Method Article

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

DOI:

10.3791/52459

⸱

March 23rd, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona, Verona, Italy, 2Department of Internal Medicine, University of Perugia, Perugia, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy oparte na roślinach są uważane za cenną platformę do produkcji białek rekombinowanych, ze względu na ich dobrze udokumentowany potencjał do elastycznej, taniej produkcji wysokiej jakości, bioaktywnych produktów.

W tym badaniu porównaliśmy ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego w tradycyjnych hodowlach komórkowych (bakteryjnych i owadzich) opartych na fermentorach z roślinnymi systemami ekspresji, zarówno przejściowymi, jak i stabilnymi.

Dla każdej platformy opisaliśmy ustawienie, optymalizację i długość procesu produkcyjnego, jakość produktu końcowego i wydajność, a także oceniliśmy tymczasowe koszty produkcji, specyficzne dla wybranego docelowego białka rekombinowanego.

Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki wskazują, że bakterie nie nadają się do produkcji docelowego białka ze względu na jego nagromadzenie w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych. Z drugiej strony, systemy roślinne są wszechstronnymi platformami, które pozwalają na produkcję wybranego białka przy niższych kosztach niż system Bakulowirus/komórka owada. W szczególności stabilne linie transgeniczne charakteryzowały się najwyższą wydajnością produktu końcowego, a rośliny dokonujące ekspresji przejściowej najszybszym rozwojem procesu. Jednak nie wszystkie białka rekombinowane mogą czerpać korzyści z systemów roślinnych, ale najlepsza platforma produkcyjna powinna być określona empirycznie z podejściem indywidualnym dla każdego przypadku, jak opisano tutaj.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowane białka są komercyjnie masowo produkowane w heterologicznych systemach ekspresyjnych za pomocą nowych narzędzi biotechnologicznych. Kluczowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze heterologicznego systemu ekspresji, to: jakość białka, funkcjonalność, szybkość procesu, wydajność i koszt.

W dziedzinie białek rekombinowanych, rynek farmaceutyków szybko się rozwija i w związku z tym większość produkowanych obecnie biofarmaceutyków jest rekombinowana. Białka mogą ulegać ekspresji w kulturach komórkowych bakterii, drożdży, pleśni, ssaków, roślin i owadów, a także w systemach roślinnych (poprzez stabilną lub przejściową transformację) i transgenicznych zwierząt; Każdy system ekspresji ma swoje nieodłączne zalety i ograniczenia, a dla każdego docelowego białka rekombinowanego należy dokładnie ocenić optymalny system produkcji.

Platformy oparte na roślinach stają się ważną alternatywą dla tradycyjnych systemów opartych na fermentorach dla bezpiecznej i opłacalnej produkcji białek rekombinowanych. Chociaż koszty dalszego przetwarzania są porównywalne z kosztami komórek drobnoustrojów i ssaków, kluczowymi zaletami są niższe inwestycje początkowe wymagane do komercyjnej produkcji roślin, oraz potencjalna ekonomia skali, zapewniana przez uprawę na dużych obszarach.

Oceniliśmy rośliny jako bioreaktory do ekspresji izoformy 65 kDa ludzkiej dekarboksylazy kwasu glutaminowego (hGAD65), jednego z głównych autoantygenów w autoimmunologicznej cukrzycy typu 1 (T1D). hGAD65 jest powszechnie stosowany jako marker, zarówno do klasyfikacji, jak i monitorowania postępu choroby, a jego rola w zapobieganiu cukrzycy typu 1 jest obecnie badana w badaniach klinicznych. Jeśli te próby zakończą się sukcesem, globalne zapotrzebowanie na rekombinowany hGAD65 dramatycznie wzrośnie.

