Jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka

Podsumowanie

Prezentujemy metodę wywoływania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), poprzez wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych do oka szczura, w celu modelowania jaskry. Prowadzi to do silnego wzrostu ciśnienia i rozległej śmierci neuronów. Protokół ten jest łatwy do wykonania, nie wymaga wielokrotnych wstrzyknięć i zapewnia stabilny, długotrwały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego.

Streszczenie

Postęp w zrozumieniu patofizjologii i dostarczaniu nowych metod leczenia jaskry zależy od dobrych modeli zwierzęcych choroby. Przedstawiamy tutaj protokół podnoszenia ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) u szczura, poprzez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory oka. Zastosowanie cząstek magnetycznych pozwala użytkownikowi na manipulowanie kulkami pod kątem tęczówki i rogówki, zapewniając w ten sposób bardzo skuteczną blokadę odpływu płynu z siatki beleczkowej. Prowadzi to do długotrwałego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, a ostatecznie do śmierci neuronów w warstwie komórek zwojowych (GCL), a także patologii nerwu wzrokowego, co obserwuje się u pacjentów z tą chorobą. Ta metoda jest prosta do wykonania, ponieważ nie wymaga maszyn, specjalistycznych umiejętności chirurgicznych ani wielu godzin ćwiczeń do doskonalenia. Co więcej, wzrosty ciśnienia są bardzo duże, a ponowne wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych nie jest zwykle wymagane, w przeciwieństwie do niektórych innych modeli wykorzystujących plastikowe kulki. Dodatkowo uważamy, że ta metoda jest odpowiednia do adaptacji do oka myszy.

Wprowadzenie

Jaskra pierwotna to wyniszczająca choroba oczu, która dotyka około 60,5 miliona ludzi na całym świecie¹, co może prowadzić do utraty wzroku i ślepoty zmieniającej^życie2. Badania nad mechanizmami chorobowymi i opracowywanie nowych metod leczenia jaskry są uzależnione od dobrych modeli choroby, które podsumowują niektóre cechy charakterystyczne patologii.

Prezentujemy tutaj model jaskry szczura oparty na metodzie Samsela i wsp.³ Ogólnym celem tej techniki jest zwiększenie ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w oku poprzez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory i skierowanie ich za pomocą pierścienia magnetycznego do kąta tęczówkowo-rogówkowego. Utrudnia to odpływ wody wodnistej, co zwiększa ciśnienie wewnątrzgałkowe, prowadząc do uszkodzenia neuronów i utraty komórek. Protokół został opracowany w celu zapewnienia prostszego, indukowalnego modelu jaskry.

Ten protokół może mieć pewne zalety w stosunku do istniejących technik. Dostępne są genetyczne modele myszy, takie jak DBA/2J, które nie wymagają procedur do zainicjowania; Mogą one jednak mieć nieprzewidywalny początek progresji choroby⁴. W przeciwieństwie do tego, modele indukowalne, z których większość opiera się na chirurgicznym podnoszeniu ciśnienia wewnątrzgałkowego u gryzoni, mają tę zaletę, że inicjacja może być kontrolowana przez użytkownika. Niektóre z tych metod mogą mieć swoje wady, w tym są trudne technicznie⁵ i mogą wymagać wielu procedur w celu utrzymania podwyższonego IOP⁶.

Dla kontrastu, metoda indukowalna opisana w tym manuskrypcie jest prostą, skuteczną i powtarzalną techniką, która powoduje stabilny, solidny wzrost ciśnienia, przy minimalnej potrzebie ponownego wstrzykiwania. Dodatkowo nie wymaga drogiego sprzętu, a do wykonania wymaga jedynie podstawowych umiejętności chirurgicznych. Protokół ten może być odpowiedni dla czytelników, którzy chcą stworzyć mniej wymagający technicznie model indukowalnej jaskry w swoim laboratorium.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i zostały zatwierdzone zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (http://goo.gl/FLkirW, ostatni dostęp 10^czerwca 2014) oraz Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych (http://goo.gl/4LFOjD, ostatni dostęp 10 czerwca 2014^r.).

