Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym pierwotnym złośliwym nowotworem mózgu i niezmiennie kończy się śmiercią. Resekcja chirurgiczna w połączeniu z niespecyficzną standardową chemioterapią i radioterapią nie eliminuje całkowicie komórek nowotworowych, co skutkuje ponurym rokowaniem krótszym niż 15 miesięcy u pacjentów z tą chorobą¹. W przeciwieństwie do tego, immunoterapia oferuje precyzyjne podejście do specyficznego celowania w komórki nowotworowe, a zatem może służyć jako wysoce skuteczna platforma leczenia o zmniejszonym ryzyku toksyczności ubocznej^2-4. Limfocyty T zmodyfikowane ex vivo w celu ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) oferują wszechstronną strategię immunoterapii nowotworów. CAR są generowane przez fuzję zewnątrzkomórkowego zmiennego regionu przeciwciała z jedną lub więcej wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnalizacyjnych limfocytów T, zamiast receptora⁵ limfocytów T ograniczonego głównym kompleksem zgodności tkankowej (MHC) o pełnej długości. Ten tryb rozpoznawania antygenu podobnego do przeciwciała pozwala reaktywnym limfocytom T specyficznym dla antygenu na rozpoznawanie i reagowanie na antygeny nowotworowe przy braku MHC i może być przystosowany do praktycznie nieskończonego repertuaru antygenów.

Limfocyty T CAR zmodyfikowane przeciwko różnym antygenom nowotworowym wykazały skuteczność przedkliniczną i wybitną obietnicę w klinice^6-9. W szczególności, w kontekście GBM, wykazano, że platforma komórek CAR T ukierunkowana na wariant receptora naskórkowego czynnika wzrostu III (EGFRvIII), specyficzną dla nowotworu mutację ulegającą ekspresji na powierzchni komórki¹⁰, przedłuża przeżycie myszy z glejakiem¹¹. Jednak pomimo ich wszechstronności, korzyści kliniczne płynące z terapii adopcyjnej CAR nie zostały w pełni zrealizowane, częściowo ze względu na immunosupresję związaną z nowotworem i unikanie odpowiedzi immunologicznej^12-16, a także wyzwania związane z tworzeniem i utrzymywaniem limfocytów T specyficznych dla antygenu in vivo. Wykorzystanie standardu opieki (SOC) w połączeniu z immunoterapią może potencjalnie przezwyciężyć kilka z tych ograniczeń, co skutkuje zwiększoną skutecznością zarówno w warunkach przedklinicznych, jak i klinicznych.

SOC dla poresekcji GBM składa się z wysokiej dawki temozolomidu (TMZ), środka alkilującego DNA¹⁷ i napromieniania całego mózgu (WBI)¹. Przypuszcza się, że terapie te działają synergistycznie ze szczepionkami przeciwnowotworowymi poprzez regulację w górę ekspresji MHC^{guza 18-20} i wydalanie antygenów przez martwe komórki nowotworowe^17,19,21,22. Rzeczywiście, dodanie TMZ^20,23 lub WBI^18,24 prowadzi do zwiększonej skuteczności przeciwnowotworowej leczenia opartego na odporności w warunkach przedklinicznych. Ponadto, podobnie jak wiele nieswoistych chemioterapeutyków cytotoksycznych, TMZ jest znany z wywoływania limfopenii^{układowej 25,26}, która może być wykorzystana jako sposób kondycjonowania gospodarza dla platform terapii adopcyjnej^27-29. Wykazano, że limfodeplecja za pośrednictwem TMZ zwiększa częstotliwość i funkcję limfocytów T specyficznych dla antygenu, co prowadzi do zwiększenia skuteczności platformy terapii adoptywnej przeciwko nowotworom wewnątrzczaszkowym³⁰. W kontekście terapii CAR, limfodeplecja służy jako środek kondycjonowania gospodarza zarówno poprzez zmniejszenie liczby endogennych supresorowych limfocytów T³¹, jak i indukowanie proliferacji homeostazy³² poprzez zmniejszoną konkurencję o cytokiny³³, zwiększając w ten sposób aktywność przeciwnowotworową^11,34. Biorąc pod uwagę synergiczny związek między GBM SOC a platformami immunoterapii, ocena nowych terapii adopcyjnych i platform szczepionek w kontekście SOC ma kluczowe znaczenie dla wyciągnięcia znaczących wniosków dotyczących skuteczności.

