Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar krzywej ciśnienie-objętość w płucach myszy

18.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52376

⸱

27 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1Environmental Health Sciences, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół prostego i wiarygodnego pomiaru krzywej ciśnienia i objętości płuc u myszy, pokazując, że jest ona wystarczająco czuła, aby wykryć fenotypowe zmiany miąższowe w dwóch powszechnych patologiach płuc, zwłóknieniu płuc i rozedmie płuc. Ta metryka zapewnia sposób na ilościowe określenie zmian strukturalnych płuc wraz z rozwijającą się patologią.

Streszczenie

W ostatnich dziesięcioleciach mysz stała się głównym zwierzęcym modelem różnych chorób płuc. W modelach rozedmy płuc lub zwłóknienia zasadnicze zmiany fenotypowe najlepiej ocenić poprzez pomiar zmian elastyczności płuc. Aby jak najlepiej zrozumieć konkretne mechanizmy leżące u podstaw takich patologii u myszy, konieczne jest wykonanie pomiarów funkcjonalnych, które mogą odzwierciedlić rozwijającą się patologię. Chociaż istnieje wiele sposobów pomiaru elastyczności, klasyczną metodą jest krzywa całkowitego ciśnienia w płucach (PV) wykonana w całym zakresie objętości płuc. Pomiar ten został wykonany na płucach dorosłych osobników prawie wszystkich gatunków ssaków sprzed prawie 100 lat, a takie krzywe PV odegrały również ważną rolę w odkryciu i zrozumieniu funkcji surfaktantu płucnego w rozwoju płuc płodu. Niestety, takie całkowite krzywe PV nie zostały powszechnie opisane u myszy, mimo że mogą dostarczyć użytecznych informacji na temat makroskopowych skutków zmian strukturalnych w płucach. Chociaż czasami podaje się częściowe krzywe PV mierzące tylko zmiany objętości płuc, bez pomiaru objętości bezwzględnej, nieliniowy charakter całkowitej krzywej PV sprawia, że te częściowe krzywe są bardzo trudne do interpretacji. W niniejszym badaniu opisano ustandaryzowany sposób pomiaru całkowitej krzywej fotowoltaicznej. Następnie przetestowaliśmy zdolność tych krzywych do wykrywania zmian w strukturze płuc myszy w dwóch powszechnych patologiach płuc, rozedmie płuc i zwłóknieniu. Wyniki wykazały znaczące zmiany w kilku zmiennych zgodnych z oczekiwanymi zmianami strukturalnymi w tych patologiach. Ten pomiar krzywej PV płuc u myszy zapewnia zatem prosty sposób monitorowania postępu zmian patofizjologicznych w czasie i potencjalnego efektu procedur terapeutycznych.

Wprowadzenie

Mysz jest teraz głównym modelem zwierzęcym różnych chorób płuc. W modelach rozedmy płuc lub zwłóknienia zasadnicze zmiany fenotypowe najlepiej ocenić, mierząc zmiany elastyczności płuc. Chociaż istnieje wiele sposobów pomiaru elastyczności, klasyczną metodą jest krzywa całkowitego ciśnienia i objętości (PV) mierzona od objętości resztkowej (RV) do całkowitej pojemności płuc (TLC). Pomiar ten został wykonany na płucach dorosłych osobników prawie wszystkich gatunków ssaków sprzed prawie 100 lat1-3. Takie krzywe PV odegrały również ważną rolę w odkryciu i zrozumieniu funkcji surfaktantu płucnego w rozwoju płucpłodu 4-7. Pomimo znaczenia krzywej PV jako pomiaru fenotypu płuc, nie ma ustandaryzowanego sposobu wykonania tego pomiaru. Zostało to zrobione po prostu poprzez napełnianie i opróżnianie płuc za pomocą dyskretnych kroków (czekanie zmienny czas na wyrównanie po każdym) lub za pomocą pomp, które mogą w sposób ciągły napełniać i opróżniać płuca. Krzywa PV jest często wykonywana w zakresie objętości od zera do pewnej pojemności płuc zdefiniowanej przez użytkownika, ale czas trwania każdej pętli objętości ciśnienia zgłaszanej przez różne laboratoria był niezwykle zmienny, wahając się od kilku sekund8 dogodzin 2. Niektórzy badacze odnoszą się do tej całkowitej krzywej PV płuc jako statycznej lub quasistatycznej, ale są to terminy jakościowe, które oferują niewielki wgląd i nie są tutaj używane. Ponadto krzywa PV nie została powszechnie opisana u myszy, mimo że może dostarczyć użytecznych informacji na temat makroskopowych skutków zmian strukturalnych w płucach.

