Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest niedoszczepiona immunologicznie i wysoce unaczyniona, co czyni ją naturalnym modelem in vivo wzrostu guza i angiogenezy. W tym protokole opisujemy wiarygodną metodę hodowli trójwymiarowych, unaczynionych guzów raka wątrobowokomórkowego (HCC) za pomocą testu CAM.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Błona kosmówkowo-omoczniowa piskląt (CAM) zaczyna się rozwijać w 7 dniu po zapłodnieniu i dojrzewa w 12 dniu. CAM ma naturalny niedobór odporności i jest wysoce unaczyniony, co czyni go idealnym systemem do implantacji guza. Ponadto CAM zawiera białka macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak fibronektyna, laminina, kolagen, integryna alfa(v)beta3 i MMP-2, co czyni go atrakcyjnym modelem do badania inwazji guza i przerzutów. Naukowcy od dawna wykorzystują fizjologię CAM, wykorzystując ją jako model angiogenezy. Niedawno test CAM został zmodyfikowany tak, aby działał jako system modelowy ksenoprzeszczepów in vivo dla różnych nowotworów, który wypełnia lukę między podstawowymi pracami in vitro a bardziej złożonymi modelami raka zwierzęcego. Test CAM pozwala na badanie wzrostu guza, terapii przeciwnowotworowych i pronowotworowych szlaków molekularnych w biologicznie istotnym systemie, który jest efektywny zarówno kosztowo, jak i czasowo. W tym miejscu opisujemy rozwój modelu ksenoprzeszczepu CAM raka wątrobowokomórkowego (HCC) z przeżywalnością zarodka do 93% i wiarygodnym pobraniem guza prowadzącym do wzrostu trójwymiarowych, unaczynionych guzów.
Wprowadzenie
Test CAM był szeroko stosowany do badania angiogenezy4. Został również z powodzeniem opracowany w model ksenoprzeszczepu nowotworowego nowotworów, w tym glejaka5, raka trzustki6, czerniaka7-9 i kostniakomięsaka10-11. W literaturze wykorzystano zarówno techniki in ovo12, jak i ex ovo13, przy czym szczegóły różnią się w zależności od protokołu. Jednym z głównych wyzwań dla modelu ksenoprzeszczepu CAM jest stosunkowo wysoka częstość śmierci zarodka po manipulacji komórką jajową, z opublikowanymi wskaźnikami śmiertelności zarodków piskląt w zakresie od 25 do 50 procentw wieku 11-14 lat.
W tym artykule opisujemy rozwój modelu in ovo ksenoprzeszczepu HCC, który niezawodnie powoduje wzrost trójwymiarowych, unaczynionych guzów, które histologicznie przypominają niezróżnicowane HCC. Zaadaptowaliśmy protokół opisany po raz pierwszy przez Ossowskiego i wsp. 14 i osiągnęły wskaźniki przeżywalności zarodków piskląt do 93% przy wyjątkowo wysokim przeszczepie guza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Inkubacja jaj
- Uzyskać 8-dniowe jaja zarodkowe wolne od określonych patogenów.
- Umieść jajka w obrotowej tacce na jajka, stemplowanymi końcami skierowanymi do góry i umieść obrotową tacę w inkubatorze do jaj. Inkubować jaja przez 48 godzin w temperaturze 36 °C i wilgotności 50%.
2. Upuszczanie CAM i otwieranie jaj
- Zbierz jaja z inkubatora. Umieść jajka w stojaku na jajka, stemplowaną stroną do góry i doprowadź do okapu z przepływem laminarnym.
- Wyłącz światła w pomieszczeniu i okapie.
- Lekko przyłóż wytłoczony koniec jajka do świecy do jajek, aby odsłonić układ naczyniowy CAM oraz worek powietrzny.
UWAGA: Świeca do jaj jest źródłem światła używanym do wizualizacji rozwijającego się zarodka i związanego z nim worka powietrznego i naczyń krwionośnych. - Umieść znak ołówka między dwoma głównymi naczyniami krwionośnymi.
- Włącz światła i za pomocą sterylnego popychacza wykonaj jeden otwór na końcu jajka nad workiem powietrznym (wytłoczony koniec) i jeden otwór w śladzie ołówka. Nie wciskaj szpilki do końca; Zwykle wystarczy otwór o głębokości około 3 mm.