W tym protokole opisujemy metodę generowania i dożylnego podawania mysich limfocytów CAR T specyficznych dla EGFRvIII wraz z TMZ i WBI u myszy z guzami wewnątrzczaszkowymi EGFRvIII-dodatnimi (zobacz Rysunek 1 dla harmonogramu leczenia). Krótko mówiąc, limfocyty CAR T są wytwarzane ex vivo przez transdukcję retrowirusową. Komórki 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) są transfekowane przy użyciu kompleksu DNA/lipid (zawierającego wektor CAR i plazmidy pCL-Eco) w celu wytworzenia wirusa, który jest następnie wykorzystywany do transdukcji aktywowanych mysich splenocytów, które są zbierane i hodowane równolegle. W trakcie wytwarzania CAR mysi gospodarze z guzami wewnątrzczaszkowymi EGFRvIII-dodatnimi są napromieniani frakcjonowanym promieniowaniem rentgenowskim całego mózgu i ogólnoustrojowe leczenie TMZ w dawkach porównywalnych z klinicznym SOC. Limfocyty T CAR są następnie dostarczane dożylnie do gospodarzy limfodeplenowatych.

Następująca procedura jest opisana w siedmiu oddzielnych fazach: (1) Podawanie temozolomidu myszom z nowotworem, (2) Napromienianie całego mózgu myszy z nowotworem, (3) Transfekcja, (4) Splenektomia i przygotowanie limfocytów T, (5) Transdukcja, (6) Hodowla i zbiór komórek CAR T oraz (7) Podawanie limfocytów CAR T myszom z nowotworem. Fazy te składają się z kilku kroków, które trwają 6-7 dni i są wykonywane jednocześnie.

Ten protokół opiera się na eksperymentalnym projekcie, w którym 10 myszy jest leczonych po 10 7 limfocytów CAR T każda. Oznacza to, że potrzebnych będzie 10⁸ limfocytów CAR T; Wydajność należy przeszacować o 5 x 10^7-1 x 10⁸, aby uwzględnić utratę rentowności. Następujący protokół jest skalowany w celu wygenerowania około 200 x 10⁶ komórek. Komórki są następnie podawane dożylnie samicom myszy C57BL / 6 z 9-dniowymi syngenicznymi guzami wewnątrzczaszkowymi EGFRvIII-dodatnimi, rozwiniętymi z istniejących linii komórkowych gwiaździaka KR158B lub czerniaka B16. Równocześnie z wytwarzaniem limfocytów CAR T, myszom z nowotworem podaje się klinicznie istotne dawki limfodepletywnego TMZ (60 mg / kg) i WBI (16,5 Gy).

Myszy były utrzymywane i hodowane w warunkach wolnych od patogenów w Duke University Medical Center (DUMC). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Podawanie temozolomidu myszom z nowotworem

Dni od 0 do 4:

1. Obliczyć całkowitą liczbę myszy do wstrzyknięcia i pomnożyć ją przez 0,5, aby określić potrzebną objętość roztworu TMZ (np. 30 myszy x 0,5 ml = 15 ml TMZ) i dodać 1,5 ml do tej objętości, aby uwzględnić rozlanie się (16,5 ml TMZ).
2. Pomnóż tę całkowitą objętość przez 3 mg/ml, aby określić potrzebną masę liofilizowanego TMZ (np. 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Odważyć to na 50 ml stożkowy.
   UWAGA: TMZ jest toksyczny przez wdychanie, spożycie i kontakt z oczami, skórą i błonami śluzowymi. Skonsultuj się z działem bezpieczeństwa pracy i/lub zdrowia środowiskowego instytucji w celu uzyskania zaleceń dotyczących zmniejszenia ryzyka narażenia.
3. Pomnóż całkowitą objętość przez 0,15, aby określić potrzebną objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) (np. 16,5 x 0,15 = 2,475 ml DMSO). Filtruj wysterylizuj tę objętość DMSO (plus dodatkowe 2 ml w celu uwzględnienia rozlania) przez filtr 0,2 μm do sterylnej probówki. Dodaj 2,475 ml sterylnego DMSO do proszku TMZ.
4. Umieścić roztwór TMZ/DMSO w zlewce z wodą nad płytą grzejną o temperaturze 65 °C na 10-15 minut. Gdy TMZ zostanie całkowicie rozpuszczony, roztwór powinien stać się bladożółty; jeśli roztwór stanie się różowy, oznacza to, że TMZ ulega degradacji i należy przygotować nowy roztwór ze świeżą partią TMZ.
5. Obliczyć odpowiednią objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej, mnożąc 0,85 przez całkowitą objętość (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml soli fizjologicznej). Dodać 15 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do stożkowego naczynia o pojemności 50 ml. Podczas gdy TMZ rozpuszcza się w DMSO, podgrzej sól fizjologiczną do 65 °C.
6. Odwiruj roztwór TMZ/DMSO, aby upewnić się, że proszek TMZ jest całkowicie rozpuszczony i powoli dodaj podgrzaną sól fizjologiczną do roztworu TMZ/DMSO.
7. Natychmiast po przygotowaniu należy w pełni załadować 15 strzykawek tuberkulinowych po 1 ml roztworem TMZ do podania 4-dniowym myszom z guzem.
8. Powtórz tę procedurę w dniach od 1 do 4, co daje w sumie pięć podań TMZ.

2. Napromienianie całego mózgu myszy z nowotworem

Dni od 2 do 4:

1. Włącz promiennik rentgenowski i pozwól mu rozgrzać się do pełnego napięcia. Upewnij się, że odpowiedni filtr jest na swoim miejscu i wprowadź odpowiednie ustawienia napięcia i prądu (Rysunek 2A).
   UWAGA: Dozymetria naświetlacza powinna być ustalona wcześniej, aby określić odpowiednią objętośćtage ustawienia i układ sieci (Rysunek 2A,B).
2. Oblicz czas potrzebny do uzyskania napromieniowania rentgenowskiego o wartości 5,5 Gy. Na przykład, jeśli promieniowanie rentgenowskie jest dostarczane z prędkością 2 Gy/min, to 2,75 minuty jest konieczne, aby dostarczyć łącznie 5,5 Gy. Wprowadź odpowiedni czas trwania.
   UWAGA: Tabela 2 zawiera dawki WBI u myszy i ich kliniczne odpowiedniki u ludzi. W kontekście glejaków o wysokim stopniu złośliwości, 60 Gy frakcjonowany WBI (2 frakcje Gy, 5 dni w tygodniu przez 6 tygodni) jest klinicznym standardem opieki, a mysim odpowiednikiem zastosowanym tutaj jest 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
3. Przygotować świeży roztwór ketaminy/ksylazyny do znieczulenia ogólnoustrojowego, dodając 2 ml ketaminy i 1 ml ksylazyny do 17 ml soli fizjologicznej, tak aby końcowy roztwór wynosił 10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny.
4. Zważyć myszy i podać dootrzewnowo 10 μl ketaminy/ksylazyny na gram masy ciała, tak aby zwierzęta otrzymały dawkę ketaminy w dawce 100 mg/kg i 10 mg/kg ksylazyny. Myszy powinny być w pełni uspokojone i widocznie oddychać w ciągu 2 minut od podania ketaminy/ksylazyny.
5. Aby utrzymać nawilżenie okulistyczne u zwierząt w stanie uspokojenia, delikatnie wetrzyj niewielką ilość maści ze sztucznymi łzami w każde oko.
6. Umieść uspokojone myszy na siatce w taki sposób, aby głowy były umieszczone w obszarze, który otrzymuje największą intensywność promieniowania rentgenowskiego (ryc. 2B,C). Osłoń ciała od szyi w dół za pomocą ołowianych rurek o odpowiedniej wielkości, aby zablokować ogólnoustrojowe dostarczanie promieniowania rentgenowskiego (rysunek 2D).
7. Umieść myszy ustawione pod wiązką promieniowania rentgenowskiego tak, aby laser oznaczający ognisko wiązki promieniowania rentgenowskiego znajdował się na współrzędnej (0,0) na układzie siatki. Rozpocznij dostarczanie promieni rentgenowskich.
8. Po zakończeniu prześwietlania wyjmij zwierzęta z promiennika i umieść je na ciepłej poduszce grzewczej. Nie należy trzymać zwierząt w stanie uspokojonym ze zwierzętami przytomnymi, dopóki zwierzęta nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Gdy zwierzęta będą w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka, umieść przytomne zwierzęta z powrotem w odpowiednich klatkach.
9. Powtórz tę procedurę w 3 i 4 dniu, aby uzyskać w sumie trzy frakcjonowane dawki promieniowania.

