Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52431

⸱

5 lutego 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

W tym artykule

Podsumowanie

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Streszczenie

Informujemy tutaj, że ekspresja kompleksów białkowych in vivo w Escherichia coli może być wygodniejsza niż tradycyjne eksperymenty rekonstytucji in vitro. W szczególności pokazujemy, że słaba rozpuszczalność podjednostki ε polimerazy DNA Escherichia coli III (o aktywności egzonukleazy 3'-5') ulega znacznej poprawie, gdy to samo białko ulega koekspresji z podjednostkami α i θ (odpowiednio charakteryzującymi aktywność polimerazy DNA i ε stabilizujących). Pokazujemy również, że koekspresja białek w E. coli może być wykorzystana do skutecznego testowania zdolności podjednostek różnych gatunków bakterii do asocjacji w funkcjonalnym kompleksie białkowym. Rzeczywiście pokazujemy, że α podjednostka polimerazy DNA III Deinococcus radiodurans może ulegać koekspresji in vivo z ε podjednostką E. coli. Ponadto informujemy o zastosowaniu koekspresji białek do modulowania częstości mutacji u E. coli. Poprzez ekspresję podjednostki ε typu dzikiego pod kontrolą promotora araBAD (indukowanego arabinozą) i koekspresji mutagennego wariantu D12A tego samego białka, pod kontrolą promotora lac (indukowanego przez izopropylo-tio-β-D-galaktopyranozyd, IPTG), byliśmy w stanie zmienić częstość mutacji E. coli przy użyciu odpowiednich stężeń induktorów arabinozy i IPTG. Na koniec omawiamy najnowsze postępy i przyszłe wyzwania związane z koekspresją białek w E. coli.

Wprowadzenie

Wprowadzenie technologii nadekspresji przyczyniło się zarówno do rozwoju badań biochemicznych enzymów o niskiej liczbie kopii, jak i do przemysłowej produkcji aktywnych farmakologicznie białek (np. insuliny). Od czasu pojawienia się tych technologii osiągnięto znaczne postępy w celu zwiększenia wydajności i jakości rekombinowanych białek. Ponadto na przestrzeni lat opracowano prokariotyczne systemy nadekspresji1,2 i eukariotyczne3, oferując użyteczne alternatywy dla "konia roboczego" biotechnologii białek, tj. Escherichia coli. W szczególności dostępność alternatywnych platform dla E. coli doprowadziła do produkcji rekombinowanych peptydów lub białek noszących modyfikacje potranslacyjne. Należy jednak wspomnieć, że E. coli nadal stanowi organizm z wyboru do produkcji białek rekombinowanych. Wynika to z kilku czynników, wśród których można uznać najistotniejsze z nich: (i) dostępność wielu systemów nadekspresji (wektorów ekspresyjnych i szczepów) dla E. coli1,2; (ii) krótki czas wytwarzania i wysokie plony biomasy E. coli w różnych pożywkach bogatych i syntetycznych; iii) łatwą manipulację na poziomie biochemicznym i genetycznym tego mikroorganizmu; (iv) izolacja szczepów zdolnych do produkcji toksycznych białek4; v) budowa szczepów charakteryzujących się jednorodną indukcją na poziomie populacji5,6. Ponadto niedawno wykazano, że można opracować i skonstruować systemy ekspresji odpowiednie do produkcji w E. coli białek modyfikowanych potranslacyjnie2.

Obecnie nadekspresja białek jest głównie wykorzystywana do uzyskiwania białek monomerycznych lub homooligomerycznych, których hipersynteza może być przeprowadzona za pomocą pojedynczego genu sklonowanego do odpowiedniego plazmidu. Ostatnio jednak zwrócono uwagę na budowę systemów koekspresji białek E. coli, co stanowi wyzwanie dla produkcji in vivo kompleksów heterooligomerycznych2. Co ciekawe, wczesne eksperymenty z koekspresją białek dotyczyły międzygatunkowego składania dużych i małych podjednostek karboksylazy/oksygenazy 7,8 ryjanobakteryjnej rybulozy-1,5-bisfosforanu7,8 oraz związku skróconych i pełnowymiarowych form odwrotnej transkryptazy HIV-19. Te pionierskie badania wykazały, że koekspresja białek stanowi potężną alternatywę dla tradycyjnej rekonstytucji in vitro. Ponadto koekspresję białek w E. coli wykorzystano do produkcji różnych białek zawierających modyfikacje potranslacyjne2, do uzyskania białek zawierających nienaturalne aminokwasy2 oraz do zwiększenia wydajności nadekspresji białek błonowych2. Co więcej, potencjał koekspresji białek jako narzędzia do nadawania E. coli kompetencji w zakresie wydzielania białka jest aktywnie badany2.