- Wyłącz światła. Ściśnij bańkę bezpieczeństwa, mocno dociskając otwarty koniec do otworu nad workiem powietrznym. Zastosuj ssanie, aby wciągnąć powietrze do otworu w śladzie ołówka, powodując opadnięcie CAM z muszli w miejscu znaku ołówka.
- Sprawdź, czy worek powietrzny przesunął się z wytłoczonego końca jajka do otworu oznaczonego ołówkiem za pomocą świecznika. Jeśli tak się nie stało, użyj pinezki, aby nieco pogłębić oba otwory, a następnie ponownie zastosuj ssanie za pomocą gruszki bezpieczeństwa.
- Włącz światła. Trzymając jajko w jednej ręce, włącz narzędzie obrotowe dremel z dołączoną tarczą tnącą 15/16 cala i wykonaj dwa poprzeczne nacięcia na tyle głęboko, aby przeciąć skorupę, ale nie na tyle głęboko, aby przeciąć aż do wciśniętej krzywki. Wykonaj nacięcia o długości około 2 cm i w odległości 1 cm od siebie. Wykonaj nacięcia na tyle szerokie, aby mógł przejść przez nie silikonowy pierścień o średnicy 1 cm, ale cieńszy niż szerokość standardowej taśmy klejącej.
- Następnie wykonaj 1 cięcie wzdłużne między i na końcach dwóch poprzecznych cięć, lekko dotykając tarczą tnącą do skorupy.
- Wsuń sterylne kleszczyki pod skorupę i równolegle do muszli. Chwyć kawałek muszli kleszczami i usuń cały kawałek czysto.
- Umieść taśmę klejącą na nowo otwartym oknie, upewniając się, że jeden koniec jest złożony na siebie, aby ułatwić usunięcie.
- Umieść jaja z powrotem w inkubatorze w tacce na jajka (NIE w obrotowych stojakach na jajka) do czasu zaszczepienia.
3. Szczepienie
- Mieszaninę białek błony podstawnej, taką jak matrigel, należy przechowywać na lodzie (aby zapobiec polimeryzacji) i umieścić w kapturze.
- Użyć 2 mM EDTA do odłączenia komórek (4 - 5 ml na kolbę T75) i umieścić kolby w inkubatorze do hodowli tkankowych na 5 minut.
- Ponownie zawiesić oderwane komórki w pożywce i policzyć za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Użyj od 500 000 do 2 000 000 komórek do szczepienia na CAM, w zależności od linii komórkowej. Zoptymalizuj odpowiednią liczbę we wstępnych eksperymentach.
- Odmierz objętość wymaganą dla odpowiedniej liczby komórek i odwiruj przy 500 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 μl PBS++ i 20 μl mieszaniny błony podstawnej.
UWAGA: W tym momencie komórki można leczyć lekami lub innymi środkami testowymi w razie potrzeby do eksperymentów poprzez ponowne zawieszenie w zawiesinie mieszaniny komórka/błona podstawna. Alternatywnie, środki mogą być pipetowane na zawiesinę mieszaniny komórka/błona podstawna po szczepieniu. - Wyjmij stojak na jajka z jajami z inkubatora i umieść w okapie z przepływem laminarnym.
- Odklej taśmę od okna, wyjmij silikonowy pierścień o średnicy 1 mm z nakrętki fiolki kriogenicznej za pomocą wysterylizowanych kleszczy i upuść pierścień przez okienko.
- Odpipetować 60 μl roztwór komórek PBS++ i mieszaniny błony podstawnej bezpośrednio do środka pierścienia silikonowego spoczywającego na CAM.
- Zaklej ponownie okno taśmą i przenieś stojak na jajka z powrotem do inkubatora. W tym momencie należy zachować ostrożność podczas przenoszenia jaj, ponieważ pierścień i zawiesina komórek mogą łatwo ulec przemieszczeniu.
- Pozwól guzom rosnąć przez 5 do 7 dni.
4. Zbieranie nowotworów
- Umieść podkładkę w kapturze. Przygotuj płytki o wymiarach 35 x 10 mm i pojemniki paraformaldehydowe zgodnie z potrzebami do badania histologicznego. Umieść 1 ml PBS++ na każdej płytce o wymiarach 35 x 10 mm.