1. Indukcja nadciśnienia ocznego

1. Wywołanie eksperymentalnej jaskry poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) poprzez jednostronne wstrzyknięcie mikrosfer paramagnetycznych do przedniej komory szczurów rasy Brown Norway, w oparciu o metodę Samsela i wsp.³ Inne pigmentowane szczury mogą być odpowiednie, chociaż musiałyby one najpierw zostać zatwierdzone przez użytkownika.
2. Trzymaj 250-300 g samic szczurów rasy Brown Norway w stałym środowisku o słabym oświetleniu (40-60 luksów), aby zminimalizować dobowe wahania IOP⁷, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum.
3. Wykonaj podstawowe pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowego u obudzonych zwierząt⁸ przed znieczuleniem i wstrzyknięciem kulek, używając tonometru odbicia skalibrowanego do stosowania w oku szczura⁹. IOP przyjmuje się jako średnią z pięciu odczytów.
4. Znieczulenie szczurów za pomocą 37,5 mg/kg ketaminy i 0,25 mg/kg chlorowodorku medetomidyny podawanego dootrzewnowo. Potwierdź głębokość znieczulenia, badając odruchy tylnej stopy zwierzęcia, przed zastosowaniem jodu powidonu (patrz krok 1.5) i wstrzyknięciem kulek (patrz krok 1.8). Podawać 0,5% chlorowodorek proparakainy na działanie przeciwbólowe.
   UWAGA: Nie rozszerzaj źrenicy na żadnym etapie. Pomoże to koralikom lepiej osadzić się w kącie tęczówki i zapobiegnie wiązaniu się z soczewką. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki na nieoperowanym oku przeciwległym.
5. Przemyć oko operacyjne 5% jodowidonem w wodzie na^10-5 minut przed wstrzyknięciem.
6. Po 5 minutach odsączyć jod powidonu za pomocą sterylnej gazy i przemyć oko 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Utrzymuj oko wilgotne podczas znieczulenia dzięki regularnemu stosowaniu sterylnej soli fizjologicznej.
7. Umieść magnes toroidalny wokół oka.
8. Wstrzyknąć 25 μl roztworu zawierającego 30 mg/ml wysterylizowanych promieniowaniem gamma mikrosfer magnetycznych o wielkości 8 μm w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) do komory przedniej, używając igły ze skosem 33 G.
   1. Aby przygotować kulki, przemyć przez ponowne zawiesinie, a następnie odwirować 3 razy przy 10 000 x g przez 5 minut z 1 ml HBSS, przed przygotowaniem końcowego roztworu 30 mg/ml. Utrzymuj sterylne warunki przez cały czas.
   2. W przypadku wstrzykiwania należy uważać, aby nie wkładać igły do tęczówki, aby zminimalizować ryzyko urazu tęczówki. Można temu zapobiec, ustawiając igłę stycznie do powierzchni rogówki, jak najbardziej równolegle do tęczówki. Pomoże to również zminimalizować utratę ściegu w miejscu wstrzyknięcia.
      UWAGA: Wstrzykiwaj koraliki w szybkim tempie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wokół kąta tęczówki i rogówki, co ma kluczowe znaczenie dla podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego. Dodatkowo koraliki, igły i pierścienie magnetyczne należy przechowywać oddzielnie, aby kulki nie tworzyły skupisk, co utrudniało ich załadowanie do strzykawki i wstrzyknięcie, a igła nie uległa namagnesowaniu.
9. Pozostawić igłę na miejscu przez 1 minutę po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że kulki osiądą w kącie tęczówki i rogówki, aby utrudnić wodny drenaż z siatki beleczkowej. Lekko pochyl igłę po początkowym osiadaniu koralików, aby umożliwić pewien wyciek wody wodnej, aby zminimalizować przejściowy wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego. Pod koniec operacji należy przepłukać igłę najpierw solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), następnie 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną, aby zapewnić dalsze użycie igły w oddzielnych procedurach. Alternatywnie można użyć jednorazowych igieł, jeśli dostępna jest odpowiednia kombinacja manometru i strzykawki. Opcjonalnie: igły mogą być ostrzone za pomocą ukosowarki, aby przedłużyć ich użytkowanie.
10. Na tym etapie, jeśli to konieczne, usuń magnes i użyj go do narysowania koralików w obszarach o niepełnym pokryciu.
11. Pozostaw magnes na miejscu wokół oka przez kolejne 10 minut po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że kulki dobrze przylegają do kąta tęczówkowo-rogówkowego.
12. Znieczulenie odwrotne przy użyciu 0,25 mg/kg chlorowodorku atypemezolu.
13. Podawać chloramfenikol lub inną maść z antybiotykiem, na przykład gentamycynę lub terramycynę miejscowo, aby zapobiec infekcji, oraz 0,5% chlorowodorek proparakainy do znieczulenia. Pozostaw zwierzęta do regeneracji na macie grzewczej, aż odzyskają ruch, a następnie przenieś do ciepłego pudełka i zaopatrz je w dodatkowe składniki odżywcze, takie jak suplement diety lub nawilżona regularna dieta, aż do całkowitego powrotu do zdrowia. Zwierzętom wykazującym objawy bólu należy podać anieból ogólnoustrojowy lub miejscowy po 24 godzinach od zabiegu. Jeśli objawy te utrzymują się pomimo leczenia, zwierzęta powinny zostać poddane humanitarnemu ubojowi.
14. Użyj przeciwległego oka jako nieobsługiwanego elementu sterującego.
15. Wykonuj pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowego co 2-3 dni po podaniu kulek, a następnie co 2-3 dni za pomocą tonometru odbicia skalibrowanego do użytku w oku szczura⁹.
16. Kryteriami włączenia oczu do badań mogą być: jeśli 1) ciśnienie wewnątrzgałkowe jest podwyższone powyżej przeciwległego ciśnienia kontrolnego o 5 mmHg i 2) nie przekracza 60 mmHg.
17. Oczy, w których ciśnienie powraca do wartości wyjściowej (zwykle w ciągu 1 tygodnia po wstrzyknięciu) nie powinny być uwzględniane w badaniach, jednak w razie potrzeby możliwe jest ponowne wstrzyknięcie kulek do oczu, u których nie rozwija się wysoka liczba soczewek wewnątrzgałkowych.
18. Poddaj zwierzęta eutanazji przez uduszenie CO₂ na koniec eksperymentu.
19. Przeprowadź sekcję oczu i nerwów wzrokowych i utrwal 4% paraformaldehydu (PFA) na noc w celu dalszej analizy histologicznej.