Tutaj skupiamy się na ekspresji enzymatycznie nieaktywnego odpowiednika hGAD65, hGAD65mut, mutanta powstałego przez podstawienie reszty lizyny, która wiąże kofaktor PLP (fosforan pirydoksalu-5') resztą argininy (K396R)1.

hGAD65mut zachowuje swoją immunogenność i w komórkach roślin i owadów akumuluje się do dziesięciu razy wyżej niż hGAD65, jego odpowiednik typu dzikiego. Postawiono hipotezę, że aktywność enzymatyczna hGAD65 zakłóca metabolizm komórek roślinnych do tego stopnia, że hamuje własną syntezę, podczas gdy hGAD65mut, enzymatycznie nieaktywna forma, może być akumulowany w komórkach roślinnych do wyższych poziomów.

Dla ekspresji hGAD65mut, tutaj zbadano użycie różnych technologii, szeroko stosowanych w biotechnologii roślin, i porównano je z tradycyjnymi platformami ekspresji (Escherichia coli i Baculovirus/oparte na komórkach owadów).

W tej pracy, platformy rekombinacyjne opracowane do ekspresji hGAD65mut, obejmujące systemy tradycyjne i oparte na roślinach, zostały poddane przeglądowi i porównane na podstawie szybkości procesu i wydajności, a także jakości i funkcjonalności produktu końcowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa wektorów wyrażeń

  1. Komercyjny system klonowania rekombinacji:
    1. Amplifikować pełną długość sekwencji genu docelowego (hGAD65mut) za pomocą odpowiednich starterów, umożliwiając dodanie zacisku CACC na końcu 5' genu, jak opisano wcześniej2.
    2. Sklonować oczyszczony żelem produkt amplifikacji, zgodnie ze specyfikacją zestawu do klonowania kierunkowego, w wektorze wejściowym (związanym z topoizomerazą), łącząc reakcję w całkowitej objętości 6 μl, używając 1,5:1 stosunku molowego insert:vector i 1 μl roztworu soli (0,2 M NaCl i 0,01 MgCl2). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Przekształć całą reakcję w chemicznie kompetentne komórki E. coli zgodnie ze specyfikacją zestawu do klonowania kierunkowego i przesiewaj uzyskane kolonie za pomocą PCR3 kolonii, używając starterów M13 do przodu i do tyłu zawartych w zestawie do klonowania kierunkowego. Wyizolować plazmid z dodatniej kolonii zgodnie ze specyfikacją zestawu do przygotowania plazmidowego DNA i zsekwencjonować wstawkę za pomocą starterów M13 do przodu i do tyłu, aby zapewnić brak mutacji3.
    4. Otrzymany klon wejściowy należy wykorzystać do przeprowadzenia reakcji rekombinacji przez enzym klonazy II rekombinazy lambda (LR) ze specyficznymi wektorami docelowymi: do ekspresji białka rekombinowanego w komórkach bakteryjnych z pDEST17 (dający pDEST17.G65mut), w roślinach (przejściowy lub stabilny) z pK7WG2 (dający pK7WG2.G65mut), w systemie komórkowym Baculovirus/insect z linearyzowanym wirusowym DNA (dający Baculo.G65mut)4. Zbierz reakcję, zgodnie ze specyfikacją zestawu klonazy, ze 100 ng wektora wejściowego, 150 ng wektora docelowego i 2 μl mieszaniny enzymów w końcowej objętości 10 μl. Inkubować mieszankę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    5. Przekształć produkt rekombinacji w chemicznie kompetentne komórki E. coli zgodnie ze specyfikacją zestawu klonazy. Badanie przesiewowe otrzymanych kolonii metodą PCR3 przy użyciu dla wszystkich kolonii pochodzących z reakcji transformacji tego samego startera specyficznego dla GAD65mut (5'-CACACGCCGGGGCAGCAGGT-3') i następujących specyficznych wektorów docelowych starterów do przodu: dla pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; dla pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3'; dla wektora linearyzowanego Baculo: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3'.
    6. Wyizolować plazmidowe DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do minipreparatu DNA i potwierdzić obecność sekwencji docelowej za pomocą PCR3, używając tych samych specyficznych kombinacji starterów opisanych w poprzednim kroku.
    7. Uzyskane plazmidy PCR-dodatnie należy wykorzystać do transformacji różnych organizmów docelowych, w zależności od wybranej platformy do ekspresji rekombinowanych białek, jak opisano w poniższych krokach.
  2. System MagnICON5-7:
    1. Sklonuj gen docelowy w module 3' pICH31070, jak opisano wcześniej szczegółowo7, uzyskując pICH31070.G65mut. Stosować następujący specyficzny cykl reakcji: 30 minut inkubacji w temperaturze 37 °C, 5 minut w temperaturze 50 °C, a następnie 5 minut w temperaturze 80 °C.

