian do usunięcia komórek w teście siły trakcyjnej lub rozcieńczyć 1x PBS do barwienia
nakrywkowe używać

Bibliografia

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572(2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015(2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analizy invadopodiówmigracja komórek nowotworowychsztywność ECMmikroskopia fluorescencyjnaaktywacja szkiełek podstawkowychpowlekanie fibronektynąprzemieszczanie mikrosfergrubość hydrożelu
Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.