2. Ocena uszkodzeń neuronów siatkówki za pomocą barwienia TUNEL

1. Aby określić ilościowo komórki apoptotyczne w całej siatkówce, należy użyć końcowego testu znakowania dUTP za pośrednictwem deoksynukleotydylotransferazy (TUNEL), zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Wyciąć siatkówkę z muszli ocznej, przemyć przez 3 x 5 minut 0,3% Triton X-100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (T-PBS).
3. Przepuszczalność tkanki w 3% T-PBS przez 2 godziny.
4. Wstępnie zrównoważyć siatkówki w buforze równowagi przez 10 minut, przed inkubacją w roztworze reakcyjnym TUNEL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Myć chusteczkę przez 3 x 5 minut w 0,3% T-PBS, spłukać w 0,3% T-PBS zawierającym 5 μM DAPI i zamontować płasko w podłożu montażowym.
6. Aby określić ilościowo jądra dodatnie TUNEL, użyj mikroskopu konfokalnego, aby pobrać 10 μm z-stacków przez warstwę komórek zwojowych w 20-krotnym powiększeniu. Wykonaj 3 zdjęcia na każdym z 4 płatków, w miejscach blisko nerwu wzrokowego, na środkowym obrzeżu i na dalekim obrzeżu siatkówki, co daje w sumie 12 obrazów na całe mocowanie, pobierając próbki około 7000 komórek. Kryteria morfologiczne odróżniały komórki nieneuronalne (śródbłonek i glej) od komórek neuronalnych.
7. Wybierz obszary do obrazowania przy użyciu tylko kanału DAPI i zamaskuj badaczy w grupach terapeutycznych.

3. Ocena uszkodzenia nerwu wzrokowego za pomocą barwienia błękitem toluidynowym

1. Nerwy wzrokowe naprawić przez noc w roztworze Karnovsky'ego w temperaturze 4 °C.
2. Traktuj próbki przez 2 godziny w 1% (w/v) tetratlenku osmu, a następnie odwodnij w 100% etanolu.
3. Inkubuj nerwy wzrokowe w tlenku propylenu przez 30 minut i umieść na noc w mieszaninie tlenku propylenu i araldytu w proporcji 50:50.
4. Zmienić ten roztwór na 100% araldyt, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 60 °C.
5. Wyciąć półcienkie odcinki (o grubości 0,75 mm) i wybarwić 1% błękitem toluidynowym/boraksem (TB) w 50% etanolu przed badaniem pod mikroskopem świetlnym.

