Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów jest powszechnie używane do badania funkcji łańcucha transportu elektronów. Opisano metodę uzyskiwania próbek ludzkiego mięśnia obszernego bocznego, izolowanie mitochondriów z minimalnych ilości tkanki mięśni szkieletowych oraz profilowanie respirometryczne na płytkach przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (XF). Porównanie profili respirometrycznych uzyskanych przy użyciu mitochondriów 1,0, 2,5 i 5,0 μg wskazuje, że 1,0 μg jest wystarczające do pomiaru oddychania, a 5,0 μg zapewnia najbardziej spójne wyniki oparte na porównaniu błędów standardowych. Analiza Western blot izolowanych mitochondriów pod kątem markera mitochondrialnego COX IV i markera tkanki niemitochondrialnej GAPDH wskazuje, że zanieczyszczenie niemitochondrialne przy użyciu tego protokołu jest ograniczone. Możliwość badania respirometrii mitochondrialnej w zaledwie 20 mg tkanki mięśniowej pozwala użytkownikom na wykorzystanie indywidualnych biopsji dla wielu punktów końcowych badania w klinicznych projektach badawczych.
Wprowadzenie
Mitochondria są głównymi miejscami produkcji energii w komórce i odgrywają ważną rolę w starzeniu się, jak również w różnych zaburzeniach związanych z wiekiem, takich jak choroby układu krążenia, choroba Alzheimera, cukrzyca, rak i otyłość. Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów zapewnia bezpośrednią analizę funkcji łańcucha transportu elektronów (ETC) i znacząco przyczyniło się do naszego zrozumienia biologii mitochondriów i jej roli w zdrowiu i chorobie. Izolowane mitochondria są wykorzystywane do badania różnych aspektów bioenergetyki, takich jak transport substratu, aktywność syntazy ATP, wyciek protonów itp. Metodologia opisana w tym manuskrypcie została zoptymalizowana, aby umożliwić analizę respirometryczną mitochondriów wyizolowanych z biopsji tkanki mięśni szkieletowych uzyskanych od ludzi. Protokół biopsji opisany w tym manuskrypcji był używany przez nasz personel przez ostatnie 12 lat. Nasza grupa wykonała ponad 700 zabiegów u osób dorosłych w różnym wieku, do 90 roku życia i z różnymi chorobami przewlekłymi, bez żadnych negatywnych problemów związanych z bezpieczeństwem. Kluczowym aspektem tego protokołu jest to, że jest on specjalnie zaprojektowany do wykorzystania minimalnych ilości tkanki, ułatwiając w ten sposób jej wykorzystanie w badaniach klinicznych.
Opracowano różne protokoły izolowania mitochondriów. Fernandez-Vizarra i wsp.W artykule 1,2 opisano metodę izolowania mitochondriów z różnych tkanek szczurów, a także z hodowanych komórek. Garcia-Cazarin i wsp.3 zgłosiły metodę izolowania mitochondriów od mięśni szkieletowych od szczurów i myszy. Metoda izolowania mitochondriów od mózgu szczura została również opisana przez Iglesias-Gonzales i wsp.4 Gross i wsp.5 zgłosiło metodę izolacji mitochondriów przy użyciu barocyklera i/lub niszczarki PCT. Ostatnio Franko i wsp.6 opisało metodę izolowania wysoce wzbogaconych mitochondriów za pomocą kulek magnetycznych anty-TOM22.
Chociaż te protokoły dają doskonałe wyniki, wymagania dotyczące wielkości tkanki są wysokie w porównaniu do metody opisanej w tym manuskrypcie. Na przykład Gross i wsp.5 Zużyto 1,5-1,8 g mięśnia brzuchatego łydki i około 2 g tkanki nerkowej. Podobnie Franco i wsp.6 Użyto 500 mg tkanki wątroby myszy. Z naszego doświadczenia wynika, że typowe plony, których można się spodziewać po przezskórnej biopsji igłowej mięśni szkieletowych (Vastus lateralis) wahają się od 100-200 mg. Możliwość oceny funkcji mitochondriów w 20-50 mg tkanki mięśniowej przy użyciu opisanego tutaj protokołu pozwala użytkownikom na wykonywanie wielu ocen na biopsję i przechowywanie próbek do wykorzystania w przyszłości w innych eksperymentach biologii molekularnej. Jest to kluczowa cecha w badaniach klinicznych i innych badaniach, które wymagają starannego wykorzystania próbek. Należy zauważyć, że wcześniej zamrożone mitochondria nie nadają się do badania sprzężonego oddychania ze względu na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej i utratę aktywności cytochromu C. Nasza metoda została zaadaptowana i zmodyfikowana w stosunku do metody opublikowanej przez Chappella i Perry'ego7.
