Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

DOI:

10.3791/52423

⸱

19 lutego 2015

 , 
1Centre for Vascular Research, University of New South Wales, 2School of Medical Sciences, University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do ciągłego ilościowego oznaczania procesów adhezji i deadhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową w sposób nieinwazyjny poprzez impedancję substratu komórkowego i analizy obrazowania żywych komórek. Podejścia te ujawniają dynamikę procesów adhezji/deadhezji komórek wyzwalanych przez modyfikację matrycy i ich czasowy związek ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi zależnymi od adhezji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhezja macierzy komórkowej odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu morfologii komórki i sygnalizacji. Bodźce, które zaburzają adhezję macierzy komórkowej (np. mieloperoksydaza i inne utleniacze/enzymy modyfikujące macierz uwalniane podczas stanu zapalnego) są zaangażowane w wywoływanie patologicznych zmian w funkcjonowaniu komórki, fenotypie i żywotności w wielu chorobach. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób impedancja komórka-substrat i podejścia do obrazowania żywych komórek mogą być łatwo wykorzystane do dokładnego ilościowego określenia zmian w czasie rzeczywistym w adhezji i deadhezji komórek wywołanych modyfikacją macierzy (przy użyciu komórek śródbłonka i mieloperoksydazy jako patofizjologicznego bodźca modyfikującego matrycę) z wysoką rozdzielczością czasową i w sposób nieinwazyjny. System impedancji komórka-substrat xCELLigence w sposób ciągły określa ilościowo obszar adhezji komórka-matryca, mierząc impedancję elektryczną na granicy faz komórka-podłoże w komórkach hodowanych na złotych matrycach mikroelektrod. Analiza obrazu poklatkowych różnicowych filmów interferencyjnych z kontrastem ilościowym określa ilościowo zmiany w rzutowanym obszarze poszczególnych komórek w czasie, reprezentując zmiany w obszarze kontaktu komórka-matryca. Obie techniki dokładnie określają ilościowo szybkie zmiany w procesach adhezji i deadhezji komórkowej. Impedancja podłoża komórkowego na matrycach bioczujników mikroelektrodowych stanowi platformę do solidnych, wysokowydajnych pomiarów. Analizy obrazowania żywych komórek dostarczają dodatkowych szczegółów dotyczących charakteru i dynamiki zmian morfologicznych określanych ilościowo za pomocą pomiarów impedancji komórka-substrat. Te uzupełniające się podejścia dostarczają cennych nowych informacji na temat tego, w jaki sposób katalizowana przez mieloperoksydazę oksydacyjna modyfikacja subkomórkowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej wyzwala szybkie zmiany w adhezji komórek, morfologii i sygnalizacji w komórkach śródbłonka. Podejścia te mają również zastosowanie do badania dynamiki adhezji komórkowej w odpowiedzi na inne bodźce modyfikujące macierz oraz w powiązanych komórkach przylegających (np. komórkach nabłonkowych).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabilne kontakty adhezyjne między komórkami i otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową są niezbędne do utrzymania homeostazy tkanek. Na przykład adhezja komórek śródbłonka do macierzy podśródbłonkowej w naczyniach krwionośnych odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności warstwy śródbłonka i jej homeostatycznej funkcji jako regulacyjnej, półprzepuszczalnej bariery naczyniowej1. Cytoszkielet aktynowy jest mechanicznie sprzężony z cząsteczkami macierzy adhezyjnej w miejscach adhezji macierzy komórkowej, a kontakty adhezyjne na granicy faz komórka-matryca odgrywają ważną rolę w określaniu położenia błony komórkowej, opierając się centralnie skierowanym siłom rozciągającym aktomiozynę. Bodźce zewnątrzkomórkowe, które zmieniają adhezję komórka-macierz, z konieczności zmieniają równowagę sił na granicy komórka-macierz, zdarzenie, które jest szybko "wyczuwane" przez mechanowrażliwe białka sygnałowe, co skutkuje transdukcją "sygnalizacji zewnętrznej do wewnątrz". Ten wzajemny oddziaływanie między komórkami i otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu kształtu, ruchliwości, funkcji, proliferacji i przeżycia komórek2.