3. Transfekcja

Dzień -1:

1. Przygotować pożywkę D10, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
2. Przygotuj pożywkę z limfocytów T (TCM), dodając 5,5 ml L-glutaminy, 5,5 ml pirogronianu sodu, 5,5 ml aminokwasów endogennych i 5,5 ml ołówka/streptomycyny (pióro/paciorkowca) do 500 ml pożywki RPMI-1640. Następnie dodać 550 μl 2-merkaptoetanolu i 550 μl gentamycyny. Na koniec dodaj 50 ml FBS.
3. Pobrać HEK293T komórek z hodowli in vitro i doprowadzić do stężenia 7,5 x 10⁶ komórek/ml w pożywce D10.
4. Umieścić na płytce 10 ml pożywki D10 i dodać 1 ml zawiesiny HEK293T komórek do każdej z płytek pokrytych poli-D-lizyną (PDL) o wymiarach 16 x 10 cm.
5. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

Dzień 0:

6. Zastąp pożywkę 10 ml świeżego D10 co najmniej 30 minut przed transfekcją komórek.
7. Określ ilość plazmidu wektorowego, wektora pCL-Eco i odczynnika do transfekcji liposomalnej wymaganej do transfekcji, mnożąc całkowitą liczbę płytek + 1 (16 + 1 = 17) przez 14,1 μg plazmidu wektorowego (14,1 x 17 = 239,7 μg), 9,9 μg wektora pCL-Eco (9,9 x 17 = 168,3 μg) i 60 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej (60 x 17 = 1,020 μl). Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową przed przygotowaniem roztworów.
8. Oznacz dwie probówki A i B. W probówce A dodać 239,7 μg plazmidu wektorowego i 168,3 μg wektora pCL-Eco do (1,5 x 17) ml pożywki orła modyfikowanej surowicą o obniżonej surowicy (RS-MEM). W probówce B dodać 1020 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej do (1,5 x 17) ml RS-MEM.
9. Inkubować A i B oddzielnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Delikatnie wymieszaj A i B razem (wiruj przez 1-2 sekundy lub kilkakrotnie odwróć) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć kompleks lipidowo-DNA.
11. Dodaj kroplami kompleks lipidowo-DNA, aby HEK293T komórki w naczyniu o średnicy 10 cm.
12. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin lub przez noc (nie dłużej niż 24 godziny).
13. Po 6-8 godzinnej inkubacji zastąp pożywkę 12 ml świeżego TCM do produkcji wirusa. To posiane podłoże zostanie użyte w dniu 2 jako supernatant wirusowy do transdukcji limfocytów T.