Korzystając z metod opisanych w tym manuskrypcie, niedawno informowaliśmy, że profil respirometryczny mitochondriów wyizolowanych z ludzkiego Vastus lateralis jest bezpośrednio skorelowany ze zdolnością fizyczną, mierzoną jako prędkość chodu8.
Protokół
UWAGA: Opisany protokół został zatwierdzony przez Institutional Review Board of Wake Forest School of Medicine. Świadoma zgoda została uzyskana w formie pisemnej. Wszyscy uczestnicy byli zdrowymi osobami starszymi (65-79 lat) obojga płci, z BMI w zakresie 23-35.
1. Biopsja mięśni szkieletowych
- Jak opisano wcześniej, 9 osób wykonuje wszystkie biopsje wczesnym rankiem po poście O/N. Poproś badanych, aby powstrzymali się od przyjmowania aspiryny, niesteroidowych leków przeciwzapalnych na receptę i dostępnych bez recepty lub innych związków, które mogą wpływać na krwawienie, płytki krwi lub siniaki na tydzień przed biopsją. Poproś uczestników, aby również powstrzymali się od jakiejkolwiek forsownej aktywności przez co najmniej 36 godzin przed biopsją.
UWAGA: Mięsień uzyskuje się z mięśnia obszernego bocznego za pomocą techniki przezskórnej biopsji igłowej za pomocą igły przezskórnej w znieczuleniu miejscowym z 1% lidokainą. W naszej jednostce badań klinicznych nie wystąpiły żadne powikłania medyczne ani inne zgłaszane zdarzenia niepożądane związane z zabiegiem. - UWAGA: Opisana procedura biopsji jest zaadaptowana z procedury Bergstrom10.
- Krótko mówiąc, podawaj miejscowo 1% lidokainy, uważając, aby nie przeniknąć do mięśni. Następnie odczekaj 10 minut, aby umożliwić wystarczające odrętwienie.
- Wykonaj biopsje z brzucha mięśnia (środkowy obszar mięśnia między przyczepem a początkiem), unikając obszarów podpowięziowych i mięśniowatych.
- Użyj igły przezskórnej (urządzenie wielokrotnego użytku wspomagane ssaniem z bocznym okienkiem tnącym i wewnętrznym cylindrem tnącym) i postępuj zgodnie z powięziowym "trzaskiem" lub oporem powięzi jako przewodnikiem.
- Oszacuj głębokość za pomocą igły anestezjologicznej, a następnie ponownie poczuj ją wąskim ostrzem skalpela i wykonaj 4-5 mm nacięcie przez powięź. Przełóż igłę przez nacięcie, aż zostanie wprowadzona do mięśnia.
- Zbierz wiele próbek z okienkiem obróconym w różnych kierunkach. Zastosuj ciągłe ssanie za pomocą strzykawki o pojemności 60 cm3, jednocześnie przesuwając i wycofując próbki mięśni do igły przezskórnej dwa do czterech razy w różnych kierunkach. Przerwij ssanie i wyjmij igłę.
UWAGA: Każde przejście (włożenie i wyjęcie igły) powinno zająć mniej niż minutę. - Poproś asystenta, aby mocno naciskał na miejsce nakłucia przez 5 minut, aby ustalić hemostazę. Odłącz igłę od rurki ssącej i ostrożnie usuń próbki mięśni z okienka i cylindra.
- Wykonaj drugie przejście, jeśli potrzebujesz więcej mięśni, powtarzając powyższą procedurę.