Kilka problemów spowodowało zmienność w pozyskiwaniu krzywych PV, w tym: 1) stopa inflacji i deflacji; 2) skoki ciśnienia dla inflacji i deflacji; oraz 3) środki do wyznaczenia bezwzględnego pomiaru objętości płuc. W przedstawionej tu metodzie wybrano szybkość 3 ml/min jako kompromis, która nie była zbyt krótka, aby odzwierciedlić dynamiczną elastyczność związaną z normalną wentylacją i nie była zbyt niska, aby pomiar był niepraktyczny, szczególnie w przypadku badania dużych kohort. Ponieważ nominalna całkowita pojemność płuc u zdrowej myszy C57BL/6 wynosi około 1,2 ml9, szybkość ta zazwyczaj pozwala na wykonanie dwóch pełnych zamkniętych pętli PV w ciągu około 1,5 minuty.

W obszernej literaturze, w której opisano krzywe PV, szczytowe ciśnienie napompowania było niezwykle zmienne, wahając się od 20 do ponad 40 cm H2O. Część tej zmienności może być związana z gatunkami, ale głównym celem ustalenia górnej granicy ciśnienia dla krzywych PV jest napompowanie płuc do całkowitej pojemności płuc (TLC), lub maksymalnej objętości płuc. TLC u ludzi jest definiowana przez maksymalny dobrowolny wysiłek, jaki może podjąć jednostka, ale niestety nigdy nie można tego powielić w żadnym modelu zwierzęcym. W związku z tym maksymalna objętość w eksperymentalnych krzywych PV jest określana przez maksymalne ciśnienie arbitralnie ustawione przez badacza. Celem jest ustawienie ciśnienia w miejscu, w którym krzywa PV jest płaska, ale niestety kończyna inflacji krzywej PV płuc ssaków nigdy nie jest płaska. Tak więc większość badaczy ustawia ciśnienie, w którym krzywa inflacji zaczyna się znacznie spłaszczać, zwykle 30 cm H2O. Jednak u myszy krzywa PV jest jeszcze bardziej złożona z podwójnym garbem na kończynie inflacji, a ta krawędź inflacji często nadal rośnie stromo przy 30 cm H2O10, więc 30 nie jest dobrym punktem końcowym dla krzywej PV. Z tego powodu używamy 35 cm H2O jako granicy ciśnienia dla mysiej krzywej PV, czyli ciśnienia, przy którym kończyny napompowania wszystkich badanych przez nas szczepów zaczynają się spłaszczać.

Ponieważ krzywa PV sama w sobie jest bardzo nieliniowa, wygląd pętli PV będzie zależał od objętości, od której zaczyna się krzywa. Niektóre komercyjne respiratory pozwalają użytkownikom na wykonywanie dużych pętli fotowoltaicznych, zaczynając od FRC, ale jeśli objętość FRC jest nieznana, niemożliwe jest zinterpretowanie zmian w takiej krzywej PV z jakąkolwiek patologią, ponieważ zmiany te mogą po prostu wynikać ze zmiany objętości początkowej, a nie zmian strukturalnych w płucach. Tak więc bez bezwzględnego pomiaru objętości krzywe fotowoltaiczne są prawie niemożliwe do zinterpretowania, a tym samym mają niewielką użyteczność. Chociaż istnieje kilka sposobów pomiaru objętości płuc, są one często kłopotliwe i wymagają specjalnego sprzętu. W opisanym tutaj prostym podejściu krzywa PV zaczyna się przy zerowej objętości po procedurze odgazowania in vivo.

Podsumowując, ten artykuł demonstruje prostą metodę standaryzacji pomiaru krzywej PV płuc w płucu myszy i definiuje kilka wskaźników, które można obliczyć na podstawie tej krzywej, a które są powiązane ze strukturą płuc. Krzywa PV zapewnia zatem test czynnościowy płuc, który ma bezpośrednie zastosowanie w wykrywaniu fenotypowych zmian strukturalnych u myszy z powszechnymi patologiami płuc, takimi jak rozedma płuc i zwłóknienie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa zatwierdził wszystkie protokoły dotyczące zwierząt.

1. Wyposażenie

Konfiguracja systemu kompozytowego, gotowa do pomiaru krzywej PV, jest pokazana na rysunku 1.