Dwie główne strategie koekspresji białek u E. coli mogą być realizowane: i) użycie pojedynczego plazmidu do hostowania różnych genów, które mają być nadmiernie eksprymowane; ii) zastosowanie wielu plazmidów w pojedynczych komórkach do koekspresji docelowych białek. W pierwszym przypadku kryteria wyboru plazmidu nie różnią się od tych z tradycyjnych eksperymentów z nadekspresją pojedynczego białka, chociaż poszczególne plazmidy zawierające tandemowe elementy promotora/operatora zostały skonstruowane dla koekspresji10. To pierwsze podejście jest więc dość proste. Należy jednak wspomnieć, że zastosowanie pojedynczego plazmidu do koekspresji różnych białek napotyka na dwie zasadnicze trudności: i) masa cząsteczkowa wektora wzrasta wraz z liczbą hostowanych genów, co ogranicza liczbę białek o koekspresji; ii) Gdy wiele genów jest klonowanych pod kontrolą jednego promotora, polaryzacja może zmniejszyć ekspresję genów dystalnie od promotora. Zastosowanie podwójnych lub wielokrotnych plazmidów w pojedynczych komórkach E. coli musi zapewnić zgodność wybranych wektorów, nakładając tym samym ograniczenia na kwalifikujące się kombinacje plazmidów. Jednak ta druga strategia koekspresji ma tę zaletę, że zawiera masę cząsteczkową wektorów i ogranicza polarność. Niedawno skonstruowaliśmy system koekspresji białek zaprojektowany w celu ułatwienia przenoszenia genów między plazmidami o koekspresji11. W szczególności skonstruowaliśmy serię wektorów pGOOD, których istotnymi cechami są: i) pochodzenie replikacji p15A, aby zapewnić kompatybilność plazmidów pGOOD z komercyjnymi wektorami zawierającymi pochodzenie ColE1 (np. seria pBAD12); ii) kaseta odporna na tetracykliny; iii) obecność elementów regulatorowych pochodzących z lac, tj. pary Promotor-Operator(O1) i genu lacIq. Stosując odpowiednią parę pBAD-pGOOD, byliśmy w stanie uzyskać nadekspresję katalitycznego rdzenia polimerazy DNA III E. coli, składającego się z trzech różnych podjednostek, tj. α (polimeraza 5'-3'), ε (egzonukleaza 3'-5') i θ (ε stabilizująca)13. W szczególności wykazaliśmy, że koekspresja kompleksu αεθ była ściśle zależna od dodania do pożywki hodowlanej E. coli zarówno IPTG, jak i arabinozy, wywołując nadekspresję odpowiednio od pGOOD i pBAD (Figura 1A).

W niniejszym raporcie pokazujemy, jak koekspresja białek może skutecznie rozwiązać problemy związane ze słabą rozpuszczalnością podjednostki kompleksu białkowego. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić testy komplementacji białek in vivo, a na koniec informujemy o zastosowaniu koekspresji białek do dostrojenia częstości mutacji u E. coli. W tym celu wykorzystaliśmy pary pGOOD-pBAD, które są odpowiednie do zilustrowania odpowiednich przykładów każdego studium przypadku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja kotransformantów E. coli