4. Splenektomia i przygotowanie limfocytów T

Dzień 0:

1. Wlej 10 ml TCM do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml i umieść na lodzie w celu pobrania śledziony.
2. Uśmierc odpowiednią liczbę zwierząt przez uduszenie CO₂ i wtórne ścięcie: Umieść zwierzęta w klatce otrzymującej CO₂ z natężeniem przepływu 10-30% objętości klatki na minutę, zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynaryjnych (nie więcej niż 5 zwierząt może być uśmierconych jednocześnie) do zakończenia oddychania i przez dwie minuty po nim. Usuń zwierzęta z komory CO₂ i odetnij głowę.
   UWAGA: Jedna śledziona 6-12 tygodniowej samicy myszy C57BL/6 da około 4,5-5 x 10⁷ splenocytów. Tutaj zostaną pobrane 4 śledziony na około 200 x 10⁶ komórek.
3. Połóż mysz tak, aby jej prawa strona była skierowana do góry i spryskaj 70% etanolem. Za pomocą kleszczy chwyć cienki fałd skóry poniżej lewej klatki piersiowej i wytnij lekkie nacięcie nożyczkami. Oderwij skórę, ostrożnie chwyć cienki fałd otrzewnej kleszczami i wytnij mały ubytek.
4. Śledziona jest małym, wydłużonym, ciemnoczerwonym narządem, który przypomina spłaszczoną fasolę; delikatnie chwyć śledzionę kleszczami i wytnij, odcinając otaczającą tkankę łączną. Umieścić wycięte śledziony w stożku zawierającym 10 ml TCM na lodzie.
5. Wylać śledziony na sitko do komórek o siatku 70 μm i zdezagregować przez rozgniecenie końcem wnętrza strzykawki o pojemności 5 ml w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Maksymalnie dwie śledziony powinny być zdezagregowane na jedno siatko siatkowe.
6. Użyj niewielkiej objętości TCM, aby ostrożnie umyć sitko po dezagregacji, aby zebrać pozostałe splenocyty. Zbierz wszystkie zdezagregowane śledziony w jednokomórkową zawiesinę. Doprowadzić końcową objętość do 50 ml za pomocą TCM na jedno pranie i wirować przy 300 x g przez 10 minut.
7. Przygotować roztwór 1x buforu do lizy, dodając 5 ml 10x buforu do lizy do 45 ml sterylnej wody. Aby wyeliminować czerwone krwinki, ponownie zawiesić osad w 5 ml 1x buforu do lizy na śledzionę w stożkowym opakowaniu o pojemności 50 ml, dobrze mieszając, delikatnie pipetując w górę iw dół. W przypadku przekroczenia 5 śledzion należy użyć probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Umieścić probówkę stożkową lub wirówkową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut.
8. Usunąć reakcję lizy z łaźni wodnej i dodać TCM w stosunku 1:1 z buforem do lizy, aby zneutralizować reakcję. Prać wirując w temperaturze 300 x g przez 10 min.
9. Odessać supernatant i całkowicie zawiesić osad w TCM (2 ml/śledzionę, łącznie 8 ml na 4 śledziony) pipetując w górę i w dół.
10. Policz komórki, dodając 10 μl zawiesiny komórek do 190 μl błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:20). Pomnóż liczbę uzyskaną w jednym z czterech kwadratów w siatce przez 20 x 10⁴ x całkowita objętość (8 ml), aby uzyskać całkowitą liczbę komórek (np. 125 komórek x 20 x 10⁴ x 8 ml = 200 x 10⁶ splenocytów).
11. Rozcieńczyć komórki do stężenia 2 x 10⁶ komórek/ml w TCM, uzupełnione 2 μg/ml konkanawaliny A (ConA) i 50 IU / ml rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2 (rhIL-2). Tak więc, dla 200 x 10⁶ splenocytów, dodaj 92 ml pożywki do 8 ml komórek, 200 μg ConA i 5,000 IU rhIL-2.
12. Dodaj 2 ml komórek do każdej studzienki z 24-dołkowymi płytkami poddanymi kulturze tkankowej, tak aby 4 x 10⁶ komórek znajdowało się w każdym dołku (np. 100 ml komórek będzie wymagało około 4 płytek).
13. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