Różnorodne procesy patofizjologiczne (rozwój embrionalny, zapalenie, gojenie ran i przerzuty raka) charakteryzują się dynamiczną przebudową substratów matrycy adhezyjnej przez utleniacze rozkładające matrycę i/lub enzymy3,4. Na przykład adhezyjne białka macierzy podśródbłonkowej w naczyniach krwionośnych (np. fibronektyna) są uważane za główne cele modyfikacji lub degradacji w chorobach zapalnych u ludzi ze względu na miejscową produkcję reaktywnych utleniaczy (np. kwasu podchlorawego, HOCl) przez enzym mieloperoksydazę pochodzącą z leukocytów (MPO), który gromadzi się w śródbłonku podczas zapalnej choroby naczyniowej (ryc. 1)5-9. Zmiany w adhezji macierzy komórkowej wywołane przez utleniacze pochodzące z MPO i inne bodźce modyfikujące matrycę mogą odgrywać ważną rolę w zmianie homeostazy naczyń krwionośnych podczas różnych procesów patologicznych; Na przykład poprzez zmianę sygnalizacji, morfologii i żywotności komórek śródbłonka, co z kolei zaburza funkcję śródbłonka i integralność bariery. Jednak morfologiczne i sygnalizacyjne odpowiedzi komórek przylegających do modyfikacji macierzy zewnątrzkomórkowej dopiero zaczynają być rozumiane.

Aby zrozumieć, w jaki sposób modyfikacje matrycy napędzają zmiany w dynamice adhezji komórek i zależnych od adhezji szlakach sygnalizacji komórkowej, potrzebne są techniki, które dokładnie określają ilościowo zmiany w adhezji matrycy komórkowej w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością czasową. W tym miejscu opisujemy komplementarne techniki impedancji impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek, które spełniają te kryteria i stanowią platformę do ilościowego określania procesów adhezji i deadhezji komórek w sposób nieinwazyjny.

Pokazujemy, jak te podejścia do impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek mogą być łatwo wykorzystane do (i) monitorowania dynamiki przyłączania i rozprzestrzeniania się komórek (tj. adhezji komórek de novo) na natywnych i zmodyfikowanych substratach matrycy oraz (ii) do pomiaru dynamiki odklejania się matrycy komórkowej (tj. deadhezji) przez przylegające komórki wystawione na bodźce modyfikujące matrycę. System biosensorów impedancji komórka-substrat xCELLigence zapewnia ciągły pomiar obszaru styku komórka-matryca poprzez ilościowe określenie impedancji elektrycznej na powierzchni 96-dołkowych złotych układów mikroelektrod i wyraża te pomiary impedancji elektrycznej jako "indeks komórki", bezwymiarową wartość, która jest w dużej mierze proporcjonalna do obszaru styku komórka-podłoże10 (Rysunek 2), przy jednoczesnej wrażliwości na zmiany średniej odległości między (izolującą) błoną komórkową a powierzchnią elektrody11. Dalszy wzrost wartości indeksu komórkowego osiąga się również po utworzeniu ścisłych kontaktów komórka-komórka, które ograniczają przepływy prądów parakomórkowych, warunki, które nie występują w eksperymentach opisanych w tym badaniu. Pomiar rzutowanego obszaru poszczególnych komórek w czasie za pomocą analizy obrazu filmów z poklatkowym kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC) zapewnia uzupełniający pomiar zmian w obszarze kontaktu komórka-substrat i dostarcza dodatkowych informacji dotyczących dokładnej natury i dynamiki zmian morfologicznych określanych ilościowo za pomocą podejścia impedancji komórka-substrat.