  1. Pomiar objętości:
    1. Generuj stałą szybkość pompowania i opróżniania za pomocą pompy strzykawkowej z przełącznikiem, który pozwala użytkownikowi szybko odwrócić pompę po osiągnięciu limitów ciśnienia. W przypadku mysich krzywych PV należy użyć bardzo lekko natłuszczonej szklanej strzykawki o pojemności 5 ml z początkową objętością (przed napompowaniem) ustawioną na 3 ml powietrza. 3 ml jest wystarczająco duże, aby zmierzyć objętość w prawie wszystkich krzywych PV myszy.
    2. Zmierzyć objętość dostarczaną przez pompę, podłączając liniowy transformator różnicowy do obudowy pompy, z małym prętem czujnika podłączonym do ruchomego tłoka strzykawki.
      Uwaga: Empiryczny sposób korygowania sprężania gazu w systemie jest opisany w sekcji Rejestracja krzywej fotowoltaicznej.
  2. Pomiar ciśnienia:
    1. Użyj standardowego, niedrogiego manometru o zakresie 0-60 cm H2O (0-1 PSI).
  3. Pomiar rejestrujący:
    1. Aby zarejestrować krzywą PV, użyj dowolnego rejestratora cyfrowego z funkcją XY (np. PowerLab). Ustaw jeden kanał, aby rejestrować skorygowany sygnał objętościowy, a drugi kanał, aby rejestrować ciśnienie przezpłucne (Ptp), aby narysować wykres krzywej PV. Użyj przedwzmacniacza mostkowegoamplifier, który łączy się z głównym Powerlabem, aby zmierzyć ciśnienie. Skalibruj kanał ciśnieniowy od 0-40 cm H2O i skalibruj kanał objętościowy od 0-3 ml.

2. Poprawka dla kompresji gazu

Uwaga: Jest to krytyczny początkowy krok w konfiguracji, ponieważ wraz ze wzrostem ciśnienia, objętość gazu maleje, a tym samym objętość powietrza dostarczanego do myszy będzie coraz mniejsza niż przemieszczenie lufy strzykawki.

  1. Zamknij kurek, który połączy instalację fotowoltaiczną z płucami, aby żaden gaz nie mógł opuścić instalacji. Rozpocznij infuzję i obserwuj, czy skorygowany kanał objętościowy na rejestratorze wykazuje jakiekolwiek mierzalne zmiany wraz ze wzrostem ciśnienia do około 40 cm H2O. Jeśli tak, to popraw jak w kolejnych krokach.
    1. Skorekować sprężanie gazu empirycznie, odejmując od pomiaru przemieszczenia tłoka (tj. nieskorygowanej objętości) składnika proporcjonalnego do ciśnienia napompowania. Zrób to na kanale Powerlab (zwanym Vc), aby pokazać sygnał głośności pomniejszony o współczynnik pomnożony przez ciśnienie.
    2. Określ współczynnik w równaniu. Najpierw zgadnij, włącz nagranie wykresu i uruchom pompę. Ponieważ rurka do pompowania jest uszczelniona, wyreguluj mnożnik współczynnika ciśnienia, aby kanał Vc wskazywał zero, gdy ciśnienie wzrasta z 0-40 cm H2O. Jeśli idzie w górę lub w dół, po prostu dostosuj współczynnik korekcyjny, aż pozostanie płaski w tym zakresie ciśnienia. Ten współczynnik korekcyjny będzie zawsze taki sam, jeśli ta sama objętość początkowa 3 ml w strzykawce nie zostanie zmieniona.