- Usuń wszelkie widoczne skrzepy krwi z próbki mięśni za pomocą kleszczy, zważ próbkę i natychmiast umieść w probówce zawierającej lodowaty DPBS.
UWAGA: Średnia wydajność przy użyciu tej metodologii wynosi 150 ± 20 mg.
2. Izolacja mitochondrialna
- Świeżo przygotować Chappela-Perry'ego (CP) i roztworu do oznaczania mitochondriów (MAS) (tabela 1) w dniu doświadczenia lub podwielokrotność i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Przygotować związki w dimetylosulfotlenku o stężeniu 2,5 mM i podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć buforu i podwielokrotności złożonych przechowywanych w temperaturze -20 °C w ciągu 2 miesięcy od dnia przygotowania.
- Usunąć widoczną tkankę łączną z próbki za pomocą ostrych nożyczek i pęsety; w razie potrzeby użyć do tego kroku mikroskopu preparacyjnego. Dokładnie umyj próbki 3-4 razy lodowatym buforem DPBS, aby usunąć krew. Próbki należy przechowywać w lodowato zimnym DPBS i przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, uważając, aby nie przekroczyć 45 minut od biopsji. Podejmij środki ostrożności, aby ostrożnie usunąć wszelkie ścięgna lub tkankę tłuszczową z próbki mięśni.
- Natychmiast posiekać tkankę mięśniową na drobne kawałki za pomocą sterylnych nożyczek i zawiesić w 500 μl do 1 ml CPI zawierającej proteinazę (Nagarse) w stężeniu 0,2 mg/g tkanki. Następnie wykonaj 5-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś do lodu.
- Homogenizować tkanki mielone poddane działaniu Nagarse za pomocą automatycznego homogenizatora. Przez cały czas trwania tego procesu próbkę należy przechowywać na lodzie. Homogenizować każdą próbkę tkanki cztery razy, za każdym razem przez impuls trwający 2 sekundy, używając automatycznego homogenizatora przy ustawieniu prędkości 10 000 obr./min. Umyj sondę 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną między tkankami.
- Przemyć homogenizowaną tkankę równą objętością CP I (500 μl do 1 ml) i 2 x objętością CP II (1 ml do 2 ml), a następnie zebrać zawartość do probówki wirówkowej i odwirować przy 600 x g, 4 °C przez 10 min. Przepuścić supernatant przez zwilżoną gazę serową, Zebrać filtrat i wyrzucić osad, usuwając w ten sposób większość frakcji niemitochondrialnych.
3. Mycie mitochondriów
- Odwirować supernatant z powyższego etapu w temperaturze 10 000 x g, 4 °C przez 10 minut. Zawiesić osad w 4 ml buforu CP II i dalej odwirować przy 10 000 x g, 4 °C przez 10 min.
UWAGA: W rzadkich przypadkach poniżej osadu mitochondrialnego tworzy się cienka kulka krwi. W takim przypadku należy usunąć osad mitochondrialny przez delikatne zasysanie buforem CPII. Tego kroku można uniknąć, dokładnie zmywając krew w kroku 2. - Zawiesić otrzymany osad w 2 ml buforu CP I. Na tym etapie należy użyć małej porcji z tej zawiesiny do oceny białka. Zawiesić pozostałą próbkę w buforze CP I i odwirować jak powyżej. Zawiesić ostateczną osadkę w minimalnej ilości (200 μl) roztworu do oznaczania mitochondriów (MAS).
UWAGA: Białko jest oznaczane na tym etapie, ponieważ bufor CP I nie ma BSA, podczas gdy MAS, w którym próbki zostaną później zawieszone, ma w sobie BSA.
4. Oszacuj zawartość mitochondriów, mierząc stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA
UWAGA: Użyj tego stężenia do obliczenia ilości mitochondriów używanych do ładowania na 24-dołkową mikropłytkę do pomiarów respirometrycznych lub do eksperymentów Western blot. Do obliczenia stężenia białka należy wziąć pod uwagę współczynnik rozcieńczenia (10).
5. Wykonaj testy XF zgodnie z opisem Rogers, GW, et al.12
UWAGA: Wizualizuj wskaźnik zużycia O2 (OCR) w pMolach O2/min, czyli bezwzględne poziomy O2 i pH w danych wyjściowych.