Konkretnie, opisujemy zastosowanie tych podejść do monitorowania, jak utlenianie za pośrednictwem MPO adhezyjnych białek macierzy podśródbłonkowej (np. fibronektyny) (i) zmniejsza de novo adhezję zawieszonych komórek śródbłonka do oczyszczonej fibronektyny i (ii) powoduje deadhezję macierzy komórkowej w komórkach śródbłonka z ustaloną adhezją na fibronektynie. Wykonując równoległe analizy sygnalizacji komórkowej w czasie przy użyciu odpowiednich testów biochemicznych (np. Western blotting), można określić czasowe i przyczynowe relacje między procesami adhezji/deadhezji a powiązanymi zmianami w zdarzeniach sygnalizacji komórkowej zależnych od adhezji.

Te podejścia zostały ostatnio użyte do wykazania, że utlenianie macierzy zewnątrzkomórkowej katalizowane przez podśródbłonkowe złogi MPO powoduje szybką utratę adhezji komórek śródbłonka do macierzy komórkowej, która jest napędzana przez istniejące wcześniej siły skurczu aktomiozyny9. Co ważne, umożliwiając określenie czasowego związku między zmianami zarówno w adhezji komórek, jak i zależnej od adhezji sygnalizacji komórkowej, podejścia te pozwoliły zidentyfikować, że indukowana przez MPO modyfikacja macierzy i deadhezja komórkowa wywołują zmiany w ważnych szlakach sygnalizacji komórkowej zależnych od adhezji, w tym fosforylację paxyliny zależną od kinazy Src i fosforylację łańcucha lekkiego II miozyny (Figura 1)9. Ten tryb sygnalizacji zależnej od redoks, obejmujący aktywację wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych przez zewnątrzkomórkowe reakcje oksydacyjne, które zakłócają adhezję macierzy komórkowej, reprezentuje nowy tryb sygnalizacji komórkowej określany jako "sygnalizacja redoks na zewnątrz do wewnątrz" (ryc. 1) 9.

Ogólnie rzecz biorąc, te komplementarne podejścia do biosensorycznego czujnika impedancji i obrazowania żywych komórek powinny być cenne w odkrywaniu, jak różne bodźce lub czynniki modyfikujące matrycę napędzają zmiany w dynamice adhezji komórek, morfologii i sygnalizacji w różnych przylegających typach komórek podlegających szerokiej gamie ustawień eksperymentalnych.

Poniższy protokół opisuje, jak określić ilościowo wpływ utleniania matrycy za pośrednictwem MPO na procesy adhezji komórek śródbłonka de novo (Eksperyment 1) i deadhezji komórek śródbłonka (Eksperyment 2). MPO wiąże się zachłannie z fibronektyną i innymi adhezyjnymi subśródbłonkowymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej i wykorzystuje nadtlenek wodoru (H2O2) do przekształcania jonów chlorkowych (Cl–) w wysoce reaktywny chlorujący utleniacz kwas podchlorawy (HOCl), który reaguje lokalnie z tymi białkami macierzy i zakłóca ich właściwości adhezyjne komórek (Figura 1)8,9,12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ogólna hodowla komórek śródbłonka

  1. Hodowla komórek śródbłonka aorty bydlęcej (pasaże 4–9) na kolbach do hodowli tkankowych pokrytych żelatyną (powierzchnia hodowli tkankowej płaszcza z 0,1% w/v żelatyny w PBS w temperaturze pokojowej przez 15 min) w pożywce EGM-2 (z zestawem EGM-2 zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej, czynniki wzrostu i wszystkie suplementy dostarczone przez producenta, z wyjątkiem hydrokortyzonu).
  2. Gdy komórki są prawie zlewające się (ok. 3 dni po wysiewie po podziale 1:4), zbierz komórki przez traktowanie 0,05% w/v trypsyny / 0,02% w/v EDTA w PBS w temperaturze 37 °C. Po odłączeniu większości komórek dodaj pełną pożywkę EGM-2 w celu wygaszenia trypsyny, a następnie odwiruj (100 x g, 5 min).
  3. Przygotuj komórki do badań nad adhezją de novo komórek śródbłonka do fibronektyny (Eksperyment 1: Sekcja 2) i późniejszym odadhezją komórek śródbłonka z ustaloną adhezją do tego podłoża (Eksperyment 2: Sekcja 3).
    1. Pobrane komórki przepłukać jednokrotnie pożywką 199 bez surowicy zawierającą 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i ponownie odwirować (100 x g, 5 min).
    2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce 199 bez surowicy zawierającej 1% w/v BSA przy 2,5 x 105 komórek/ml (pomiary impedancji substratu komórkowego) lub 5 x 105 komórek/ml (analizy obrazowania żywych komórek) i utrzymać w temperaturze 37 °C przed użyciem.
      UWAGA: Reakcje adhezyjne komórek są bardzo wrażliwe na różnice temperatur (np. z powodu efektów konwekcji), dlatego wszystkie urządzenia i roztwory używane do obsługi i leczenia komórek podczas poniższych protokołów powinny być utrzymywane w stałej temperaturze 37 °C.