4. Analiza statystyczna

1. Przeprowadzaj analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania statystycznego. Dwukierunkowa ANOVA z testem post-hoc Newmana-Keula może być wykorzystana do obliczenia istotności statystycznej dla zmian IOP w czasie.
2. Wartość p mniejsza niż 0,05 może być uznana za znaczącą.

Wyniki

Wstrzyknięcie kulek magnetycznych do kąta rogówkowo-tęczówkowego konsekwentnie wywoływało przedłużony i silny wzrost ciśnienia (Rysunek 1), który był wyraźnie obserwowalny w pierwszym punkcie czasowym, 3 dni po wstrzyknięciu. Ponadto wzrost ciśnienia utrzymywał się przez cały czas trwania eksperymentu, a choć nasz przebieg czasowy zakończył się w 18. dniu po wstrzyknięciu, inni autorzy zgłaszali, że podwyższone ciśnienie utrzymuje się długoterminowo³. Średnie IOP wyliczone dla całego okresu eksperymentu dla oczu kontrolnych, bez wstrzykniętych kulek, wynosiło 19,7 ± 0,3 mmHg, w porównaniu do 40,5 ± 2,8 mmHg dla oczu z wstrzykniętymi kulkami (P <0,001). Dodatkowo szczytowe IOP wzrosło z 22,8 ± 0,3 mmHg do 49,9 ± 2,3 mmHg.

Aby ustalić, czy podwyższenie IOP prowadzi do śmierci komórek zwojowych siatkówki, przeprowadziliśmy barwienie TUNEL siatkówek oraz badanie histologiczne poprzecznych przekrojów nerwu wzrokowego (Rysunek 2). W siatkówce zaobserwowaliśmy wzrost barwienia TUNEL (Rysunek 2A) w oczach po wstrzyknięciu kulek z podwyższonym IOP. Liczba apoptotycznych jąder wzrosła około 15-krotnie: z 1,6 ± 0,5 komórki w przeciwległych kontrolach do 24,5 ± 0,5 komórki w siatkówkach nadciśnieniowych (Rysunek 2B; P <0,05). Co więcej, w oczach, w których wstrzyknięto kulki magnetyczne, ale ciśnienie nie wzrosło (prawdopodobnie z powodu niepełnego zablokowania kąta przesieczno-rogówkowego), liczba komórek TUNEL-dodatnich nie różniła się istotnie od liczby w kontrolach niewstrzykniętych (P >0,05). Sugeruje to, że śmierć komórek była związana ze wzrostem ciśnienia, a nie z bezpośrednią toksycznością mikrosfer magnetycznych. Na koniec zbadaliśmy patologię nerwu wzrokowego w modelu jaskry i zaobserwowaliśmy gromadzenie się błękitu toluidyny w wielu aksonach, co wskazywało na degenerację tych wypustek komórkowych (Rysunek 2C).

Rysunek 1. Podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego przy użyciu mikrosfer magnetycznych. Wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do komory przedniej wywołało silny i znaczący wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w porównaniu z przeciwległymi kontrolnymi oczami, w których nie wykonano wstrzyknięcia. Jednostki na osi Y = milimetry słupa rtęci (mmHg). Dane = średnia ± SEM. * = P <0.001; N = 12. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Foxton et al., Am. J. Pathol. 182(4): 1379-1390.

Rycina 2. Podwyższenie IOP poprzez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do kąta rogówkowo-tęczówkowego wywołało śmierć neuronów w warstwie komórek zwojowych (GCL). (A) Reprezentatywne obrazy siatkówek z oczu kontrolnych (lewo) i z jaskrą (prawo), barwionych na jądra apoptotyczne metodą TUNEL (zielony; białe strzałki) i DAPI (niebieski), wskazujące na wzrost liczby jąder apoptotycznych wraz ze wzrostem IOP. (B) Ilościowe oznaczenie komórek TUNEL-dodatnich w GCL, pokazujące, że w oczach z podwyższonym IOP (środek) stwierdzono znacznie więcej komórek apoptotycznych w porównaniu z kontrolą (lewo). Z kolei w oczach po wstrzyknięciu kuleczek, w których ciśnienie nie wzrosło (prawo), nie zaobserwowano istotnego wzrostu barwienia TUNEL. Dane = średnia ± SEM. * = P <0.05; N = 7 - 8. (C) Reprezentatywne obrazy barwienia nerwu wzrokowego, wykazujące wzrost akumulacji błękitu toluidyny (czarne strzałki) w uszkodzonych aksonach w jaskrze (prawo), czego nie zaobserwowano w oczach kontrolnych (lewo). Paski skali = 50 μm. Rycina została zmodyfikowana z Foxton et al., Am. J. Pathol. 182(4): 1379-1390.