2. Ekspresja białka rekombinowanego

  1. Bakteryjny system komórkowy:
    1. Przekształć pDEST17.G65mut w elektrokompetentne komórki E. coli BL21 (DE3) przy użyciu standardowych technik i przebadać kolonie wyhodowane na pożywce LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml), metodą PCR kolonii przy użyciu następujących starterów specyficznych dla transgenu: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3' i 5'-CACACGCCGGGGCAGCAGGT-3', o temperaturze wyżarzania 58 °C i czasie wydłużenia 20 sek. Przeprowadzić reakcję PCR w całkowitej objętości 20 μl po rozpuszczeniu komórki bakteryjne z plastikową końcówką w probówce.
    2. Zaszczepić pojedynczą kolonię przez noc w temperaturze 37 °C w 3 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml).
    3. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną w stosunku 1:100 w 100 ml świeżej pożywki LB (łącznie z ampicyliną) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-6 godzin, aż do uzyskania końcowej wartościOD 600 0,8.
    4. Indukować ekspresję białka rekombinowanego przez dodanie izopropilo-β-D-1-tiogalatopiranozydu (IPTG) w końcowym stężeniu 1 mM i inkubować hodowlę z energicznym wstrząsaniem przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    5. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 20 minut i użyć osadu bakteryjnego do ekstrakcji białka (krok 3.1.1.1).
  2. Bakulowirus/system komórkowy owadów:
    1. Umieść komórki Spodoptera frugiperda (Sf9) na płytkach 6-dołkowych (8 x 10,5 komórek na studzienkę) i przemyj dwukrotnie 2 ml nieuzupełnionego podłoża dla owadów Grace's Insect Medium.
    2. Usuń i zastąp pożywkę kroplami mieszaniną transfekcyjną (5 μl reakcji rekombinowanej LR, 6 μl roztworu celfektyny i 200 μl nieuzupełnionej pożywki dla owadów Grace's).
    3. Inkubować płytki w temperaturze 27 °C przez 5 godzin.
    4. Usunąć i zastąpić mieszaninę transfekcji 2 ml świeżej pożywki Sf-900, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 μg/ml gentamycyny i 100 μM gancyklowiru w celu wybrania rekombinowanych klonów bakulowirusa.
    5. Po inkubacji przez 96 godzin w temperaturze 27 °C zebrać pożywkę (szczep wirusa V1), odwirować przy 4 000 x g w celu usunięcia komórek i dużych zanieczyszczeń i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    6. Wysiewaj 1 x 106 komórek Sf9 na studzienkę w 2,5 ml pożywki Sf-900 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 μg/ml gentamycyny i 100 μM gancyklowiru i zainfekuj 100 μl zapasu V1 w każdym dołku.
    7. Inkubować komórki przez 3 dni w temperaturze 27 °C.
    8. Zebrać i odwirować pożywkę o sile 4 000 x g.
    9. Przechowywać supernatant (V2 o wysokim mianie) w temperaturze 4 °C.
