Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52432

⸱

19 grudnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisany jest protokół infekcji makrofagów Cryptococcus neoformans. Wyjaśniono również metodę usuwania steroli z makrofagów. Protokoły te stanowią przewodnik do badania zakażeń grzybiczych in vitro i badania roli steroli w takich infekcjach.

Streszczenie

Kryptokokoza to zagrażająca życiu infekcja wywoływana przez chorobotwórcze grzyby z rodzaju Cryptococcus. Do zakażenia dochodzi po wdychaniu zarodników, które są zdolne do replikacji w głębokim płucu. Fagocytoza Cryptococcus przez makrofagi jest jednym ze sposobów, w jaki choroba jest w stanie rozprzestrzenić się do ośrodkowego układu nerwowego, powodując śmiertelne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Dlatego badanie związku między Cryptococcus a makrofagami jest ważne dla zrozumienia postępu infekcji. W niniejszym badaniu opisano krok po kroku protokół badania zakaźności makrofagów przez C. neoformansin vitro. Za pomocą tego protokołu badana jest rola steroli gospodarza w interakcjach gospodarz-patogen. Różne stężenia metylo-cyklodekstryny (MCD) stosowano do zubożenia cholesterolu z linii komórkowej podobnej do makrofagów mięsaka retikulum mysiego J774A.1. Niedobór cholesterolu został potwierdzony i określony ilościowo przy użyciu zarówno dostępnego na rynku zestawu do oznaczania ilościowego cholesterolu, jak i chromatografii cienkowarstwowej. Komórki zubożone w cholesterol aktywowano za pomocą lipopolisacharydu (LPS) i interferonu gamma (IFNγ) i zakażono opsonizowanymi przeciwciałami komórkami H99 typu dzikiego Cryptococcus neoformans w stosunku efektorowym do celu wynoszącym 1:1. Zakażone komórki monitorowano po 2 godzinach inkubacji z C. neoformans i obliczono ich indeks fagocytarny. Niedobór cholesterolu spowodował znaczne obniżenie indeksu fagocytarnego. Przedstawione protokoły oferują wygodną metodę naśladowania inicjacji procesu infekcji w środowisku laboratoryjnym oraz badania roli składu lipidowego gospodarza na zakaźność.

Wprowadzenie

Fagocytoza to proces, w którym jednostki zewnątrzkomórkowe są internalizowane przez komórki gospodarza. Jest to kluczowa broń w arsenale układu odpornościowego do obrony przed patogenami, ale proces ten może często zostać zakłócony przez patogeny, aby umożliwić internalizację i rozprzestrzenianie się w organizmie1. Fagocytoza jest pośredniczona przez kilka zdarzeń sygnalizacyjnych, które powodują przyłączanie i pochłanianie poprzez rearanżacje cytoszkieletu komórki gospodarza. "Profesjonalne" fagocyty są w stanie rozpoznać i związać się z opsoninami na powierzchni atakującego patogenu, aby zasygnalizować przyczepienie i utworzenie lamellipodiów, które pochłaniają patogen i tworzą fagosom2. Wśród tak zwanych "profesjonalnych" fagocytów znajdują się makrofagi. Makrofagi to wysoce wyspecjalizowane komórki, które pełnią funkcje ochronne, które obejmują wyszukiwanie i eliminowanie czynników chorobotwórczych, naprawę uszkodzonych tkanek i pośredniczenie w stanie zapalnym, większość z nich w procesie fagocytozy1,2.

Cryptococcus neoformans to gatunek chorobotwórczych drożdży, który powoduje poważną chorobę znaną jako Cryptococosis. Zarodniki Cryptococcus są wdychane przez gospodarza i powodują infekcję płuc, która zwykle przebiega bezobjawowo. Uważa się, że narażenie jest niezwykle powszechne; Próba 61 dzieci z Pediatrycznej Kliniki Chorób Zakaźnych w Bronx-Lebanon Hospital Center wykazała, że wszystkie badane osoby miały przeciwciała przeciwko kryptokokowemu polisacharydowi glukuronoksylomannanu, a inne badania wykazały rozpowszechnienie zarówno u niezakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV), jak i u zakażonych dorosłych3,4. Makrofagi pęcherzykowe są pierwszą linią odpowiedzi na infekcję płuc i w większości przypadków skutecznie usuwają patogen. Jednak u osób z obniżoną odpornością (np. pacjentów z HIV i AIDS) drożdże są w stanie przetrwać w makrofagach. W takich przypadkach makrofagi mogą służyć jako nisza do replikacji patogenu i mogą ułatwiać jego rozprzestrzenianie się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), gdzie choroba staje się śmiertelna 5-8. Uważa się, że makrofagi mogą nawet dostarczać drożdże bezpośrednio do opon mózgowych, pomagając drożdżom przekroczyć barierę krew-mózg za pośrednictwem modelu "konia trojańskiego"3,9-11. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć proces fagocytozy i czynniki, które na nią wpływają, zwłaszcza w infekcjach kryptokokowych.