2. Eksperyment 1: Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka de novo na natywnej i utlenionej MPO fibronektynie (impedancja substratu komórkowego)

UWAGA: Eksperyment 1 bada stopień, w jakim utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO osłabia jej zdolność do wspierania adhezji de novo zawieszonych komórek śródbłonka.

  1. Pokryj fibronektynę na 96-dołkowych układach mikroelektrod o impedancji złotego podłoża komórkowego. Dodać 80 μl/basenik oczyszczonej fibronektyny bydlęcej w stężeniu 5 μg/ml w PBS, inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i usunąć roztwór.
  2. Inkubować powierzchnie pokryte fibronektyną z MPO, aby umożliwić wiązanie MPO z fibronektyną związaną z powierzchnią. Dodać 80 μl/basenik oczyszczonych ludzkich neutrofili MPO o stężeniu 20 nM w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) i inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Umyj powierzchnie dwukrotnie HBSS, aby usunąć wszelkie niezwiązane MPO.
  4. DodaćH2O2(stężenie końcowe 0-10 μM) do studzienek płytki układu mikroelektrod zawierających 80 μl/dołek HBSS w celu zainicjowania katalizowanego MPO, zależnego od HOCl utleniania fibronektyny i inkubować przez kolejne 0,5 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. W celu zbadania wpływu odpowiednich inhibitorów lub modulatorów reakcji katalizowanych MPO (np. alternatywnych substratów enzymów MPO, inhibitorów enzymów lub przeciwutleniaczy; szczegółowe informacje patrz9), należy dodać je do HBSS bezpośrednio przed dodaniemH2O2
    6. .
  6. Po 0,5 godziny potraktuj powierzchnie metioniną, aby ugasić resztki utleniających się związków związanych z powierzchnią; tj. reaktywne chloraminy związane z białkami, które mogą wywierać zakłócającą aktywność komórkową. Dodać 10 mM metioniny do 80 μl HBSS na studzienkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Blokuj powierzchnie za pomocą BSA. Dodać 80 μl/basenik BSA o stężeniu 0,2% w/v w PBS, inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i usunąć roztwór.
    UWAGA: Szczątkowe niepowlekane obszary powierzchni będą wspierać adhezję komórek, a zablokowanie ich za pomocą nieadhezyjnego białka (tj. BSA) zapewnia, że odpowiedzi adhezyjne komórek ściśle zależą od zastosowanej oczyszczonej matrycy adhezyjnej komórek, w tym przypadku fibronektyny.
  8. Umyj powierzchnie dwukrotnie za pomocą HBSS.
    UWAGA: Żadna z powyższych obróbki powierzchni nie wpływa znacząco na odczyty substratu komórkowego.
  9. Zawiesiny nasiennej komórek śródbłonka (dodać 200 μl/studzienkę w tempie ok. 2,5 x 105 komórek/ml, przygotowanych w pożywce 199 bez surowicy zawierającej 1% BSA; patrz 1.3) na powierzchnie pokryte natywną lub utlenioną fibronektyną MPO.
  10. Natychmiast po wysianiu komórek (tj. przed przyłączeniem i rozprowadzeniem komórek) zamontuj płytkę z matrycą mikroelektrod na porcie inkubatora (umieszczonym w inkubatorze o temperaturze 37 °C w obecności 5%CO2).
    1. Korzystając z oprogramowania przyrządu, natychmiast wykonaj "pusty" odczyt w celu znormalizowania kolejnych wartości impedancji ogniwo-substrat ("indeks komórki") do początkowych wartości tła uzyskanych przy braku adhezji komórek.
    2. Rozpocznij akwizycję ciągłych danych indeksu komórek (co najmniej jeden odczyt indeksu komórki/min).
  11. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny, przy czym jest to okres, w którym osiąga się maksymalne przyłączanie i rozprzestrzenianie komórek; znajduje to odzwierciedlenie w ustabilizowaniu się wartości wskaźnika komórek (patrz rysunek 3A).
    UWAGA: Poprzedni eksperyment (Eksperyment 1) bada, w jaki sposób początkowe utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO ogranicza zdolność komórek śródbłonka do ustanowienia adhezji komórkowej na tym podłożu. Poniższy eksperyment (Eksperyment 2) bada, w jaki sposób utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO sprzyja zmniejszeniu adhezji macierzy komórkowej (tj. Deadhezji) w komórkach śródbłonka z ustaloną adhezją do tego substratu. Leczenie w tych dwóch eksperymentach jest zasadniczo identyczne, z wyjątkiem czasu utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO (tj. przed adhezją komórek – Eksperyment 1; po adhezji komórek – Eksperyment 2).