- Użyj 1x MAS do przygotowania związków do wstrzyknięcia. Dodać 10-krotne stężenie związków do portów A-D, aby uzyskać końcowe stężenie w następujący sposób: Port A, ADP [adenozyna 5' –difosforan, 2 mM, 50 μl]; port B, oligomycyna (2 μM, 55 μl); port C, FCCP [4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu, 6 μM, 60 μl]; i port D, 2 μM antymycyny-A (65 μl). Przygotuj wystarczającą objętość związków na wymaganą liczbę studzienek.
- Określ optymalną ilość mitochondriów przez miareczkowanie. Na przykład załaduj 1,0 μg, 2,5 μg i 5,0 μg mitochondriów na studzienkę w objętości 50 μl lodowatego substratu zawierającego 1x MAS. Aby zminimalizować zmienność między studzienkami, najpierw rozcieńczyć 10x mitochondria w zimnym 1x MAS + substracie. Następnie dostarczyć 50 μl tej zawiesiny do każdej studzienki (z wyjątkiem studzienek korekcyjnych tła).
- Odwirować płytkę przy 2 000 x g, 20 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu delikatnie dodać 450 μl 1x MAS + bursztynian (10 mM) i rotenon (2 μM) (warunki początkowe; patrz poniżej) do każdej studzienki. Zobacz mitochondria pod mikroskopem, aby zapewnić jednorodne przyleganie do dołka przed przeniesieniem płytki do analizatora XF.
UWAGA: Zastosowane warunki początkowe będą zależeć od tego, czy oddychanie jest napędzane przez ETC complex I, czy complex II. W przypadku oddychania sterowanego przez złożone II, jako warunki początkowe należy użyć bursztynianu (10 mM) i rotenonu (2 μM). Rotenon blokuje kompleks I, a bursztynian stanowi paliwo dla kompleksu II (dehydrogenazy bursztynianowej). Do badania oddychania napędzanego przez kompleks I należy użyć pirogronianu i jabłczanu, każdy o końcowym stężeniu 5 mM lub glutaminianu i jabłczanu o końcowym stężeniu 10 mM jako warunków początkowych. Te ostatnie mogą pomóc w rozróżnieniu dysfunkcji między cyklem kwasów trikarboksylowych a transportem substratu. Aby zbadać oddychanie napędzane zarówno przez kompleks I, jak i kompleks II, należy uwzględnić pirogronian i bursztynian bez rotenonu lub jabłczanu jako warunki początkowe. Użyj palmitoilokarnityny jako substratu do β-oksydacji. - Sekwencyjnie mierz oddychanie mitochondrialne w czasie rzeczywistym za pomocą respirometru, programując go zgodnie z wcześniejszym opisem 12. Użyj ustawień respirometru podanych w tabeli 2.
UWAGA: Krótkie wyjaśnienie różnych stanów oddychania mitochondrialnego jest następujące: - Stan 2 = stan sprzężony z obecnym substratem; Stan 3 = oddychanie fosforylujące w obecności nasycającego ADP; Stan 4o = oddychanie niefosforylujące indukowane przez oligomycynę; Stan 3u = maksymalne oddychanie niesprzężone stymulowane przez FCCP rozprzęgacza; Resztkowe oddychanie niemitochondrialne = oddychanie po inhibicji kompleksu III przez antymycynę-A. Należy również zwrócić uwagę, że długość pomiaru OCR w połączeniu ze stężeniem mitochondriów może wpływać na dane poprzez wyczerpywanie się tlenu w okresach pomiaru.
6. Western Blot
UWAGA: Określ marker mitochondrialny COX IV i GAPDH całej tkanki za pomocą Western blot, aby zapewnić wzbogacenie mitochondriów w końcowej próbce
- Oddziel wyizolowane mitochondria i ekstrakt z całych tkanek za pomocą 12% żeli poliakryloamidowych z dodecylosiarczanu sodu.
- Przenieś białka na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF).
- Inkubować z przeciwciałem COX IV (1:20 000), a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP). W celu oznaczenia GAPDH należy usunąć blot i sondę z przeciwciałem monoklonalnym GAPDH (1:2,000).