Poprzednie prace nad innymi systemami patogenów wskazują na to, że cholesterol i tratwy lipidowe tworzone przez cholesterol odgrywają ważną rolę w fagocytozie12–15. Cholesterol jest najliczniejszym gatunkiem lipidów w komórkach ssaków i stanowi 25 - 50% błony komórkowej ssaków16. Stwierdzono, że odgrywa rolę w modulowaniu właściwości biofizycznych membran poprzez zmianę ich sztywności17. Cholesterol i sfingolipidy razem tworzą mikrodomeny lipidowe w błonie znane jako tratwy lipidowe. Stwierdzono, że tratwy lipidowe biorą udział w tworzeniu kaweoli, a także zapewniają izolowaną domenę dla niektórych typów sygnalizacji16-18. Ze względu na ich niewielkie rozmiary trudno jest badać tratwy lipidowe in vivo. Jednym z użytecznych sposobów badania roli tratw lipidowych jest zmiana ich składników. Metylo-β-cyklodekstryna (MβCD) jest związkiem, który, jak stwierdzono, zubaża błony ssaków na poziom cholesterolu i jest powszechnie stosowany do badania roli tratw lipidowych18.

W tym protokole prezentujemy metodę usuwania cholesterolu z błon komórkowych gospodarza i ilościowego określania wpływu wyczerpania na zdolność komórek gospodarza do fagocytozy C. neoformans in vitro. Procedura ta wykorzystuje techniki hodowli komórkowej na unieśmiertelnionej linii komórkowej podobnej do makrofagów (J774A.1) jako modelu infekcji. Zubożenie cholesterolu zostało osiągnięte przez ekspozycję na MβCD, który ma hydrofobowy rdzeń specyficzny dla wielkości steroli i jest w stanie działać jako zlew dla cholesterolu, aby wyciągnąć go z błony19. Niedobór cholesterolu mierzono ilościowo za pomocą dostępnego na rynku zestawu i jakościowo za pomocą zmodyfikowanej ekstrakcji lipidów Bligh-Dyera, a następnie chromatografii cienkowarstwowej (TLC)20. Fagocytozę mierzono poprzez zakażenie linii komórkowej kulturą opsonizowanych drożdży zmieszanych z koktajlem γ interferonu i lipopolisacharydu w celu aktywacji makrofagów. Cryptococcus opsonizowano przy użyciu przeciwciała glukuronoksylomannanu (GXM)21–23. Eksperymenty barwienia i mikroskopii pozwoliły na wizualizację komórek i obliczenie indeksu fagocytarnego w celu oceny stopnia fagocytozy. Podsumowując, protokół ten opisuje podstawową metodę, która integruje zmianę składu lipidów z procesem fizjologicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Niedobór cholesterolu w komórkach J774A.1 z MβCD

  1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiew 105 komórek podobnych do makrofagów J774A.1 na studzienkę na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w 200 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P / S). Inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5 % CO2 O/N.
  2. Usuń pożywkę z monowarstwy komórek i umyj komórki dwukrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), która została przefiltrowana lub autoklawowana.
  3. Dodać 200 μl roztworu MβCD o pożądanym stężeniu (10 mM lub 30 mM w PBS) lub 1x PBS jako kontrolę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Natychmiast po zabiegu usunąć supernatant i odłożyć w RT do analizy ilościowej za pomocą dostępnego w handlu zestawu.
  4. Przemyć komórki dwa do trzech razy 1x PBS lub DMEM bez surowicy i kontynuować infekcję lub lizować komórki, pipetując dwa do trzech razy dejonizowanymH2Odo analizy za pomocą chromatografii cienkowarstwowej lub zestawu.
    UWAGA: Po wyczerpaniu poziomu cholesterolu można użyć dostępnego na rynku zestawu do oznaczania ilościowego cholesterolu. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji materiałów. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, jak napisano.