- Umieść torbę z zagrożeniem biologicznym w kapturze. Weź sterylne nożyczki do rozwarstwiania i włóż spiczasty koniec do jajka w otworze w pobliżu wytłoczonego końca.
- Przeciąć całe jajko wzdłuż.
UWAGA: CAM i guz z pierścieniem powinny przylegać do górnej połowy skorupy z okienkiem. - Za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy wypreparuj guz z dala od CAM i umieść guz na płytce o wymiarach 35 x 10 mm. Zmierz i zważ guzy. Utrwalił guzy w paraformaldehydzie, a następnie zatopił je w parafinie do wykorzystania w eksperymentach histologicznych i immunohistochemicznych.
5. (Opcjonalnie): Dysocjacja komórek nowotworowych
- Użyj nożyczek preparacyjnych, aby zmielić guz na płytce 35 x 10 mm. Wlej zmielony guz do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i usuń jak najwięcej PBS++ poprzez pipetowanie.
- Dodać 2 ml kolagenazy (1 mg/ml w PBS++), kilkakrotnie obrócić probówkę i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut (do kilku godzin).
- Dodać 5 ml pożywki do każdej probówki i dokładnie zawiesić, pipetując w górę i w dół 20 - 40 razy. Dokładne pipetowanie ma kluczowe znaczenie dla całkowitej dysocjacji komórek.
- Pozostawić osad do opadnięcia i przenieść supernatant do świeżej probówki. Wirować przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant, pozostawiając zdysocjowaną osadkę komórkową.
UWAGA: W tym momencie granulki komórkowe mogą być używane do różnych eksperymentów (cytometria przepływowa, liza do stosowania w Western blotting, izolacja RNA itp.). Całkowitą liczbę komórek nowotworowych można również uzyskać za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Należy pamiętać, że mniejsze, owalne komórki są komórkami kurczaka z CAM i nie powinny być liczone jako komórki nowotworowe. Powinna istnieć minimalna liczba zanieczyszczających komórek nienowotworowych (CAM), jeśli guz jest ostrożnie wycinany z dala od CAM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poniżej przedstawiono reprezentatywne zdjęcia kluczowych etapów protokołu. Rysunek 1A obrazuje użycie świeca do wizualizacji rozwijającego się zarodka, pęcherzyka powietrznego oraz unaczynienia błony CAM. Rysunek 1B-1C pokazują proces opuszczania błony CAM poprzez wykonanie dwóch otworów i następnie zastosowanie podciśnienia za pomocą gruszki bezpieczeństwa, a Rysunek 1D przedstawia pomyślnie opuszczoną błonę CAM z dużym pęcherzem powietrznym pod otworem zaznaczonym ołów...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kilka kluczowych kroków w tym protokole najprawdopodobniej odpowiada za poprawę przeżywalności zarodka, a także zwiększoną niezawodność wzrostu guza. Upuszczenie CAM z dala od skorupy poprzez zastosowanie ssania do worka powietrznego jest mniej inwazyjne niż inne istniejące metody (użycie igły do usunięcia albuminy z jaja, rozwarstwienie itp.). Użycie sterylnego pinezki do stworzenia dwóch małych otworów wymaganych do tej metody jest najtrudniejszą częścią protokołu. Użycie zbyt dużej siły może spowodować uszkodzenie CAM...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
A.S. otrzymuje fundusze od firmy farmaceutycznej Advaxis na wsparcie badania klinicznego zainicjowanego przez badacza.
Podziękowania
A.S. było częściowo wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH), National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) i National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
Instytut Medyczny Howarda Hughesa zapewnił finansowanie dla M.L. poprzez HHMI Medical Research Fellows Program.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Jaja inkubowane premium | River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Inkubatory do jaj | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Obrotowe tacki na jajka | GQF | 1611 Automatyczna obracarka | |
| jaj Świecarka do jaj | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Narzędzie obrotowe Dremel 100 z tarczą do cięcia 15/16 | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterylne kleszcze, pinezki, nożyczki preparacyjne, taśma | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Fiolki kriogeniczne, gwint zewnętrzny z podkładką silikonową | Corning | 430659 | |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
Bibliografia
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241(2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58(2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522(2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485(2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