  1. Przygotować elektrokompetentne komórki odpowiedniego szczepu E. coli do transformacji. Przenieść do 1 ml pożywki LB (trypton, ekstrakt drożdżowy, NaCl odpowiednio w stężeniu 10, 5 i 10 g/l) pojedynczej kolonii wybranego szczepu i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach wytrząsania 180 obr./min. Rozcieńczyć kulturę wstępną w stosunku 1:500 w 25 ml świeżej pożywki LB i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C.
  2. W fazie logarytmicznej (0,6 s.d.) odwirować zawiesinę komórek przy 5 000 x g przez 20 min) i ponownie zawiesić osad w 10%, v/v lodowato zimnej sterylnej glicerolu-wodzie w połowie pierwotnej objętości hodowli. Powtórzyć ten krok 4 razy, za każdym razem zmniejszając o połowę objętość do ponownego zaparcia. Na koniec zawiesić osad w glicerolu/wodzie i podzielić zawiesinę komórek na 50 μl podwielokrotności. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
  3. Rozpuść żądany plazmid w sterylnej wodzie uzupełnionej 0,5 mM EDTA. Rozmrozić na lodzie podwielokrotność elektrokompetentnych ogniw i wymieszać z odpowiednią ilością (2,5-5 ng) wektora. Dozować mieszaninę do kuwety o średnicy 0,1 cm nadającej się do elektroporacji i zastosować napięcie 1,8 kV.
  4. Natychmiast przenieść elektroporowane komórki do 1 ml pożywki SOC (pożywka LB uzupełniona 0,2% w/v glukozy, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCl), inkubować przez 1 godzinę pod wstrząsem, a na koniec przenieść 100 μl podwielokrotności na szalki Petriego zawierające agar LB z odpowiednim antybiotykiem. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  5. Oczyść transformanty, rozrzucając pojedyncze kolonie na szalkach Petriego.
  6. Przygotować elektrokompetentne ogniwa transformatorów pierwotnych i powtórzyć kroki od 1.1 do 1.5, aby przekształcić się w kolejne plazmidy.
  7. Przygotować zapasy glicerolu kotransformantów. Przenieść pojedynczą kolonię w LB uzupełnioną odpowiednimi antybiotykami, inkubować w temperaturze 37 °C pod wstrząsaniem i w fazie logarytmicznej (0,6 s.d.) odwirować zawiesinę komórek przy 5 000 x g przez 20 min. Zawiesić osad w pożywce LB-antybiotykowej zawierającej 15% v/v glicerolu. Dozować w porcjach i przechowywać w temperaturze – 80 °C.

2. Współekspresja podjednostek α i ε polimerazy DNA E. coli III

  1. Przenieść za pomocą sterylnej pętli niewielką ilość odpowiedniego szczepu glicerolu (np. TOP10/pGOOD-ε243 i TOP10/pGOOD-ε243-θ/pBADα1160, patrz rysunek 1) na szalkę Petriego zawierającą pożywkę LB i antybiotyki. Pozostaw zawiesinę komórek do wyschnięcia na szalce Petriego i rozprowadź kropelki komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C O/N.
  2. Przenieś, za pomocą sterylnej wykałaczki, pojedynczą kolonię do 1 ml pożywki LB-antybiotykowej. Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć kulturę wstępną w stosunku 1:500 w świeżej pożywce i inkubować w temperaturze 30 °C przez 15 godzin.
  3. Dodaj IPTG, arabinozę lub arabinozę i IPTG, po 1 mM każdy. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2,5 godziny. Zebrać komórki i przechowywać granulki w temperaturze -20 °C.
  4. Rozmrozić granulki na lodzie i ponownie zawiesić w buforze do lizy (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM ditiotreitol, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), pH 8). Delikatnie homogenizować zawiesinę komórek za pomocą zimnego szklanego garnka.
  5. Sonikuj przy 15 W przez 15 sekund, a następnie 15-sekundowy interwał chłodzenia (4 cykle).
  6. Odwirować całkowite ekstrakty białkowe w temperaturze 10 000 x g przez 20 minut, w temperaturze 4 °C, aby odzyskać frakcję rozpuszczalną.
  7. Analizować za pomocą SDS-PAGE (12,5% akrylamidu) podwielokrotności każdego rozpuszczalnego ekstraktu białkowego. W tym celu przenieść 20 μl każdego rozpuszczalnego ekstraktu białkowego do probówek Eppendorfa zawierających 60 μlH2Oi 20 μl buforu ładującego (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-merkaptoetanolu, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) glicerolu, 0,25% (w/v) błękitu bromofenolowego) i gotować przez 5 min. Załadować 18 μl każdej próbki i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 140 V przez około 1,5 godziny.