    10. Wysiewaj 1 x 106 komórek Sf9 na studzienkę w 2,5 ml pożywki Sf-900 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 μg/ml gentamycyny i 100 μM gancyklowiru i zainfekuj 25 μl V2 zapasu w każdym dołku.
    11. Inkubować komórki przez 3 dni w temperaturze 27 °C.
    12. Zebrać komórki za pomocą wirówki przy 4 000 x g i użyć osadu z komórek owadów do ekstrakcji białka (krok 3.1.2.1).
  3. Nicotiana benthamiana przejściowe systemy ekspresji:
    1. Rośliny N. benthamiana należy uprawiać w szklarni, w naturalnym świetle w zakresie temperatur 18-23 °C. Do agroinfekcji używaj 4-5 tygodniowych roślin.
    2. Rośliny agrozakażone należy przechowywać w komorze klimatycznej w temperaturze 22 °C z 13-godzinnym fotoperiodem w dzień i 11 godzin w nocy.
    3. Komercyjny system klonowania rekombinacji:
      1. Wprowadzić pK7WG2.G65mut do elektrokompetentnych komórek szczepu Agrobacterium tumefaciens szczepu EHA105, jak opisanowcześniej 8, i przeprowadzić badanie przesiewowe kolonii wyhodowanych na pożywce LB zawierającej ryfampicynę (50 μg/ml), streptomycynę (300 μg/ml) i spektynomycynę (100 μg/ml) po 2 dniach inkubacji w temperaturze 28 °C, metodą colony PCR8 przy użyciu następujących starterów specyficznych dla transgenu: 5'-CATGGTGGAGCACGACACCCGCT-3' i 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', o temperaturze wyżarzania 58 °C i czasie wydłużenia 50 sek. Przeprowadzić reakcję PCR w całkowitej objętości 20 μl.
      2. Zaszczepić bakterie w 30 ml pożywki LB zawierającej ryfampicynę (50 μg/ml), streptomycynę (300 μg/ml) i spektynomycynę (100 μg/ml) przez dwa dni w temperaturze 28 °C.
      3. Zebrać bakterie przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml buforu infiltracyjnego (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringonu, pH 5,6). Zmierz wartość OD600, a następnie dostosuj ją do 0,9, rozcieńczając w tym samym buforze.
        UWAGA: całkowita objętość potrzebna do infiltracji trzech roślin N. benthamiana wynosi 30 ml.
      4. Za pomocą strzykawki bezigłowej o pojemności 2,5 ml należy wprowadzić zawiesinę Agrobacterium w liściach N. benthamiana. Ostrożnie i powoli wstrzykiwać w panele liściowe zawiesinę ze strzykawki. Naciekaj trzy rozwinięte liście na roślinę i użyj trzech roślin jako potrójnych porcji.
        UWAGA: ze względów zdrowotnych i bezpieczeństwa należy nosić okulary ochronne podczas procesu infiltracji.
      5. Zbierz liście przesączone 2 dni po infekcji (dpi) i zamroź w ciekłym azocie. Przechowywać tkankę roślinną w temperaturze -80 °C.
    4. System MagnICON:
      1. Wprowadź wektory MagnICON - moduł 5' (pICH20111), moduł 3' (pICH31070.G65mut) i moduł integrazy (pICH14011) - w szczepie A. tumefaciens GV3101 przy użyciu standardowych technik. Przesiewać kolonie wyhodowane na pożywce LB zawierającej 50 μg/ml ryfampicyny i odpowiedni antybiotyk specyficzny dla wektora (50 μg/ml karbenicyliny dla pICH20111 i pICH14011, 50 μg/ml kanamycyny dla pICH31070), metodą PCR kolonii przy użyciu specyficznych starterów dla każdego wektora.