UWAGA: Jeśli różnice w zanieczyszczeniu ER są niepokojące, uwzględnij w analizie markery ER, takie jak ERp72, kalneksyna lub kalretykulina.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia szczegółowy schemat blokowy całego protokołu.
Profile Western blot COX IV/GAPDH (Rysunek 2>) przedstawiają ekspresję białka mitochondrialnego COX IV oraz markeru pozamitochondrialnego GAPDH. Ekspresja zarówno COX IV, jak i GAPDH jest widoczna w lizacie całego mięśnia. Po wyizolowaniu mitochondriów przy użyciu techniki opisanej w niniejszym protokole prążki COX IV pozostają widoczne, podczas gdy GAPDH nie występuje przy tym samym czasie ekspozycji. Dłuższe czasy ekspozycji mogą ujawnić słaby prążek GAPDH. Analizy te wskazują, że wyizolowane mitochondria charakteryzują się minimalnym zanieczyszczeniem frakcjami pozamitochondrialnymi. Ponadto ekspresja COX IV w wyizolowanych mitochondriach jest spójna pomiędzy próbkami.
Rysunek 3 przedstawia typowe profile respirometryczne napędzane przez kompleks II (bursztynian i rotenon) z zastosowaniem 1,0 μg, 2,5 μg i 5,0 μg mitochondriów. Zgodnie z oczekiwaniami, całkowite OCR wzrasta wraz ze zwiększoną ilością mitochondriów. Obliczony współczynnik kontroli oddechowej (RCR) dla tego testu wynosi 7,95, co wskazuje na wysoką jakość preparatu mitochondrialnego. Co więcej, OCR w stanie 3u jest nieco wyższy niż w stanie 3, co potwierdza jakość mitochondriów.
Aby porównać spójność wyników podczas profilowania różnych ilości mitochondriów, przeprowadzono analizę wariancji (ANOVA) i obliczono sumę kwadratów (SS) jako rzeczywiste wartości wariancji, wykorzystując 1,0 µg, 2,5 µg oraz 5,0 µg mitochondriów naniesionych na dołek (Rysunek 4). Wartości SS przedstawiono dla stanu 2, stanu 3, stanu 3u, antymycyny A oraz RCR. W przypadku pomiarów dla stanu 2 i stanu 3 jednoczynnikowa analiza ANOVA była statystycznie istotna (odpowiednio p<0,01 i p<0,05). Podobnie jednoczynnikowa analiza ANOVA była statystycznie istotna dla antymycyny i RCR (odpowiednio p<0,01 i p<0,0001). Nie stwierdzono istotnych różnic dla stanu 3u pomiędzy grupami. Wyniki te wskazują, że 5,0 μg mitochondriów na dołek zapewniło najniższą wartość SS w porównaniu z innymi stężeniami i jest to optymalna ilość do zastosowania w systemie XF 24 dla naszej populacji uczestników.
Rysunek 5 służy jako pomoc w określeniu spodziewanej ilości białka mitochondrialnego na podstawie początkowej wielkości próbki mięśnia. Zgodnie z oczekiwaniami, występuje silna korelacja między ilością przetworzonego mięśnia (mg) a całkowitą zawartością białka mitochondrialnego (mg) w końcowej próbce.
| bufor Chappela-Perry'ego I (CPI) | |
| Chemiczny | Stężenie |
| KCl | 100 mM |
| MOPS | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| MgSO₄4 | 5 mM |
| ATP | 1 mM |
| pH | 7.4 |
| bufor Chappela-Perry’ego II (CPII) | |
| Chemiczny | Stężenie |
| KCl | 100 mM |
| MOPS | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| MgSO₄4 | 5 mM |
| ATP | 0,2 mM |
| BSA wolna od kwasów tłuszczowych | 0.50% |
| pH | 7.4 |
| Roztwór do analizy mitochondrialnej (MAS) (2X) | |
| Chemiczny | Stężenie |
| Sacharoza | 35 mM |
| Mannitol | 110 mM |
| KH2PO4 | 2,5 mM |
| MgCl₂2 | 2,5 mM |
| HEPES | 1,0 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| BSA wolna od kwasów tłuszczowych | 0.10% |
| pH | 7.4 |
| Roztwór do analizy mitochondrialnej (MAS) z warunkami początkowymi dla kompleksu II | |
| Chemiczny | Stężenie |
| 1X MAS | |
| Bursztynian | 10 mM |
| Rotenon | 2 μM |
| pH | 7.4 |
| Roztwór do analizy mitochondrialnej (MAS) z warunkami początkowymi dla kompleksu I | |
| Chemiczny | Stężenie |
| 1X MAS | |
| Piwian | 5 mM |
| Kwas jabłkowy | 5 mM |
| pH | 7.4 |
| *Wszystkie bufory należy przygotować w wodzie dejonizowanej | |
Tabela 1. Składy roztworów i buforów.