3. Współekspresja α Podjednostki Deinococcus radiodurans DNA Polimerazy III i ε Podjednostki E. coli DNA Polimerazy III

  1. Przygotować wstępną hodowlę szczepu E. coli TOP10/pBAD-αDr/pGOOD-ε243 w 1 ml pożywki LB-ampicyliny-tetracykliny i inkubować przez 8 godzin w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 000 w świeżej pożywce i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  2. Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w 200 ml świeżej pożywki, inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, następnie indukować przez 3 godziny z arabinozą i IPTG, po 1 mM każdy. Zebrać komórki i przechowywać granulki w temperaturze -20 °C.
  3. Ponownie zawiesić osad w 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogenizować i rozbijać komórki zgodnie z opisem w ppkt 2.4 i 2.5.
  4. Natychmiast odwirować lizat komórek przy 10 000 x g przez 20 minut. Wyrzucić osad. Przefiltrować supernatant za pomocą lejka Büchnera wyposażonego w 3 warstwy filtra bibułowego. Zastosuj delikatną próżnię. Aby uniknąć nadmiernego pienienia, podczas filtracji należy trzymać termos Erlenmeyera na lodzie.
  5. Określ stężenie białka zgodnie z Bradford14.

4. Chromatografia z filtracją żelową

  1. Zrównoważyć żelową kolumnę filtracyjną z płaszczem wodnym 16x70 (200) z 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Załadować do kolumny rozpuszczalny ekstrakt białkowy. Aby uzyskać optymalną rozdzielczość, użyj pętli na próbkę o pojemności 1 ml. Przeprowadzić chromatografię z prędkością 0,6 ml/min. Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 4 °C przez cały czas.
  2. Zbierz frakcje o wielkości 0,9 ml i przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE. Przenieść 20 μl każdej odpowiedniej frakcji do probówek Eppendorfa zawierających 60 μlH2Oi 20 μl buforu ładującego (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-merkaptoetanolu, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) glicerolu, 0,25% (w/v) błękitu bromofenolowego) i gotować przez 5 min. Załadować 18 μl każdej próbki i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 140 V przez około 1,5 godziny.
  3. Określ egzonukleazę 3'-5' i aktywność polimerazy DNA każdej frakcji w 96-dołkowych mikropłytkach. Oznaczyć aktywność egzonukleazy przy użyciu estru 5'-monofosforanu p-nitrofenylu tymidyny (pNP-TMP) jako substratu15. Oszacuj aktywność polimerazy DNA przy użyciu testu sprzężonego z enzymem PPX (pirofosfataza, fosforylaza nukleozydów purynowych, oksydaza ksantynowa)16 i chlorku 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylo-2H-tetrazolowego (INT) jako akceptora elektronów16.

5. Analiza mutacji populacji wykazujących współekspresję podjednostki ε typu dzikiego polimerazy DNA E. coli III i mutagennego wariantu εD12A