      2. Zaszczepić oddzielnie trzy szczepy A. tumefaciens w 5 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml ryfampicyny i odpowiedniego antybiotyku specyficznego dla wektora i wstrząsnąć przez noc w temperaturze 28 °C.
      3. Osadzać hodowle bakterii przez noc przez wirowanie przy 4 000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić je w dwóch objętościach początkowej kultury bakteryjnej 10 mM MES (pH 5,5) i 10 mMMgSO4.
      4. Wymieszać równe objętości zawiesin bakteryjnych zawierających trzy wektory i użyć mieszaniny zawiesinowej do infiltracji liści N. benthamiana za pomocą strzykawki. Naciekaj trzy rozszerzone liście na roślinę.
      5. Zbierz liście przesączone w temperaturze 4 dpi i zamroź w ciekłym azocie.
      6. Przechowywać tkankę roślinną w temperaturze -80 °C.
  4. Stabilny system ekspresji Nicotiana tabacum:
    1. Sadzonki N. tabacum (var. Sr1) należy uprawiać i utrzymywać in vitro na stałym podłożu do hodowli roślin (4,4 g/L Murashige and Skoog - MS - pożywka zawierająca witaminy, 30 g/l sacharozy, pH 5,8, 7 g/l agaru roślinnego) w kontrolowanych warunkach w komorze klimatycznej w temperaturze 25 °C w reżimie 16 godzin/8 godzin dzień/noc.
    2. Rozpocząć wstępną hodowlę A. tumefaciens EHA105 zawierającej wektor ekspresyjny pK7WG2.G65mut w 5 ml płynnej pożywki YEB z odpowiednimi antybiotykami (ryfampicyna 50 μg/ml, streptomycyna 300 μg/ml, spektynomycyna 100 μg/ml) i rosnąć przez noc w temperaturze 28 °C w wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 200 obr./min.
    3. Użyć 1 ml kultury wstępnej do zaszczepienia 50 ml kultury Agrobacterium w pożywce YEB plus antybiotyki (ryfampicyna 50 μg/ml, streptomycyna 300 μg/ml, spektynomycyna 100 μg/ml) i rosnąć przez 24 godziny, aż kultura bakteryjna zostanie nasycona (wartość OD600 0,5-1,0).
    4. Zebrać bakterie przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić osad w 50 ml płynnej pożywki do hodowli roślin. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby całkowicie usunąć antybiotyki.
    5. Weź najpierw zdrowe, w pełni rozwinięte liście z roślin tytoniu in vitro i pokrój je na około 1 cm kwadraty.
    6. Kawałki liści przenieść na głębokie szalki Petriego zawierające zawiesinę bakteryjną i pozostawić w ciemności na 20 minut.
    7. Usunąć kawałki liści z zawiesiny i osuszyć na sterylnej bibule filtracyjnej.
    8. Umieścić kawałki liści stroną adaksjalną (górna powierzchnia liścia) na stałym podłożu do hodowli roślin zawierających 1,0 μg/ml 6-benzyloaminopuryny (BAP) i 0,1 μg/ml kwasu naftalenooctowego (NAA) i inkubować płytki przez dwa dni w komorze klimatycznej w kontrolowanych warunkach (25 °C, 16 godzin w dzień/8 godzin w nocy).
