Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Arboryzacja dendrytyczna okazała się wiarygodnym markerem do badania strukturalnej i funkcjonalnej integralności neuronów. Rzeczywiście, złożoność i zakres arboryzacji dendrytycznej dobrze koreluje z plastycznością synaptyczną w tych komórkach. Potrzebna jest wiarygodna metoda oceny arboryzacji dendrytycznej, aby scharakteryzować szkodliwy wpływ zaburzeń neurologicznych na te struktury i określić efekty interwencji terapeutycznych. Jednak kwantyfikacja tych struktur okazała się ogromnym zadaniem, biorąc pod uwagę ich złożony i dynamiczny charakter. Na szczęście wyrafinowane techniki obrazowania można połączyć z konwencjonalnymi metodami barwienia w celu oceny stanu arboryzacji dendrytycznej, zapewniając bardziej wiarygodny i szybszy sposób oceny. Poniżej znajduje się przykład, w jaki sposób te techniki obrazowania zostały połączone z metodami barwienia w celu scharakteryzowania arboryzacji dendrytycznej u myszy typu dzikiego. Te uzupełniające się metody obrazowania można wykorzystać do jakościowej i ilościowej oceny arboryzacji dendrytycznej, która obejmuje dość szeroki obszar w regionie hipokampa.
Wprowadzenie
Dynamiczne zmiany w liczbie i strukturze synaps są cechami charakterystycznymi rozwoju, starzenia się i licznych zaburzeń neurodegeneracyjnych1-3. Zdolność neuronów do odbierania i integrowania informacji synaptycznych zależy od morfologii dendrytycznej i dynamicznych zmian w połączeniach synaptycznych. Rzeczywiście, istnieje pozytywna korelacja między kolcem dendrytycznym a liczbą synaps, które wpływają na funkcje poznawcze4. Nic więc dziwnego, że zmniejszenie liczby kolców dendrytycznych wiąże się z dysfunkcją poznawczą w wielu zaburzeniach neurologicznych5-7, co powoduje duże zainteresowanie kwantyfikacją kolców dendrytycznych. Niem....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami w Systemie Opieki Zdrowotnej dla Weteranów w Palo Alto.
1. Barwienie metodą Golgiego-Coxa
- Ekstrakcja i barwienie mózgu
- Pierwszego dnia głęboko znieczulij myszy 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny przed eutanazją przez wykrwawienie.
- Ostrożnie usuń kalwarię i wypreparuj mózg.
- Najpierw usuń skórę na szczycie czaszki, umieszczając zakrzywione nożyczki na szczycie móżdżku i delikatnie przeciąć kalwarię równolegle do środkowej bruzdy z czubkiem nożyczek skierowanym ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zakres arboryzacji istniejących i nowo powstałych komórek ziarnistych zakrętu zębatego analizowano u myszy typu dzikiego, stosując barwienie Golgi-Cox lub DCX (Rysunek 1). Ustalono, że segmenty dendrytów komórek DCX-dodatnich mają długość od 13 do 36 mikronów. Rozkład normalny długości dendrytów sprawdzono za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa (D = 0.1217, p <0.01, p Lilieforsa <0.001; Rysunki 4 i 5).
W analizie długości segmentów w zależ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisano dwie metody ilościowego określenia zakresu arboryzacji dendrytycznej w dojrzałych i nowo narodzonych neuronach przy użyciu konwencjonalnych metod barwienia w połączeniu z RTI i EDFI. Akwizycja obrazów neuronów o wysokiej rozdzielczości stanowi niezwykle przydatną metodę testowania szkodliwych skutków zaburzeń neurodegeneracyjnych, a co za tym idzie, zapewnia środki do oceny strategii terapeutycznych ukierunkowanych na neurony hipokampa.
Podczas gdy metoda RTI została wyko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Opłaty za publikację tego artykułu są sponsorowane przez MBF Bioscience.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty z Fundacji LuMind, Research Down Syndrome i Alzheimer's Association (AS). CP był częściowo wspierany przez grant na rozwój wydziału z College of Nursing and Health Professions na Uniwersytecie Stanowym Arkansas.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zmodyfikowany roztwór do barwienia Golgiego-Coxa | Weill Cornell Medical College | NA | sklep pod adresem 4° C do użycia |
| 1x Roztwór do opracowywania (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | sklep pod adresem 4° C do użycia |
| 30% sacharozy, | Sigma | CAS # 57-50-1 | zrobić świeże w ddH2O |
| 0,3% żelatyna | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Stopniowane roztwory etanolu (20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) biały | Mikroskopia elektronowa Sciences | 71869-10 | NA |
| Szkiełko nakrywkowe 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Przeciwciało | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | Numer CAS 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | Numer CAS 77-86-1 | nie |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Mikroskop | Nikon | Eclipse 80i | |
| Aparat cyfrowy | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12-bitowy aparat | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Edytor kompozytów obrazu | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
Bibliografia
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