5. Transdukcja

Dzień 1:

1. Oblicz liczbę 24-dołkowych płytek niepoddanych hodowli tkankowej potrzebnych do transdukcji, mnożąc liczbę pobranych śledzion przez 2 (na 4 śledziony potrzeba 8 płytek).
2. Następnie oblicz wymaganą objętość roztworu rekombinowanego ludzkiego fragmentu fibronektyny (RHFF) potrzebnego do pokrycia płytek, mnożąc (całkowita liczba dołków + 3) x 0,5 ml (8 płytek x 24 dołki = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
3. Przygotować 97,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej RHFF w stężeniu 25 μg/ml, mnożąc całkowitą objętość przez 25 μg (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Dodać tę ilość RHFF do 97,5 ml PBS.
4. Pokryj 24-dołkowe płytki poddane hodowli nietkankowej, dodając 0,5 ml roztworu PBS/RHFF na dołek.
5. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

Dzień 2:

6. Zrzuć roztwór PBS/RHFF z płytek 24-dołkowych poddanych działaniu kultur nietkankowych.
7. Dodać 1 ml/basenik 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
8. Usuń BSA, mocno obracając płytę. Umyć, dodając 2 ml PBS.
9. Zebrać supernatant wirusa, przenosząc pożywkę z każdej płytki HEK293T PDL do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml i wirować przez 10 minut przy 500 x g.
10. Ostrożnie przenieść supernatant wirusa do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 250 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, który mógł się utworzyć.
11. Dodać świeży TCM do supernatantu wirusa tak, aby końcowa objętość była o 3 ml większa niż ilość potrzebna do studzienek pokrytych RHFF. Na przykład w przypadku 192 studzienek pokrytych RHFF należy doprowadzić objętość supernatantu wirusa do 192 + 3 ml = 195 ml.
12. Wyjąć wyhodowane splenocyty z inkubatora i zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy do każdej studzienki. Przenieść do stożka o pojemności 250 ml. W przypadku korzystania z pipety wielokanałowej użycie sterylnego zbiornika przed przeniesieniem pomoże przyspieszyć ten krok. Policz zgodnie z wcześniejszym opisem i wiruj z prędkością 300 x g przez 10 minut.
13. Dodać rhIL-2 do supernatantu wirusa w stężeniu 50 j.m./ml. Na przykład dodać 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2 do 195 ml supernatantu wirusa.
14. Zawiesić splenocyty w supernatancie wirusa w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml
15. Dodać 1 ml/dołek zawiesiny splenocytów do 24-dołkowych płytek pokrytych RHFF.
16. Wirować przez 90 minut zgodnie z następującymi ustawieniami: 770 x g, przyspieszenie = 4, hamowanie/opóźnienie = 0, 32 °C.
17. Przygotować roztwór TCM o stężeniu 50 j.m./ml rhIL-2. Na przykład przygotuj roztwór 200 TCM, dodając 10 000 IU rhIL-2. Dodać 1 ml rhIL-2/TCM do każdego dołka po odwirowaniu.
18. Hodowla przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .

6. Hodowla i zbiór komórek T CAR

Dzień 3 i 4:

1. Jeśli limfocyty T osiągną >80% konfluencji, komórki mogą zostać podzielone (zwykle dzieje się to w 3 lub 4 dniu). Aby podzielić komórki, delikatnie pipetuj w górę i w dół do każdej studzienki 2-3 razy i przenieś 1 ml z każdej studzienki do nowych dołków świeżej 24-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Następnie dodać 1 ml świeżego TCM z 50 j.m./ml IL-2 do każdej studzienki tak, aby końcowa objętość wynosiła 2 ml we wszystkich studzienkach.
2. Jeśli komórki nie osiągną zbieżności >80%, wykonaj wymianę pożywki o połowę, powoli odpipetowując 1 ml pożywki od góry każdej studzienki. Unikaj przeszkadzania komórek osiadłych na dnie podczas usuwania nośnika. Dodać 1 ml świeżego TCM zawierającego 50 j.m./ml rhIL-2.