Dyskusja

Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego u szczura poprzez wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory oka. Ta metoda jest prosta do przeprowadzenia i wymaga niewielkiej wiedzy chirurgicznej lub godzin praktyki i udoskonalenia. Ponadto procedura jest skuteczna; rzadko wymaga więcej niż jednego wstrzyknięcia kulek w celu wywołania silnego, solidnego wzrostu ciśnienia (około 10% częstości ponownego wstrzykiwania). Może to zapewnić przewagę nad istniejącymi indukowalnymi metodami, takimi jak technicznie trudny model stwardnienia żył biskupich¹¹ lub protokół fotokoagulacji laserowej⁶, który może wymagać wielu procedur w celu utrzymania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego.

Aby jednak metoda odniosła sukces, należy podjąć kilka małych krytycznych kroków. Po pierwsze, przydatne jest użycie magnesu w kształcie toroidalnym do przyciągania koralików do kąta tęczówkowo-rogówkowego. Ten krok jest modyfikacją oryginalnego protokołu, w którym koraliki zostały wstrzyknięte do przedniej komory, a następnie przesuwane odręcznie wokół oka³. Zastosowanie magnesu toroidalnego oznacza, że mikrosfery powinny osiadać równomiernie wokół kąta, wymagając minimalnej ręcznej redystrybucji. Po drugie, szybkość wtrysku powinna być szybka – zbyt wolna, a kulki będą gromadzić się głównie po jednej stronie kąta, co prowadzi do niepełnego pokrycia i potencjalnie braku wzrostu ciśnienia. Ogólnie rzecz biorąc, metoda jest na tyle prosta, że użytkownik może łatwo wprowadzić modyfikacje do protokołu, takie jak zmiana rozmiaru lub objętości cząstek mikrosfery, być może w celu zmiany stopnia podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego.

Jednak jedną z potencjalnych wad tej metody jest to, że ma się niewielką kontrolę nad rozległością nadciśnienia, które w około 5-10% obserwowanych przez nas przypadków wzrosło powyżej 60 mmHg. Nadmierny wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego może być bardzo destrukcyjny dla tkanki siatkówki i może utrudnić badanie mechanizmów i biologii śmierci komórki. Jednak metoda ta prowadzi do spójnej patologii neuronalnej, zarówno w siatkówce, jak i nerwie wzrokowym, którą można manipulować farmakologicznie12. To może sprawić, że model ten będzie atrakcyjny dla opracowywania nowych terapii w leczeniu jaskry. Dodatkowo, ponieważ koraliki są skierowane do kąta tęczówkowo-rogówkowego, pozostawia to oś widzenia wolną do obrazowania siatkówki lub tarczy nerwu wzrokowego na żywo. Przewidujemy, że model ten zostanie zaadaptowany i wykorzystany do przyszłych zastosowań u innych gatunków, w tym u myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
250 - 300g samica brązowego Norwegii byłego szczura hodowlanego	Harlan UK	203
Tonolab Rebound Tonometer	Tiolat	TV02
Ketaset (ketamina)	Fort Dodge Zdrowie zwierząt	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (chlorowodorek medetomidyny)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Jod powidonu	Ecolab	BN4369LE10	5% w H2O
Roztwór soli fizjologicznej Minima	Bausch and Lomb	PL00033/5017
Magnes toroidalny	Supermagnete	R-10-07-03-N
Mikrosfery magnetyczne	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G igła skośna	Hamilton	7747-01	Niestandardowa
strzykawka z końcówką Luer	Hamilton	80601
Antisedan (chlorowodorek atypemozolu	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Maść chloramfenikolowa	Medicom	18956-0005
Zestaw do barwienia TUNEL	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Nośnik montażowy Vectashield	Vector Labs	H-1000

)