W tym artykule opisany jest protokół infekcji makrofagów Cryptococcus neoformans. Wyjaśniono również metodę usuwania steroli z makrofagów. Protokoły te stanowią przewodnik do badania zakażeń grzybiczych in vitro i badania roli steroli w takich infekcjach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kryptokokoza to zagrażająca życiu infekcja wywoływana przez chorobotwórcze grzyby z rodzaju Cryptococcus. Do zakażenia dochodzi po wdychaniu zarodników, które są zdolne do replikacji w głębokim płucu. Fagocytoza Cryptococcus przez makrofagi jest jednym ze sposobów, w jaki choroba jest w stanie rozprzestrzenić się do ośrodkowego układu nerwowego, powodując śmiertelne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Dlatego badanie związku między Cryptococcus a makrofagami jest ważne dla zrozumienia postępu infekcji. W niniejszym badaniu opisano krok po kroku protokół badania zakaźności makrofagów przez C. neoformansin vitro. Za pomocą tego protokołu badana jest rola steroli gospodarza w interakcjach gospodarz-patogen. Różne stężenia metylo-cyklodekstryny (MCD) stosowano do zubożenia cholesterolu z linii komórkowej podobnej do makrofagów mięsaka retikulum mysiego J774A.1. Niedobór cholesterolu został potwierdzony i określony ilościowo przy użyciu zarówno dostępnego na rynku zestawu do oznaczania ilościowego cholesterolu, jak i chromatografii cienkowarstwowej. Komórki zubożone w cholesterol aktywowano za pomocą lipopolisacharydu (LPS) i interferonu gamma (IFNγ) i zakażono opsonizowanymi przeciwciałami komórkami H99 typu dzikiego Cryptococcus neoformans w stosunku efektorowym do celu wynoszącym 1:1. Zakażone komórki monitorowano po 2 godzinach inkubacji z C. neoformans i obliczono ich indeks fagocytarny. Niedobór cholesterolu spowodował znaczne obniżenie indeksu fagocytarnego. Przedstawione protokoły oferują wygodną metodę naśladowania inicjacji procesu infekcji w środowisku laboratoryjnym oraz badania roli składu lipidowego gospodarza na zakaźność.
Wprowadzenie
Fagocytoza to proces, w którym jednostki zewnątrzkomórkowe są internalizowane przez komórki gospodarza. Jest to kluczowa broń w arsenale układu odpornościowego do obrony przed patogenami, ale proces ten może często zostać zakłócony przez patogeny, aby umożliwić internalizację i rozprzestrzenianie się w organizmie1. Fagocytoza jest pośredniczona przez kilka zdarzeń sygnalizacyjnych, które powodują przyłączanie i pochłanianie poprzez rearanżacje cytoszkieletu komórki gospodarza. "Profesjonalne" fagocyty są w stanie rozpoznać i związać się z opsoninami na powierzchni atakującego patogenu, aby zasygnalizować przyczepienie i utworzenie lamellipodiów, które pochł....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Niedobór cholesterolu w komórkach J774A.1 z MβCD
- W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiew 105 komórek podobnych do makrofagów J774A.1 na studzienkę na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w 200 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P / S). Inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5 % CO2 O/N.
- Usuń pożywkę z monowarstwy komórek i umyj komórki dwukrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), która została przefiltrowana lub autoklawowana.
- Dodać 200 μl roztworu MβCD o pożądanym stężeniu (10 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Usuwanie cholesterolu
Analiza supernatantu zachowanego w kroku 1.3 protokołu, przeprowadzona zgodnie z instrukcjami producenta zestawu Amplex Red Cholesterol Assay, wykazuje podwyższone stężenie cholesterolu w próbce traktowanej MβCD w porównaniu z kontrolą w 1x PBS. W zależności od typu komórek i zastosowanego stężenia MβCD stopień usunięcia cholesterolu może być różny. W przypadku komórek J774 traktowanych 10 mM MβCD zaobserwowano usunięcie cholesterolu na poziomie około 50%. Stopień usunięcia .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas pracy z tym protokołem ważne jest, aby uzyskać dokładną liczbę komórek podczas posiewu komórek ssaków i opsonizacji komórek C. neoformans . Minimalizuje to różnice między próbami i zapewnia dokładny stosunek celu do efektora 1:1 w całym badaniu. Bardzo ważne jest również skoordynowanie czasu wyczerpania cholesterolu i infekcji, aby zapobiec spoczynkowi opsonizowanych komórek drożdży lub leczonych komórek makrofagów w RT między zabiegami. Długie okresy oczekiwania mogą prowadzić do utraty opsonizacji prze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NIH AI56168, AI71142, AI87541 i AI100631 MDP. Maurizio Del Poeta jest badaczem chorób zakaźnych Burroughs Wellcome.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A2 | Labconco | 3460009 | |
| linia komórkowa J774A.1 | ATCC | TIB-67 | przybywa zamrożona. Zapoznaj się z instrukcjami ATCC dotyczącymi hodowli. |
| Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Przechowywać pod adresem 4 & deg; C i ciepły do 37 & deg; C przed użyciem |
| HI Płodowa surowica bydlęca Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 stopni; C i rozmrozić przed dodaniem do DMEM |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml) | Gibco | 15140-122 | Używany do suplementacji Inkubator do |
| hodowli komórkowych | Isotemp Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-dołkowe naczynie hodowlane | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Rozcieńczyć do 1x i przefiltrować lub autoklawować przed użyciem. |
| Metylo-β-cyklodekstryna | Sigma Life Science | C4555-10G | Rozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać roztwory o stężeniach 10 mM i 30 mM |
| Wytrząsarka orbitalna | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Technologies Sondy molekularne | A12216 | Wszystkie odczynniki do oznaczania cholesterolu znajdują się w zestawie. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. |
| 96-dołkowa płytka testowa | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| Czytnik mikropłytek FilterMax | molekularne | Model F5 | |
| Komora TLC | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Papier | Whatman | 3030917 | Przyciąć do rozmiaru potrzebnego do zbiornika TLC |
| Okap | Dowolny wyciąg zgodny z normami AIHA/ANSI | ||
| Płytka 6-dołkowa | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Skrobak do komórek | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometr | Hausser Scientific | 1490 | |
| Wirówka | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Mieszalnik Votex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S mierzy do 0,1 mg | |
| Szklana pipeta Pasteura | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| Koncentrator SpeedVac | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Eter naftowy | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Eter dietylowy | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Żel krzemionkowy 60 ze strefą koncentracji | Chromatograhy analitycznej Millipore | 1.11845.0001 | |
| Chipsy jodowe | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Kwas siarkowy | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Chlorek manganu | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Użyj oprogramowania Vision Works LS do analizy densytometrycznej | |
| Szklana dzież konfokalna | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Uzyskany z Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | Instrukcja przygotowania znajduje się u producenta. Użyj stężenia glukozy 20 g/l. |
| Lipopolisacharyd | Sigma | L4391-1MG | Rozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać 1 mg / ml bulionu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Rozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać 0,1 mg/ml roztworu podstawowego |
| Przeciwciało glukuronoksylomannanu (anty-GXM) | Prezent od Arturo Casadevall's Lab stężenie wynosi 1,98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Rozpuść 0,8 g Giemsy w 25 ml glicerolu i podgrzej do 60 & stopni; C przez 1 godzinę. Dodać 25 ml metanolu do roztworu i pozostawić do leżakowania w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 miesiąc. |
| Mikroskop | Mikroskop Zeiss | Observer.D1 z AxioCam MRm do robienia zdjęć |
Bibliografia
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Ch....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