| Kroki protokołu | ||
| Rozpocznij procedurę | ||
| Polecenie | Czas (min) | Port |
| Kalibrować | 0.00 | |
| Czekaj | 10.00 | |
| Wymieszaj | 1.00 | |
| Czekaj | 3.00 | |
| Wymieszać | 1.00 | |
| Oczekiwanie | 3.00 | |
| Wymieszaj | 0.50 | |
| Pomiar | 3.00 | |
| Wymieszać | 1.00 | |
| Pomiar | 3.00 | |
| Wymieszać | 0.50 | |
| Wstrzyknąć | A | |
| Wymieszać | 1.00 | |
| Pomiar | 6.00 | |
| Wymieszać | 1.00 | |
| Wstrzyknąć | B | |
| Wymieszaj | 1.00 | |
| Pomiar | 3.00 | |
| Wymieszać | 1.00 | |
| Wstrzyknąć | C | |
| Wymieszać | 1.00 | |
| Pomiar | 3.00 | |
| Wymieszać | 1.00 | |
| Wstrzyknąć | D | |
| Wymieszaj | 1.00 | |
| Pomiar | 3.00 | |
| Koniec protokołu | ||
Tabela 2. Ustawienia cyklu mieszania, pomiaru i ponownego mieszania dla respirometru.
Rysunek 1. Schemat całego protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. Reprezentatywny Western blot dla całej tkanki mięśnia szkieletowego oraz wyizolowanych mitochondriów. Ekstrakt z całej tkanki oraz wyizolowane mitochondria poddano immunoblottingowi z użyciem przeciwciała przeciwko COX IV jako markera mitochondrialnego oraz przeciwciała przeciwko GAPDH jako kontroli niemitochondrialnej. W wyizolowanych mitochondriach nie zaobserwowano prążka GAPDH, co wskazuje na niewielkie lub brak zanieczyszczeń z źródeł niemitochondrialnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3. Reprezentatywny profil respirometryczny mitochondriów wyizolowanych z ludzkiego mięśnia Vastus lateralis. W badaniu tym zastosowano trzy stężenia wyizolowanych mitochondriów: 5.0 μg, 2.5 μg oraz 1.0 μg. Końcowe stężenia związków po wstrzyknięciu przez porty wynosiły: 2 mM ADP (port A); 2 μM oligomycyny (port B); 6 μM FCCP (port C) oraz 2 μM antymycyny A (port D). Obliczony współczynnik RCR dla tego pomiaru wyniósł 7.95. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4. Suma kwadratów. Suma kwadratów dla różnych stanów oddychania mitochondrialnego i RCR z zastosowaniem 5,0 μg, 2,5 μg i 1,0 μg mitochondriów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5. Może ona służyć jako wskazówka do oszacowania ilości białka mitochondrialnego, jakiej można się spodziewać na podstawie początkowej masy próbki mięśnia. Analiza regresji: ilości mięśnia (mg) i całkowitej wydajności białka mitochondrialnego (mg). Zgodnie z oczekiwaniami występuje bezpośrednia dodatnia korelacja między ilością mięśnia a całkowitą ilością uzyskanego białka mitochondrialnego.