3. Testy eksperymentalne na myszach

  1. Procedura pomiaru krzywej PV u myszy. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
    1. Myszy należy znieczulić (myszy C57BL/6 w wieku 6-12 tygodni) ketaminą (90 mg/kg) i ksylazyną (15 mg/kg) i potwierdzić znieczulenie przez brak ruchu odruchowego.
      Uwaga: Krzywą PV można ukończyć u znieczulonych myszy w czasie krótszym niż 10 minut i jest to procedura terminalna.
    2. Tracheostomia myszy za pomocą kaniuli igłowej 18 G. Zrób to, wykonując małe nacięcie w skórze pokrywającej tchawicę, lokalizując tchawicę, a następnie wykonując małą szczelinę w tchawicy, w którą można wprowadzić igłę. Zabezpiecz kaniulę, wiążąc ją nitką.
    3. Pozwól myszom oddychać 100% tlenem przez co najmniej 4 minuty. Może to odbywać się poprzez spontaniczne oddychanie z worka lub za pomocą respiratora nominalnie ustawionego na objętość oddechową 0,2 ml przy 150 oddechach/min.
    4. Zamknij kaniulę tchawicy i odczekaj 3-4 minuty, aby mysz wchłonęła cały tlen. Ta procedura wchłaniania tlenu powoduje śmierć zwierząt i prawie całkowite odgazowanie płuc11. Potwierdź śmierć myszy, mierząc ustanie bicia serca za pomocą elektrod EKG lub bezpośredniej obserwacji.
    5. Po zakończeniu odgazowywania płuc i osiągnięciu przez nią zera objętości płuc należy rozpocząć napełnianie płuc powietrzem pokojowym w pompie strzykawkowej z prędkością 3 ml/min. Monitorować ślad ciśnienia na rejestratorze cyfrowym, a gdy osiągnie on 35 cm H2O, odwrócić pompę.
    6. Postępuj zgodnie z krzywą deflacji, aż ciśnienie osiągnie wartość ujemną 10 cmH2O, do tego czasu drogi oddechowe zapadną się, zatrzymując powietrze w pęcherzykach płucnych, zapobiegając dalszemu zmniejszaniu objętości. Natychmiast ponownie odwróć pompę, pozwalając płucom na ponowne napełnienie, gdy zapadnięte drogi oddechowe się otworzą. To niejednorodne otwarcie jest zwykle widoczne przez hałaśliwie wyglądającą kończynę inflacji w początkowej części tej drugiej inflacji.
    7. Gdy ciśnienie ponownie osiągnie 35 cm H2O, odwróć kierunek pompy i kontynuuj opróżnianie płuc, aż ta druga kończyna deflacji osiągnie 0 cm H2O. Następnie zatrzymaj pompę.
    8. Wyświetl zapis wykresu PowerLab ciśnienia i przepływu oraz krzywej fotowoltaicznej. Następnie przeanalizuj krzywą PV, aby wykryć zmiany fenotypowe w miąższu płuc, które występują przy różnych patologiach płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Choć procedura wyznaczania krzywych PV została zaprezentowana w filmie jedynie na przykładzie zdrowych myszy kontrolnych, zbadaliśmy zdolność krzywej PV do wykrywania zmian funkcjonalnych i patologicznych u myszy z dwiema różnymi powszechnymi patologiami: rozedmą i włóknieniem. Szczegóły tych tradycyjnych modeli zostały opisane w innych publikacjach12,13. W dużym skrócie, po znieczuleniu 3% izofluranem, rozedmę wywołano poprzez podanie do tchawicy 3 lub 6 U świńskiej elastazy trzustkowej i badano po 3 tygodnia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano prostą, powtarzalną metodę pomiaru u myszy klasycznej metody fenotypowania elastyczności płuc, całkowitej krzywej PV płuc. Takie krzywe odegrały zasadniczą rolę w odkryciu surfaktantu płucnego i jego znaczenia w zapewnianiu stabilności płuc. Tutaj pokazano, w jaki sposób krzywa PV jest również przydatna w dostarczaniu środków do pomiaru kilku zmiennych związanych z elastycznością płuc w płucach dorosłych myszy. Stwierdzono bardzo istotne zmiany we wszystkich zmiennych w dwóch powszechnie używan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma żadnych interesów finansowych, które byłyby w konflikcie z materiałem przedstawionym w niniejszej pracy.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez NIH HL-1034.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa strzykawkowaAparat Harvard55-2226Pompa strzykawkowa do zaparzania/wycofywania
Przełącznik nawrotny pompy22 Aparatura Harvarda552217W zestawie z pompą
Transformator liniowy przemieszczeniowyTrans-Tek, Inc.0244-0000
Szklana strzykawka 5 mlBecton DickensonKilku innych możliwych dostawców Rejestrator
cyfrowyADInstrumentsPL3504Kilku innych możliwych dostawców
Kondycjoner sygnału wzmacniacza mostkowegoADInstrumentsFE221
Zbiornik gazu, 100% tlenuAirgas, IncKażdy dostawca lub źródło szpitalne będzie działać
Przetwornik ciśnienia: 0 - 1 psi  Wyjście mVOmega EngineeringPX-137Zakres i asymp; 0 - 60 cm H2O