    9. Przenieść kawałki liści na stałe podłoże hodowlane (w tym 1,0 μg/ml BAP, 0,1 μg/ml NAA, 500 μg/ml cefotaksym, 100 μg/ml kanamycyny) z powierzchnią abaksjalną (dolna powierzchnia liścia) w kontakcie z podłożem.
    10. Inkubować płytki przez 2-3 tygodnie w komorze klimatycznej w temperaturze 25 °C w reżimie dzień/noc 16 godzin/8 godzin w celu wywołania tworzenia pędów. Subkultura co 2 tygodnie, przenosząc eksplantaty liści na świeżą, stałą pożywkę hodowlaną roślin zawierającą 1,0 μg/ml BAP, 0,1 μg/ml NAA, 500 μg/ml cefotaksymu i 100 μg/ml kanamycyny.
    11. Kiedy pojawią się pędy, przenieś je do purpurowych pudełek zawierających stałe podłoże hodowlane, w tym 500 μg/ml cefotaksymu i 100 μg/ml kanamycyny, aby wywołać tworzenie korzeni. Inkubować sadzonki z 16-godzinnym fotoperiodem w ciągu dnia / 8 godzin w nocy w temperaturze 25 °C przez 1-2 tygodnie.
    12. Kiedy uformują się korzenie, przenieś rośliny do gleby w szklarni.
    13. Zbierz kawałek liścia dla każdej rośliny i wyizoluj genomowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu.
    14. Wykryj obecność transgenu za pomocą specyficznego PCR. Użyć 30 ng genomowego DNA jako matrycy do amplifikacji PCR przy użyciu następujących starterów specyficznych dla transgenu: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3' i 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', o temperaturze wyżarzania 58 °C i czasie wydłużenia 20 sekund. Przeprowadzić reakcję PCR w całkowitej objętości 50 μl.
    15. Analizować produkt o stężeniu 220 pz metodą elektroforezy na 1% żelu agarozowym w buforze Tris-acetate-EDTA (TAE) (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy i 1 mM EDTA).
    16. Wybierz rośliny transgeniczne zawierające gen docelowy.
    17. Zbierz kawałek liścia z każdej z wybranych roślin transgenicznych i natychmiast zamroź w ciekłym azocie.
    18. Przygotować całkowite ekstrakty białkowe z tkanki liści roślin (etap 3.1.3) i zbadać każdą próbkę za pomocą analizy western blot zgodnie z poprzednim opisem2 w celu wybrania najlepszego rekombinowanego białka wykazującego ekspresję białka rośliny tytoniu.
    19. Kwiaty wybranej rośliny o najlepszych parametrach należy pakować w worki przed kwitnieniem, aby zapobiec zapyleniu krzyżowemu.
    20. Po kwitnieniu, dojrzewaniu owoców i wysuszeniu nasion zbieraj worki.
    21. Oddzielić nasiona od plew i przechowywać je w suchym pomieszczeniu w kontrolowanej temperaturze (20-24 °C).
    22. Zasiej wysuszone nasiona, aby wyprodukować rośliny transgeniczne drugiej generacji, a następnie wybierz roślinę o najlepszych parametrach do samozapylenia.
    23. Powtórzyć tę samą procedurę opisaną w krokach 2.4.19-2.4.21 dla kolejnych generacji.