2. Obserwacja zawartości cholesterolu metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

  1. Umyć zbiornik TLC dwukrotnie acetonem i raz roztworem eteru naftowego: eteru dietylowego i kwasu octowego (65:30:1 objętościowo). Nasycić zbiornik roztworem eteru naftowego: eteru dietylowego: kwasu octowego (65:30:1 objętościowo) i pozostawić O/N.
    UWAGA: Rozpuszczalniki organiczne należy zawsze stosować pod wyciągiem, aby zapobiec wdychaniu pary. Przez cały czas należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Kwas octowy jest mocnym kwasem i należy go stosować ostrożnie.
  2. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiać 106 komórek podobnych do makrofagów J774A.1 na studzienkę na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w objętości 5 ml ciepłego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P / S. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 O / N.
  3. Zubożyć makrofagi cholesterolu, wykonując kroki 1.2 - 1.4, zastępując 1 ml 200 μl, jeśli ma to zastosowanie, aby uwzględnić większy rozmiar studzienki.
  4. Dodać 500 μl trypsyny-EDTA do każdego dołka, inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i delikatnie zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek.
  5. Przenieś do probówki do mikrofuge i dodaj dodatkowe 500 μl ciepłego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S.
  6. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g i usunąć supernatant.
  7. Dodaj dodatkowe 500 μl ciepłego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S do osadu komórkowego i ostrożnie ponownie zawiesij, pipetując w górę iw dół.
  8. Usuń 10 μl komórek i policz komórki na hemocytometrze. Znormalizować stężenia komórek w każdej próbce i dodać równą liczbę komórek do szklanych probówek.
    UWAGA: Na tym etapie można zdecydować się na połączenie komórek z tych samych grup terapeutycznych, aby uzyskać bardziej skoncentrowany końcowy ekstrakt lipidowy.
  9. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pożywkę.
  10. Dodać 2 ml metanolu i odwirować. Następnie dodaj 1 ml chloroformu i odwiruj. Sprawdź stan fazy, aby upewnić się, że roztwór jest w monophasic.
    UWAGA: Probówki można przechowywać w temperaturze 4 °C O/N.
  11. Wirować przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do nowej probówki
  12. Dodać dodatkowo 1 ml chloroformu, a następnie 1 mldH2O. Wirować dwukrotnie przez 30 sekund. Wirować przy 1 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Zważyć szklaną probówkę na czułej wadze i za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieść dolną fazę do szklanej probówki o znanej masie.
  14. Wysuszyć lipidy w parowniku odśrodkowym do wyschnięcia (około 2 godziny). Zważyć probówkę z wysuszonymi lipidami i obliczyć masę suchego lipidu.
    UWAGA: Suche lipidy można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do wykonania TLC.
  15. Rozcieńczyć wysuszone lipidy w wystarczającej ilości chloroformu, aby znormalizować stężenie lipidów (zwykle 20 - 50 μl) i załadować 20 μl rozcieńczonego lipidu na płytkę TLC z krzemionki. Standardowo załadować 20 μg cholesterolu rozcieńczonego w 20 μl chloroformu.
  16. Dodaj wysuszoną płytkę TLC do nasyconego zbiornika TLC i pozwól rozpuszczalnikowi migrować do 1 cm przed krawędzią płytki. Wyjmij płytkę TLC ze zbiornika i pozostaw do wyschnięcia na około 5 minut.
  17. Wizualizuj lipidy, umieszczając je w zbiorniku z parami jodu, aby sprawdzić migrację. Usuń plamy i pozwól im zniknąć przez około 10 - 15 minut pod maską.
    UWAGA: Jod stanowi zagrożenie wdychania. Zawsze używaj pod wyciągiem.
  18. Przygotować roztwór do barwienia obojętnymi lipidami, łącząc 60 ml metanolu z 60 ml dejonizowanegoH2O, 4 ml kwasu siarkowego i 630 mg chlorku manganu.
  19. Ostrożnie i powoli zanurz płytkę TLC w neutralnym roztworze do barwienia lipidów na tacy i usuń bez złuszczania warstwy krzemionki.
    UWAGA: Neutralny roztwór do barwienia lipidów może być wielokrotnie użyty, dzięki czemu można go wyjąć z tacki i umieścić z powrotem w butelce do późniejszego użycia.
  20. Pozostaw płytę do wyschnięcia pod maską przy temperaturze pokojowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Podgrzej płytkę TLC na bloku grzewczym ustawionym na 160 °C i zwęgl do żądanego koloru.
    UWAGA: Program do densytometrii, taki jak Vision Works LS, może być używany do ilościowego oznaczania zwęglonych prążków w celu porównania próbek lipidów.