  1. Przenieść pojedynczą kolonię E. coli TOP10 zawierającą wektory pBAD-ε i pGOOD1-εD12A11 do 1 ml pożywki LB-antybiotykowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  2. Rozcieńczyć kulturę wstępną w stosunku 1:250 w 3 kolbach zawierających świeżą pożywkę (10 ml), dodać odpowiednie induktory (arabinozę, IPTG lub arabinozę i IPTG, po 1 mM każdy) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin. Przygotować równolegle kultury nieindukowane.
  3. Zebrać porcje o objętości 1 ml, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:500 w nowych kolbach zawierających świeżą pożywkę (10 ml) uzupełnioną lub nie odpowiednimi induktorami. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  4. Powtórzyć kroki 5.2 i 5.3 i zebrać podwielokrotności po 1 ml.
  5. Określ liczbę pokoleń, które wystąpiły w każdej kulturze. Przenieść na płytki LB 100 μl odpowiednich seryjnych rozcieńczeń inokulum i kultury. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C. Policz kolonie na płytkach LB i oblicz logarytm liczby komórek obecnych w inokulum (logI) i w kulturze pod koniec wzrostu (logC). Aby określić liczbę pokoleń, użyj wzoru: (logC– logI)/0,301.
  6. Odwirować przy 5 000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Aby przepuszczalność komórek, dodaj 2-3 krople chloroformu i wiruj przez 20 sekund.
  7. Oznaczyć aktywność β-glukozydazy każdej podwielokrotności w 96-dołkowej mikropłytce, używając p-nitrofenylo-β-D-glukopiranozydu (PNPGluc) jako substratu. Dodać do każdej studzienki 100 μl przepuszczalnych komórek i 100 μl substratu (16 mg/ml roztworu podstawowego wH2O). Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza w studzienkach. Odczytać absorbancję przy 420 nm, używając czytnika mikropłytek i odpowiedniego filtra.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podjednostka ε polimerazy DNA III E. coli składa się z 243 aminokwasów i charakteryzuje się niską rozpuszczalnością17,18, chyba że usunięte zostaną reszty 187-24317. Wykazaliśmy jednak wcześniej11, że koekspresja pełnowymiarowych podjednostek α, ε i θ prowadzi do otrzymania rozpuszczalnego rdzenia katalitycznego polimerazy DNA III (Rycina 1). W szczególności, wykorzystując system koekspresji pBAD-pGOOD, wykazaliśmy, że: i) nadekspresja podjednostek α i ε może być...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Białka mogą być wewnętrznie nieuporządkowane, z regionami, których struktura trzeciorzędowa nie jest ograniczona do ograniczonej liczby konformacji25. Te nieuporządkowane białka są zwykle podatne na agregację25, a ich izolacja i charakterystyka może stanowić trudne zadanie. Podjednostka ε polimerazy III DNA E. coli składa się z dwóch odrębnych domen26,27, a mianowicie: i) domeny N-ter, charakteryzującej się aktywnością egzonukleazy 3'-5' i kompetentnej do wiązania podjednostki θ;...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Bardzo dziękujemy za zgodę Springera i Elsevier na przedruk rycin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarSigma-AldrichA1296
AmpicylinaSigma-AldrichA9518
ChloroformSigma-Aldrich288306
EDTASigma-AldrichEDS
GlicerolSigma-AldrichG5516
INTSigma-AldrichI8377
IPTGSigma-AldrichI5502
KClSigma-AldrichP9541
L-ArabinozaSigma-AldrichA3256
MgCl2Sigma-AldrichM2670
NaClSigma-Aldrich31434
PMSFSigma-AldrichP7626
PNP-glucSigma-AldrichN7006
pNP-TMPSigma-AldrichT0251
TetracyklinaSigma-Aldrich87128
Podstawa Trizma Sigma-AldrichT1503
TryptonSigma-Aldrich95039
Ekstrakt drożdżowyFluka70161
Roztwór akrylamidu 30%BioRad161-0158Do elektroforezy żelowej
Roztwór amonuBioRad161-0700Do elektroforezy żelowej
GlicynaBioRad161-0718Do żelu elektroforeza
SDSBioRad161-0302Do elektroforezy żelowej
TEMEDBioRad161-0800Do elektroforezy żelowej
TrisBioRad161-0719Do elektroforezy
żelowej Kuwety 0,1 cmBioRad1652089Do elektroporacji
Wirówka 5415REppendorf
Wirówka Allegra 21RBeckman
Aparatura chromatograficzna GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II elektroporacjaBioRad
Czytnik mikropłytek 550Biorad
MiniProtean 3 ogniwaBioRad
ZasilaczBioRad
Sonicator 3000Misonix

Bibliografia

  1. Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
  2. Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
  3. Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
  4. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  5. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
  6. Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
  7. Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
  8. Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
  9. Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
  10. Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43(2007).
  11. Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
  12. Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  13. McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
  16. Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
  17. DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
  18. Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
  19. Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
  20. Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
  21. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  22. Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
  23. Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
  24. Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
  25. Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
  26. Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
  27. Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
  28. Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
  29. Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
  30. Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
  31. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  32. Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Składanie kompleksów białkowychfiltracja żelowaSDS-PAGEtesty enzymatycznetransformacja plazmidowastężenie induktoraanaliza częstotliwości mutacjitesty kompatybilności podjednostek
Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.