Dzień 5:

3. Zawiesić limfocyty CAR T, delikatnie pipetując 3 razy w górę i w dół w każdym dołku i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Wiruj komórki w odległości 300 x g przez 10 min.
4. Całkowicie zassać supernatant bez zakłócania osadu. Umyj raz PBS, policz komórki zgodnie z wcześniejszym opisem i umyj PBS po raz drugi. Typowa wydajność komórek CAR T wynosi około 1 x 10⁶ komórek na dołek (8 płytek x 24 dołki = 192 x 10⁶ komórek CAR T).
5. Zawiesić komórki w PBS w stężeniu 5 x 10⁷/ml do wstrzyknięcia 1 x 10⁷ w objętości 200 μg (np. dla komórek T 192 x 10⁶ CAR zawiesić przemyty osad w 3,84 ml PBS).

7. Podawanie limfocytów T CAR myszom z nowotworem

Dzień 5:

1. Transport komórek na lodzie do zakładu dla zwierząt w celu wstrzyknięcia dożylnego. Załaduj 500-1,000 μl do strzykawki insulinowej za pomocą igły 27 - 31 G, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte.
2. Chwyć mysz u podstawy ogona i umieść w rurce ograniczającej.
3. Pociągnij ogon napięty z żyłą skierowaną do góry i wsuń igłę około 1-2 mm pod skórą do żyły, wkładając ją równolegle do żyły ogonowej. Powoli wydalić 200 μl do żyły. Jeśli igła zostanie prawidłowo wprowadzona do żyły, objętość łatwo wpłynie; W przeciwnym razie pojawi się opór, a igła będzie musiała zostać usunięta z ogona i ponownie prawidłowo włożona.

Limfocyty T CAR są generowane przez transdukcję za pomocą wektora retrowirusowego EGFRvIII CAR11. Ten wektor, MSGV1, został opracowany z wektoraSFGtcLuc_ITE4 35, który zawiera długie powtórzenia końcowe wirusa mysich komórek macierzystych (MSCV), rozszerzony region gag i miejsce splicingu otoczki (donor splicingu, sd i akceptor splicingu, sa) oraz sygnał pakowania wirusa (ψ). EGFRvIII CAR zawierający ludzki jednołańcuchowy zmienny fragment anty-EGFRvIII (scFv) 139, w połączeniu z mysimi regionami wewnątrzkomórkowymi CD8TM, CD28, 4-1BB i CD3ζ, sklonowano do wektora retrowirusowego poniżej miejsca NcoI (Figura 3).

Po transdukcji, limfocyty CAR T mogą być kwantyfikowane i fenotypowane za pomocą cytometrii przepływowej. Limfocyty CAR T EGFRvIII można wizualizować za pomocą 2-kolorowego panelu składającego się z biotynlowanego multimeru pochodzącego z EGFRvIII sprzężonego streptawidyną i fikoerytryną (SA / PE) oraz FITC anty-CD3. Korzystając z opisanych tutaj protokołów hodowli i transdukcji, rutynowo obserwujemy ekspresję CAR wśród 55-70% mysich splenocytów (Figura 4A)11. Alternatywnie, CAR mogą być również barwione w celu ekspresji przy użyciu kozich przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko ludzkiej F(ab')2-biotynie i drugorzędowych SA / PE, które zostały wcześniej opisane36. Limfocyty CAR T mogą być dalej fenotypowane przez dodanie innych fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał do dwukolorowego panelu CAR. Na przykład barwienie CD8 i CD4 pokazuje, że 70% transdukowanych CAR to limfocyty T CD8 +, podczas gdy 20% to limfocyty T CD4 + (Figura 4B). Wykazano, że limfocyty CAR T o tym profilu ekspresji łatwo przemieszczają się do mózgu i leczą guzy wewnątrzczaszkowe.