3. Eksperyment 2: Kwantyfikacja deadhezji komórek śródbłonka od fibronektyny w odpowiedzi na utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO (impedancja substratu komórkowego i obrazowanie żywych komórek)

  1. Pokryj fibronektynę na 96-dołkowych złotych matrycach mikroelektrod w celu pomiaru impedancji substratu komórkowego (dodać 80 μl/basenik fibronektyny przy 5 μg/ml w PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C) lub 35-milimetrowe szalki do hodowli komórkowych ze szklanym dnem do analiz obrazowych żywych komórek (dodać 2 ml/naczynie fibronektyny w stężeniu 5 μg/ml w PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C).
  2. Blokuj powierzchnie za pomocą BSA. Dodać BSA w stężeniu 0,2% m/v w PBS o objętościach wskazanych w ppkt 3.1 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Inkubować powierzchnie z MPO, aby umożliwić wiązanie MPO z fibronektyną. Dodać 20 nM oczyszczonego ludzkiego MPO do HBSS o objętościach wskazanych w ppkt 3.1 i inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Umyj powierzchnie dwukrotnie HBSS, aby usunąć wszelkie niezwiązane MPO.
  5. Zawiesiny nasienne komórek śródbłonka (przygotowanych w pożywce 199 bez surowicy, zawierającej 1% w/v BSA; patrz 1.3) na powierzchniach pokrytych fibronektyną natywną lub zawierającą MPO.
    1. Dodaj 200 μl / studzienkę przy 2,5 x 105 ogniw / ml do 96 dołków mikroelektrod impedancji substratu komórkowego.
    2. Dodać 2 ml / naczynie w proporcji 5 x 105 komórek/ml do naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem.
  6. Bezpośrednio po wysianiu komórek (tj. przed przyłączeniem się i rozprzestrzenieniem komórek):
    1. Zamontuj 96-dołkowe płytki układu mikroelektrod na porcie inkubatora impedancji ogniwo-substrat (umieszczonym w inkubatorze o temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 ) i wykonaj "ślepe" odczyty, aby rozpocząć ciągłe pobieranie danych o indeksie komórek (patrz sekcja 2.10).
    2. Przenieść szalki do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem do inkubatora o temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .
  7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby umożliwić maksymalne przyłączenie i rozprzestrzenienie komórek (porównaj sekcja 2.11).
  8. Na krótko wyjąć 96-dołkową płytkę z matrycą mikroelektrod (w tym momencie wstrzymać odczyty indeksu komórek) lub 35-milimetrową szalkę do hodowli komórek ze szklanym dnem z inkubatora w temperaturze 37 °C, usunąć supernatant komórek i dodać ogrzany (37 °C) HBSS (objętości jak w kroku 3.1).