Dyskusja
Izolowane mitochondria są często wykorzystywane w badaniach, które badają rolę funkcji ETC, a także innych czynności mitochondrialnych, w tym transportu substratu i funkcji cyklu TCA. Testy respirometryczne z wykorzystaniem izolowanych organelli pozwalają na bezpośrednie zbadanie podstawowych procesów fosforylacji oksydacyjnej i wewnętrznych właściwości ETC. Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów w porównaniu z całymi komórkami lub przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi ma zalety stosunkowo łatwej interpretacji danych i braku "interferencji" z procesami niemitochondrialnymi lub zmianami w masie/biogenezie mitochondriów. Normalizacja danych opiera się na zawartości białka mitochondrialnego, co pozwala na proste porównanie mitochondriów między próbkami. Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów jest preferowanym podejściem, gdy celem badania jest określenie mechanizmów leżących u podstaw i identyfikacja konkretnych celów, takich jak składniki/kompleksy ETC lub mechanizmy transportu mitochondrialnego.
Opisano protokół biopsji mięśni i izolacji funkcjonalnych mitochondriów z małych próbek tkanek. Metoda ta daje powtarzalne wyniki między użytkownikami dzięki zastosowaniu automatycznego homogenizatora w porównaniu z ręcznymi homogenizatorami dounce. Izolację mitochondriów można przeprowadzić przy użyciu zaledwie 20 mg tkanki mięśniowej. Ilość wyizolowanych mitochondriów, którą można uzyskać z tej wielkości próbki, jest wystarczająca do przeprowadzenia respirometrii na płytkach Seahorse, pozostawiając nadwyżkę mitochondriów do innych eksperymentów i przechowywania do dalszych analiz molekularnych. Można zauważyć, że metodę tę można przełożyć na XF 96, gdzie można zastosować jeszcze mniejsze ilości mitochondriów (1-2 μg na studzienkę).
Kilka protokołów izolacji mitochondriów opiera się na homogenizatorach z odbiciem w celu początkowego rozerwania tkanki. Wadą tej metody jest praktyczny charakter początkowej homogenizacji tkanek. Siła i prędkość tłuczka w homogenizatorze może się znacznie różnić w zależności od operatora 6. Może to powodować różnice między eksperymentami, a także różnice między laboratoriami i prowadzić do trudności w porównywaniu danych między eksperymentami. Jest to szczególnie niepokojące w badaniach interwencyjnych na ludziach, gdy dane od uczestników są zbierane w oddzielnych punktach czasowych, zwykle przed i po leczeniu, a potencjalnie w wielu miejscach. Używamy zautomatyzowanego homogenizatora, aby uzyskać bardziej spójne podejście, które daje bardziej powtarzalne wyniki przy ograniczonej zmienności między osobami. Szybkość przygotowania sprawia, że podejście to nadaje się również do obsługi wielu próbek w tym samym czasie. Zazwyczaj w ciągu jednego dnia można przeprowadzić do trzech eksperymentów.
Potencjalne ograniczenia opisanej tutaj techniki wynikają z zastosowania izolowanych organelli i zastosowania formatu opartego na płytce. Na przykład Picard i wsp. wykazały, że izolowane mitochondria posiadają cechy funkcjonalne, które zasadniczo różnią się od cech nienaruszonych mitochondriów w przepuszczalnych włóknach mięśniowych. Zasugerowali, że techniki izolacji mitochondriów skutkują zmienionymi funkcjami bioenergetycznymi, takimi jak znacznie zwiększony RCR w porównaniu z przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi, którym towarzyszy większa produkcja reaktywnych form tlenu 13. W porównaniu z przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi, izolacja mitochondriów wymaga dłuższego czasu przygotowania. Ponadto utrata zawartości komórkowej zmniejsza znaczenie fizjologiczne, coś, co jest zatrzymywane w całych komórkach, a nawet we włóknach przepuszczalnych. Zastosowanie respirometrii opartej na płytce z opisaną techniką pozwala na powtórzenie próbki. Jednak mitochondria muszą przylegać do dna każdej studzienki. Ta konfiguracja różni się od ich normalnego środowiska i może wpływać na charakterystykę funkcjonalną. Ponadto należy zauważyć, że stosując ten protokół do izolacji mitochondriów, w preparacie mitochondrialnym może nadal występować zanieczyszczenie retikulum endoplazmatycznego (ER). Różnice w zanieczyszczeniu ER mogą wpływać na określenie wydajności mitochondriów i wpływać na wyniki.