3. Zakażenie makrofagów C. neoformans (H99)

  1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiewaj 105 komórek podobnych do makrofagów na basenie na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w 200 μl DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% P / S. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 5% CO2 O/N.
    UWAGA: Infekcję można również przeprowadzić w naczyniach konfokalnych ze szklanym dnem, co ułatwia obrazowanie; Wszystkie kwoty pozostają bez zmian.
  2. Wyhodować kulturę C. neoformans (H99) przez zaszczepienie 10 ml YNB jedną kolonią otrzymaną z uderzonej płytki i inkubację O/N w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
  3. Umyć i policzyć komórki C. neoformans (H99).
    1. Odwirować kulturę C. neoformans O/N w temperaturze 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Wyjmij nośnik i wyrzuć. Umyj komórki 5 ml 1x PBS. Wirować przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć PBS i przemyć 5 ml przefiltrowanego 1x PBS. Wirować przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze 2 razy.
    4. Usunąć PBS i ponownie zawiesić w 5 ml 1x PBS.
    5. Wykonać seryjne rozcieńczenie w PBS, aby uzyskać rozcieńczenie przemytej kultury w stosunku 1:500.
      1. Dodać 100 μl oryginalnej próbki do 900 μl 1x PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:10.
      2. Dodać 100 μl próbki rozcieńczonej w stosunku 1:10 do 900 μl 1x PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:100.
      3. Dodać 200 μl próbki rozcieńczonej w stosunku 1:100 do 800 μl 1x PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:500
    6. Weź 10 μl rozcieńczenia 1:500 i policz na hemocytometrze, aby obliczyć liczbę komórek.
  4. Przygotować roztwór roboczy do aktywacji makrofagów i opsonizacji C. neoformans.
    1. Rozcieńczyć LPS i IFNγ 100x z roztworów podstawowych, dodając 10 μl do 990 μl.
      UWAGA: LPS i IFNγ są stosowane w celu zwiększenia wychwytu fagocytarnego, ale nie są wymagane do fagocytozy. W przypadku zainteresowania działaniem grzybobójczym makrofagów należy przeprowadzić aktywację O/N w temperaturze 37 °C z wstrząsaniem przed zakażeniem.
    2. Na próbkę należy dodać 7,5 μl rozcieńczonego LPS, 1,25 μl rozcieńczonego IFNγ, 1,25 μl przeciwciała GXM i objętość kultury C. neoformans, która daje 1,25 x 105 komórek. Doprowadzić objętość do 250 μl pomnożoną przez liczbę próbek za pomocą DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S.
    3. Wirować i inkubować roztwór przez 20 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
      UWAGA: Obniżenie poziomu cholesterolu (kroki 1.2 - 1.4) może odbywać się równocześnie z etapem opsonizacji. Należy pamiętać o traktowaniu makrofagów przed połączeniem roztworu roboczego, ponieważ opsonizowane komórki powinny być optymalnie używane nie dłużej niż 20 minut po kroku 3.4.3 inkubacji.
  5. Infekuj makrofagi
    1. Umyj makrofagi dwukrotnie DMEM bez surowicy i dodaj 200 μl opsonizowanego roztworu roboczego C. neoformans do każdej studzienki.
    2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Napraw i wybarwiaj komórki
    1. Usuń pożywkę i umyj komórki 2 razy za pomocą DMEM.
    2. Wysuszyć monowarstwę komórek na powietrzu przez 10 minut i dodać 200 μl lodowatego metanolu, aby utrwalić komórki.
    3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pozostały metanol.
    4. Dodać 200 μl 10x Giemsa i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Umyć 2 - 3 razy wodą dejonizowaną i osuszyć O/N bez nakrętki.
      UWAGA: Obrazowanie można wykonać następnego dnia lub do tygodnia po barwieniu.
  7. Wizualizacja i liczenie
    1. Za pomocą mikroskopu policz 300 komórek na punkt danych (jeśli są 2 z tego samego zabiegu, policz 150 na studzienkę) i zanotuj liczbę zakażonych makrofagów i liczbę pochłoniętych komórek Cryptococcus.
      UWAGA: Aby zapewnić równomierne próbkowanie na punkt danych, użyj 2 płytek na warunek, wybierz 3 nienakładające się obszary na płytkę i policz 50 komórek na obszar.
    2. Oblicz indeks fagocytarny, mnożąc procent zakażonych makrofagów przez średnią liczbę C. neoformans na makrofaga. Normalizuj indeks fagocytarny, wyrażając wartości jako procent kontroli traktowanej 1x PBS. Po kilku próbach oblicz średnią wartość i odchylenie standardowe średniej, aby określić trendy indeksu fagocytarnego. Użyj testu t-Studenta, aby określić istotność.
    3. Zrób mikrofotografie komórek w powiększeniu 1,000x lub 400x.