    UWAGA: HBSS jest stosowany podczas badania reakcji utleniania katalizowanych przez MPO zamiast kompletnych pożywek hodowlanych, ponieważ te ostatnie zawierają utleniające się gatunki, które zakłócają reakcje utleniania.
  9. Aby zbadać wpływ inhibitorów/modulatorów reakcji katalizowanych przez MPO (alternatywne substraty enzymatyczne, inhibitory enzymów lub przeciwutleniacze) lub inhibitorów sygnalizacji komórkowej (np. 40 μM blebbistatyna w celu zahamowania kurczliwości aktomiozyny), dodaj je teraz.
  10. Natychmiast umieścić płytkę z matrycą mikroelektrod z powrotem w porcie inkubatora o temperaturze 37 °C (w tym momencie ponownie rozpocząć odczyty indeksu komórek) lub naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom zrównoważyć się w HBSS przez 0,5 godz.
    UWAGA: Po 0,5 godziny równowagi w HBSS wartości indeksu komórek stabilizują się na nieco niższych wartościach; Podczas wstępnej inkubacji komórek z substratami enzymatycznymi, inhibitorami enzymów i sygnalizacji komórkowej lub przeciwutleniaczami należy najpierw upewnić się, że nie wpływają one znacząco na wartości uzyskane po zrównoważeniu.
  11. Zainicjuj katalizowane MPO, zależne od HOCl utlenianie fibronektyny i deadhezję.
    1. Do badań impedancji ogniw przy użyciu 96-dołkowych płytek z matrycą mikroelektrod:
      1. Wyjąć płytkę z matrycą mikroelektrod z inkubatora i wstrzymać pomiary wskaźnika komórki.
      2. DodaćH2O2(końcowe stężenie 0-10 μM) do HBSS i delikatnie wymieszać, wielokrotnie pipetując.
      3. Natychmiast ponownie zamontuj matrycę mikroelektrod z powrotem w porcie inkubatora o temperaturze 37 °C i ponownie rozpocznij rejestrację odczytów indeksu komórek.
    2. Do badań obrazowania żywych komórek przy użyciu 35-milimetrowej płytki do hodowli komórkowych ze szklanym dnem:
      1. Wyjąć naczynie hodowlane z inkubatora i zamontować na podgrzewanym w temperaturze 37 °C stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w soczewkę obiektywu wodnego o powiększeniu 63x z odpowiednią optyką DIC do nagrywania filmów z komórek na żywo.
      2. Skoncentruj się na komórkach i zoptymalizuj optykę DIC (oświetlenie Köhlera, opóźnienie polaryzacji i przesunięcie/wzmocnienie kamery; szczegółowe informacje znajdują się w13).
      3. Rozpocznij film DIC i rejestruj odczyty wyjściowe nieleczonych komórek przez 1 minutę.
      4. DodaćH2O2(końcowe stężenie 0-10 μM) i delikatnie wymieszać przez wielokrotne pipetowanie. Ponownie ustaw ostrość mikroskopu (jeśli to konieczne) i kontynuuj nagrywanie filmów DIC leczonych komórek przez wymagany okres czasu.