Podsumowując, w badaniu przedstawiono dane, które potwierdzają, że mitochondria wyizolowane z tkanek za pomocą tej procedury są funkcjonalnie aktywne i mogą być wykorzystywane do badań/zastosowań, które wymagają wysokiej jakości izolowanych mitochondriów z minimalnej ilości próbek mięśni szkieletowych. Zaletą tej metody jest to, że: i) możliwe jest wyizolowanie mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych, ii) procedura jest szybka, iii) dzięki technologii opartej na płytkach możliwe jest badanie wielu próbek w tym samym czasie, oraz iv) po teście bioenergetycznym jest wystarczająca ilość nadwyżek tkanek i izolowanych mitochondriów do przechowywania próbki i innych badań biologii molekularnej.
Oświadczenia
Autor, George Rogers, jest pracownikiem firmy Seahorse Bioscience, która produkuje instrument użyty w tym artykule. Opłaty za otwarty dostęp zostały wsparte przez Seahorse Biosciences.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr Marc Liesa, Boston University School of Medicine, za pomocne dyskusje; Pani Karin Murphy, Pani Heather Gregory i Panu Johnowi Stone'owi, wszyscy z Wake Forest School of Medicine, za pomocną pomoc techniczną w opracowaniu tego protokołu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt | |||
| Homogenizator Bio-Gen PRO200 | BioExpress | ||
| Eppendorf Wirówka 5804 R | Fisher Scientific | ||
| Deepwell późny wirnik | Fisher Scientific | ||
| 6 mm University College Hospital | Needle Cadence | ||
| 60 cc | |||
| (Genios-basic) | |||
| Analizator Seahorse XF 24-3 | Seahorse Biosciences, Inc. | ||
| System żelu białkowego | Life Technologies (Invitrogen) | ||
| Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | ||
| Zespół aparatu fotograficznego Kodak | Carestream Health, Inc | ||
| Materiały eksploatacyjne | |||
| XF24 V7 Mikropłytka do hodowli komórkowej i wkład z czujnikiem XF24 | Seahorse Bioscience | 100850-001 | |
| 100867-100 | |||
| Wodorotlenek potasu (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 | |
| Kwas solny (HCl) | Acros | 12421-0010 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco | Lonza | 17-512F | |
| Chlorek potasu (KCl) | Fisher Scientific | P333 | |
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Siarczan magnezu (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 | |
| ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 | |
| Bez kwasów tłuszczowych BSA | Calbiochem | 126575 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich Co | S0389 | |
| Proteinaza bakteryjna | Sigma-Aldrich Co | P-8038 | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnez chlorek (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 | |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Sigma-Aldrich Co | PI23227 | |
| Kwas bursztynowy* | Sigma-Aldrich Co | S3674 | |
| Kwas pirogronowy* | Sigma-Aldrich Co | P5280 | |
| Kwas jabłkowy* | Sigma-Aldrich Co | 2288 | |
| ADP(K+ sól)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 | |
| XF Zestaw do testowania wysiłków mito komórkowych | Seahorse Biosciences | 101706 | |
| Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 | |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX | |
| Membrany transferowe immobiliny (0,45 um) | Bufor do biegania Millipore | IPVH20200 | |
| MOPS SDS (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 | |
| Bufor transferowy NuPAGE (20X)-1 litr | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 | |
| Przeciwciała pierwszorzędowe (mAB przeciwko VDAC1/Porynie) | Abcam | ab14734 | |
| Przeciwciała pierwszorzędowe (mAB przeciwko GAPDH) | Abcam | ab9484 | |
| Anty-mysie IgG (koza), znakowane HRP | PerkinElmer | NEF822E001EA | |
| Anti-Rabbit IgG (koza), znakowany HRP | PerkinElmer | NEF812E001EA | |
| *ADP, kwas bursztynowy, kwas pirogronowy i kwas jabłkowy należy dostosować do pH 7,4 tylko za pomocą KOH |
Bibliografia
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392(2013).
- Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
- Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).
- Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746(2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317(2011).
Przedruki i uprawnienia