Bibliografia

  1. Neergaard, K. v Neue Auffasungen über einn Grundbergriff der Atemtechnik. Die Retraktionskraft der unge, abhangig von den Oberflachenspannung in den Alveolen. (New interpretations of basic concepts of respiratory mechanics. Correlation of pulmonary recoil force with surface tension in the alveoli.). Zeitschrift Fur Gesamte Experi Medizin. 66, 373-394 (1929).
  2. Hildebrandt, J. Pressure-volume data of cat lung interpreted by a plastoelastic, linear viscoelastic model. J. Appl. Physiol. 28, 365-372 (1970).
  3. West, J. B. Bioengineering Aspects of the Lung. , Marcel Dekker. New York, NY. 83-162 (1977).
  4. Avery, M. E., Mead, J. Surface properties in relation to atelectasis and hyaline membrane disease). AMA. J. Dis. Child. 97, 517-523 (1959).
  5. Clements, J. A., Hustead, R. F., Johnson, R. P., Gribetz, I. Pulmonary surface tension and alveolar stability. Tech Rep CRDLR US Army Chem. Res. Dev. Lab. 3052, 1-24 (1961).
  6. Radford, E. P. Tissue Elasticity. Remington, J. W. , American Physiological Society. Bethesda, MD. 177-190 (1957).
  7. Mitzner, W., Johnson, J. W. C., Scott, R., London, W. T., Palmer, A. E. Effect of betamethasone on the pressure-volume relationship of fetal rhesus monkey lung. Journal of Applied Physiology. 47, 377-382 (1979).
  8. Smaldone, G. C., Mitzner, W., Itoh, H. The role of alveolar recruitment in lung inflation: Influence on pressure-volume hysteresis. Journal of Applied Physiology. 55, 1321-1332 (1983).
  9. Tankersley, C. G., Rabold, R., Mitzner, W. Differential lung mechanics are genetically determined in inbred murine strains. Journal of Applied Physiology. 86, 1764-1769 (1999).
  10. Soutiere, S. E., Mitzner, W. On defining total lung capacity in the mouse. J. Appl. Physiol. 96, 1658-1664 (2004).
  11. Stengel, P. W., Frazer, D. G., Weber, K. C. Lung degassing: an evaluation of two methods. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48, 370-375 (1980).
  12. Limjunyawong, N., Mitzner, W., Horton, M. A mouse model of chronic idiopathic pulmonary fibrosis. Physiol Rep. 2, e00249(2014).
  13. Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J. Appl. Physiol. 110, 1455-1459 (2011).
  14. Brown, R. H., et al. The structural basis of airways hyperresponsiveness in asthma. J. Appl. Physiol. 101 (1), 30-39 (2006).
  15. Smargiassi, A., et al. Ultrasonographic Assessment of the Diaphragm in Chronic Obstructive Pulmonary Disease Patients: Relationships with Pulmonary Function and the Influence of Body Composition - A Pilot Study. Respiration: International Review of Thoracic Diseases. 87 (5), 364-371 (2014).
  16. Mitzner, W. Airway-parenchymal interdependence. Comprehensive Physiol. 2, 1921-1935 (2012).
  17. Johnson, J. W., Permutt, S., Sipple, J. H., Salem, E. S. Effect of Intra-Alveolar Fluid on Pulmonary Surface Tension Properties. J. Appl. Physiol. 19, 769-777 (1964).
  18. Palmer, S., Morgan, T. E., Prueitt, J. L., Murphy, J. H., Hodson, W. A. Lung development in the fetal primate, Macaca nemestrina. II. Pressure-volume and phospholipid changes. Pediatr. Res. 11, 1057-1063 (1977).
  19. Lum, H., Mitzner, W. A species comparisonof alveolar size and surface forces. Journal of Applied Physiology. 62, 1865-1871 (1987).
  20. Faridy, E. E. Effect of distension on release of surfactant in excised dogs' lungs. Respir. Physiol. 27, 99-114 (1976).
  21. Faridy, E. E., Permutt, S., Riley, R. L. Effect of ventilation on surface forces in excised dogs' lungs. J. Appl. Physiol. 21, 1453-1462 (1966).
  22. Comroe, J. H., Forster, R. E., Dubois, A. B., Briscoe, W. A., Carlsen, E. The Lung: Clinical Physiology and Pulmonary Function Tests. , Year Book Medical Publishers, Inc. New York, NY. (1962).
  23. Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann. Intern. Med. 142, 963-967 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Płuce myszyelastyczność płucpompa strzykawkowakompresja gazuciśnienie w drogach oddechowychpodatność płucmodel rozedmymodel włóknieniainflacja płuc
Pomiar krzywej ciśnienie-objętość w płucach myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.