4. Analiza i prezentacja danych

  1. Dane dotyczące impedancji podłoża ogniwa
    1. Eksportuj nieprzetworzone dane (indeks komórki w funkcji czasu) do arkusza kalkulacyjnego.
    2. W przypadku badań deadhezji komórek (Eksperyment 2: Sekcja 3) należy znormalizować dane, ustawiając wartości zarejestrowane bezpośrednio przed rozpoczęciem utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO na wartość 1 (tj. bezpośrednio przed dodaniemH2O2 w 3.11.1.1).
      UWAGA: Gwarantuje to, że względne zmiany w wartościach indeksu komórkowego wywołane utlenianiem fibronektyny za pośrednictwem MPO nie są maskowane przez małe początkowe różnice w bezwzględnych wartościach indeksu komórkowego między studzienkami.
      1. Przedstaw dane jako wykresy znormalizowanego indeksu komórki (oś y) w funkcji czasu (oś x).
  2. Dane z obrazowania żywych komórek (badania deadhezji komórek w eksperymencie 2: sekcja 3)
    1. Otwarte filmy obrazowania żywych komórek DIC nagrane bezpośrednio przed i po rozpoczęciu utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO w standardowym programie do analizy obrazu (np. oprogramowaniu ImageJ).
    2. W co najmniej dwóch oddzielnych filmach DIC losowo wybierz wiele komórek i zmierz ich wyświetlany obszar w sekwencyjnych klatkach (np. w odstępach 1-minutowych), ręcznie śledząc ich krawędź membrany i określając ilościowo liczbę zawartych pikseli.
    3. Eksportuj surowe dane (przewidywany obszar komórki w funkcji czasu) do arkusza kalkulacyjnego Excel i znormalizuj dane dotyczące obszaru komórki, ustawiając wartości zarejestrowane bezpośrednio przed rozpoczęciem utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO na wartość 1 (tj. bezpośrednio przed dodaniemH2O2 w 3.11.2.3).
    4. Przedstaw dane jako wykres znormalizowanego obszaru komórki (oś y) w funkcji czasu (oś x).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym deadhezji komórek śródbłonka od fibronektyny w odpowiedzi na utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO (Eksperyment 2). Wysiewanie zawiesin komórek śródbłonka na natywną (wolną od MPO) fibronektynę lub fibronektynę zawierającą MPO powoduje maksymalne przyczepienie i rozprzestrzenianie się komórek w ciągu 2 godzin, co ocenia się na podstawie plateau wartości indeksu komórkowego w pomiarach impedancji substratu komórkowego (ryc. 3A). Ta początkowa faz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesy adhezji i deadhezji matryc komórkowych mogą być dokładnie określane ilościowo w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu impedancji komórka-substrat i analiz obrazowania żywych komórek. Te podejścia w czasie rzeczywistym zapewniają dużą przewagę nad analizami adhezji komórek w punktach końcowych, które zapewniają słabą rozdzielczość czasową. Dzięki dokładnemu ilościowemu określeniu szybkich reakcji na deadhezję z wysoką rozdzielczością czasową, analizy te mogą dostarczyć krytycznych inform...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) oraz, częściowo, przez UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa matryca mikroelektrod impedancji gold-substrateACEA Biosciences / RocheE-Plate 96jednorazowa płytka służąca do wykonywania testów komórkowych w systemie xCELLigence
blebbistatynaSigmaB0560selektywny inhibitor komórek śródbłonka bydlęcej aorty bez miozyny mięśniowej-II
, kriokonserwowany LonzaBW-6001
Albumina surowicy bydlęcejSigma05470
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162pożywek do wzrostu komórek śródbłonka
Fibronektyna, liofilizowany proszekSigmaF-4759z osocza bydlęcego
Fluorodish 35 mm naczynie do hodowli komórek ze szklanym dnemWorld Precision InstrumentsFD35-100Naczynie do hodowli komórek z dnem ze szkła o jakości optycznej do obrazowania
Żelatyna ze skóry bydlęcejPodłoże do hodowli komórkowychSigmaG9391
Zbilansowany roztwór soli HankaTechnologie życia14025076
Nadtlenek wodoruMerck107298
Medium-199Life Technologies11150-059pożywka komórkowa bez surowicy
MetioninaSigmaM9500gasi utleniacze chlorujące wytwarzane przez mieloperoksydazę mieloperoksydazę
, ludzkie wielojądrzaste leukocytyMilipore475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence system impedancji substratu komórkowegoACEA Biosciences / RocheSkłada się z analizatora RTCA, stacji MP RTCA (Multiple Plate) i jednostki sterującej RTCA
Trypsin-EDTA (0,5%)GibcoNumer katalogowy: 15400-054 
zestaw

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  3. Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
  4. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
  5. Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
  6. Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
  7. Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
  8. Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
  9. Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
  10. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
  11. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
  12. Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
  13. Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
  14. Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
  15. Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
  16. Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki r db onkamieloperoksydazapowlekanie fibronektynobrazowanie time lapsekontrast interferencyjny r nicowypomiary indeksu kom rkowego

Powiązane artykuły