4. Test błękitu trypanowego

  1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiewać 106 komórek podobnych do makrofagów na studzienkę na 6-dołkowej płytce do hodowli komórek w objętości 5 ml minimalnej pożywki egzogennej (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 O/N.
  2. Zubożyć makrofagi cholesterolu, wykonując kroki 1.2 - 1.4, zastępując 2 ml 200 μl, jeśli ma to zastosowanie, aby uwzględnić większy rozmiar studzienki.
    UWAGA: Pamiętaj, aby dołączyć kontrolę potraktowaną 1x PBS, a także kontrolę, która jest zeskrobywana przed jakimkolwiek zabiegiem.
  3. Dodaj 500 μl 1x PBS do każdej studzienki i delikatnie zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś do probówki do mikrofuge i zawieś komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.
  4. Usuń 10 μl komórek i zabarwij 1 μl 4% błękitu trypanowego.
  5. Policz komórki na hemocytometrze i oblicz żywotność, korzystając z następującego równania: % żywotności = [1 - (Niebieskie komórki / całkowita liczba komórek)] x 100. Normalizowanie wartości do kontrolki, która nie była traktowana. Po kilku próbach oblicz wartość średnią i odchylenie standardowe, aby określić trendy w żywotności. Użyj testu t-Studenta, aby określić istotność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Usuwanie cholesterolu