Tabela 1: Dawka temozolomidu na podstawie wagi zwierzęcia. Dawki temozolomidu obliczono na podstawie całkowitej dawki 60 mg/kg mc.

Tabela 2: Klinicznie istotne biologicznie równoważne dawki promieniowania. Dawki promieniowania obliczono zgodnie z BED = D[1+d/(α/β)], gdzie D = dawka całkowita, d = dawka frakcjonowana, a α/β = 2). Całkowita dawka podawana jako WBI mysiemu gospodarzowi jest pokazana w kategoriach dostarczonych dawek ułamkowych i dawki ludzkiej, która jest modelowana przez te frakcje dawki. Do celów modelowych pokazany jest również nowotwór złośliwy, dla którego BED jest standardem opieki.

Rycina 1: Oś czasu leczenia myszy z nowotworem i jednoczesnego generowania CAR ex vivo. Standardowa chemioterapia i napromienianie całego mózgu rozpoczyna się 4 dni po implantacji guza (A). W tym przedziale czasu limfocyty CAR T są generowane i hodowane ex vivo (B) i dostarczane po pełnym cyklu kondycjonowania gospodarza.

Rysunek 2: Układ i ustawienia dostarczania promieniowania. Promieniowanie rentgenowskie jest dostarczane zgodnie z dozymetrią 320 kV i 10 mA, ze zmiennym czasem trwania dobranym w zależności od pożądanej dawki (A). Ogniskowe promieniowania rentgenowskiego to wąski obszar o grubości 2,5 cm. Zwierzęta w stanie uspokajającym są ułożone zgodnie z siatką (B) w taki sposób, aby ich głowy leżały w obszarze o największym natężeniu promieniowania rentgenowskiego; (C) pokazuje widok z jednego końca wiązki promieniowania rentgenowskiego. Około 4 zwierzęta mogą znajdować się pod promiennikiem podczas jednego cyklu podawania promieni rentgenowskich zgodnie z tym układem siatki (B, D). Rurki ołowiane służą do osłaniania ciała, pozostawiając tylko ich głowy odsłonięte dla WBI (D).

Rycina 3: Zmodyfikowany wektor retrowirusowy SFGtcLuc_ITE4, MSGV1, został wykorzystany do transdukcji i generowania komórek CAR T. Wkładka CAR EGFRvIII zawierająca ludzki fragment zmiennej jednołańcuchowej anty-EGFRvIII (scFv) 139, w połączeniu z mysimi regionami wewnątrzkomórkowymi CD8TM, CD28, 4-1BB i CD3ζ, jest otoczona długimi powtórzeniami końcowymi (LTR) wirusa mysich komórek macierzystych (MSCV). Przed wstawką CAR znajduje się rozszerzony obszar gag i miejsce splotu otoczki (donor splicingu, sd i akceptor splicingu, sa) oraz sygnał pakowania wirusa (ψ).

Ryc. 4: CAR EGFRvIII ulegają ekspresji na powierzchni limfocytów T. 48 godzin po transdukcji limfocyty T wybarwiono pod kątem ekspresji powierzchniowej CAR EGFRvIII za pomocą multimeru złożonego z LEEKKGNYVVTDHC-K(biotyna)-NH2 / streptawidyna-PE. Nietransdukowane limfocyty T od tego samego dawcy były również barwione jako kontrola ujemna. Dane pokazują liczbę limfocytów CAR T (oś y) dodatnich do barwienia przez multimer EGFRvIII sprzężony z PE (oś x), bramkowany na komórkach CD3 + jako marker limfocytów T, gdzie stwierdzono ekspresję 60,9% (A). Limfocyty CAR T barwione na CD4-PerCP-Cy5,5 i CD8-APC wykazują profil ekspresji odpowiednio 21,7% i 70,9% (B).

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.