Analiza supernatantu zachowanego w kroku 1.3 protokołu, przeprowadzona zgodnie z instrukcjami producenta zestawu Amplex Red Cholesterol Assay, wykazuje podwyższone stężenie cholesterolu w próbce traktowanej MβCD w porównaniu z kontrolą w 1x PBS. W zależności od typu komórek i zastosowanego stężenia MβCD stopień usunięcia cholesterolu może być różny. W przypadku komórek J774 traktowanych 10 mM MβCD zaobserwowano usunięcie cholesterolu na poziomie około 50%. Stopień usunięcia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas pracy z tym protokołem ważne jest, aby uzyskać dokładną liczbę komórek podczas posiewu komórek ssaków i opsonizacji komórek C. neoformans . Minimalizuje to różnice między próbami i zapewnia dokładny stosunek celu do efektora 1:1 w całym badaniu. Bardzo ważne jest również skoordynowanie czasu wyczerpania cholesterolu i infekcji, aby zapobiec spoczynkowi opsonizowanych komórek drożdży lub leczonych komórek makrofagów w RT między zabiegami. Długie okresy oczekiwania mogą prowadzić do utraty opsonizacji prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH AI56168, AI71142, AI87541 i AI100631 MDP. Maurizio Del Poeta jest badaczem chorób zakaźnych Burroughs Wellcome.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A2Labconco3460009
linia komórkowa J774A.1ATCCTIB-67przybywa zamrożona. Zapoznaj się z instrukcjami ATCC dotyczącymi hodowli.
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle MediumGibco11995-065Przechowywać pod adresem 4 & deg; C i ciepły do 37 & deg; C przed użyciem
HI Płodowa surowica bydlęca Performance PlusGibco10082-147Przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 stopni; C i rozmrozić przed dodaniem do DMEM
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)Gibco15140-122Używany do suplementacji Inkubator do
hodowli komórkowychIsotemp Fisher ScientificModel # 3530
96-dołkowe naczynie hodowlaneCorning Inc. Costar3595
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanemFisher Scientific BioReagentsBP3994Rozcieńczyć do 1x i przefiltrować lub autoklawować przed użyciem.
Metylo-β-cyklodekstrynaSigma Life ScienceC4555-10GRozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać roztwory o stężeniach 10 mM i 30 mM
Wytrząsarka orbitalnaLabline
Amplex Red Cholesterol Assay KitTechnologies Sondy molekularneA12216Wszystkie odczynniki do oznaczania cholesterolu znajdują się w zestawie. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
96-dołkowa płytka testowaCorning Inc. Costar3603
Czytnik mikropłytek FilterMaxmolekularneModel F5
Komora TLCSigma-AldrichZ126195-1EA
ChloroformSigma-Aldrich650498-4L
MetanolSigma-Aldrich34860-2L-R
TLC PapierWhatman3030917Przyciąć do rozmiaru potrzebnego do zbiornika TLC
OkapDowolny wyciąg zgodny z normami AIHA/ANSI
Płytka 6-dołkowaCorning Inc. Costar3506
Trypsin-EDTAGibco25300-054
Skrobak do komórekCorning Inc. Costar3010
HemocytometrHausser Scientific1490
WirówkaBeckman CoulterModel Alegra x-30R
Mieszalnik VotexFisher Scientific12-812
BalanceMettler ToledoModel # MS104S mierzy do 0,1 mg
Szklana pipeta PasteuraFisherbrand13-678-20A
CholesterolAvanti Polar Lipids700000
Koncentrator SpeedVacThermo ScientificModel # SPD2010
Eter naftowyFisher ScientificE139-1
Eter dietylowySigma-Aldrich309966
Kwas octowySigma-Aldrich320099
TLC Żel krzemionkowy 60 ze strefą koncentracjiChromatograhy analitycznej Millipore1.11845.0001
Chipsy jodoweSigma-Aldrich376558-50G
Kwas siarkowySigma-Aldrich320501
Chlorek manganuSigma-Aldrich244589
UVP EC3 Imaging SystemUltra-Violet Products Ltd.Użyj oprogramowania Vision Works LS do analizy densytometrycznej
Szklana dzież konfokalnaMatTekP35G-1.5-10Cwww.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)Uzyskany z Duke University Medical Center
YNBBD239210Instrukcja przygotowania znajduje się u producenta. Użyj stężenia glukozy 20 g/l.
LipopolisacharydSigmaL4391-1MGRozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać 1 mg / ml bulionu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Interferon gammaSigmaI4777Rozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać 0,1 mg/ml roztworu podstawowego
Przeciwciało glukuronoksylomannanu (anty-GXM)Prezent od Arturo Casadevall's Lab stężenie wynosi 1,98 mg/ml
GiemsaMP Biomedicals194591Rozpuść 0,8 g Giemsy w 25 ml glicerolu i podgrzej do 60 & stopni; C przez 1 godzinę. Dodać 25 ml metanolu do roztworu i pozostawić do leżakowania w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 miesiąc.
MikroskopMikroskop ZeissObserver.D1 z AxioCam MRm do robienia zdjęć
DMEM Life Urządzenia wyciągowy

Bibliografia

  1. Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
  2. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
  3. Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173(2012).
  4. Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
  5. Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
  6. Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
  7. Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
  8. Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
  9. Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
  10. García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
  11. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
  12. Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
  13. Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
  14. Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
  15. Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
  16. Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
  17. Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
  18. Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
  19. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
  20. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  21. Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
  22. Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
  23. Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).
  24. Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fagocytoza Cryptococcus neoformansmetylo-beta-cyklodekstrynazestaw do oznaczania poziomu cholesterolucienkowarstwowa chromatografiaaktywacja LPS IFN gammaopsonizacja przeciwciałamiobliczanie indeksu fagocytarnegofluorescencyjna mikroskopia świetlnaskład lipidowy gospodarza
Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.