3. Analizy ekspresji białek rekombinowanych

  1. Ekstrakcja białka całkowitego:
    1. Komórki bakteryjne:
      1. Zawiesić osad komórek bakteryjnych, zebrany w sposób opisany w kroku 2.1.5, w połowie objętości kultury soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS - 2 mM Tris/HCl, 500 mM NaCl) o pH 7,4 uzupełnionej 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF).
      2. Sonizować zawieszone osady komórkowe trzy razy przez 40 sekund przy połowie mocy, utrzymując próbkę na lodzie.
      3. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Przenieść supernatant do czystej probówki i przechowywać oddzielnie zarówno supernatant, jak i osad w temperaturze -80 °C.
      5. Rozpuszczone inkluzje zebrane w osadzie w połowie objętości lizatu komórkowego TBS pH 8,0 uzupełnionego 6 M mocznikiem przez energiczne wytrząsanie przez noc w temperaturze pokojowej.
      6. Wirować przy 10 000 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant do czystej probówki.
      7. Przechowywać zarówno supernatant, jak i osad w temperaturze -80 °C.
    2. Komórki owadów:
      1. Przemyć zakażone osady z komórek owadów, zebrane w sposób opisany w kroku 2.2.12, 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) pH 7,4.
      2. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu do lizy (20 mM Tris/HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-merkaptoetanolu i 1% Tween-20) i inkubować na lodzie przez 30 minut.
      3. Rozpuszczone komórki odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Zebrać rozpuszczalne frakcje i przechowywać w temperaturze -80 °C, a następnie wyrzucić granulki.
    3. Tkanka liścia roślinnego:
      1. Zmielić tkankę N. benthamiana lub N. tabacum na drobny proszek w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka.
      2. Homogenizować 100 mg zmielonej tkanki w 300 μl buforu ekstrakcyjnego (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), uzupełnić 3 μl koktajlu inhibitorów proteazy i rozmrozić na lodzie.
        UWAGA: wybrany stosunek masy tkanki roślinnej (g) do objętości buforu (ml) wynosi 1:3.
      3. Odwirować ekstrakt w temperaturze 30 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Zebrać supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Barwienie żelem Coomassie:
    1. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie całkowitych ekstraktów białkowych (np. 2 μl ekstraktu roślinnego, 5 μl ekstraktów bakteryjnych i owadzich) do końcowej objętości 10 μl buforu ekstrakcyjnego i dodać 5 μl 3x buforu do próbki (1,5 M Tris/HCl pH 6,8, 3% SDS, 15% glicerol, 4% β–merkaptoetanolu) do końcowego stężenia 1x.
    2. Gotować próbki przez 10 minut.
    3. Oddziel białka o 10% SDS-PAGE.
    4. Po elektroforezie podgrzej żel w obecności roztworu Coomassie A (0,05% błękitu brylantowego R-250, 25% izopropanolu, 10% kwasu octowego) w kuchence mikrofalowej przez około dwie minuty do temperatury wrzenia.
    5. Schłodzić żel do temperatury pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    6. Wyrzuć roztwór barwiący Coomassie A.
    7. Odbarwić żel przez ogrzewanie w obecności roztworu Coomassie B (0,05% błękitu brylantowego R-250, 25% izopropanolu), C (0,002% błękitu brylantowego R-250, 10% kwasu octowego) i D (10% kwasu octowego) za każdym razem, postępując zgodnie z tym samym protokołem barwienia.
    8. Po ostatnim etapie ogrzewania roztworem D pozostaw odbarwienie żelu, aż tło będzie czyste9.
  3. Analiza Western blot:
    1. Po elektroforezie przenieś oddzielone białka na membranę nitrocelulozową przy użyciu standardowych technik i zablokuj 4% mlekiem w PBS pH 7,4 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Inkubować blot przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym zawierającym pierwszorzędowe przeciwciało królicze podniesione przeciwko białku docelowemu w stosunku 1:10 000 i uzupełnione 0,1% Tween-20.
    3. Po znakowaniu przeciwciał pierwotnych przemyć membranę 3 razy przez 5 minut roztworem blokującym zawierającym 0,1% Tween-20.
    4. Inkubować z koniugowanym przeciwciałem antykróliczym z peroksydazą chrzanową (HRP) w stosunku 1:10 000 przez 1,5 godziny.
    5. Umyj membranę 5 razy po 5 minut za pomocą PBS-T (PBS uzupełniony o 0,1% Tween-20).
    6. Przetwarzaj western blot przy użyciu chemiluminescencyjnego substratu peroksydazy.
  4. Test radioimmunologiczny (RIA):
    1. Pozwolić, aby odczynniki (surowica, znacznik i sefaloza białka A) osiągnęły temperaturę pokojową i odpipetować 20 μl próbek ekstraktu białkowego i wzorców o różnych stężeniach (od 300-2 400 ng / ml dostępnego w handlu rekombinowanego hGAD65) do probówek z polistyrenu o wymiarach 12 x 75 mm.
    2. Dodać 20 μl surowicy odpornościowej, przygotowanej rozcieńczając w stosunku 1:30 surowicę z plazmaferezy pacjenta z cukrzycą typu 1.
    3. Dodać 50 μl znacznika (125-I-GAD65) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Ustaw probówkę ze znacznikiem tylko w celu oszacowania całkowitej aktywności.
    4. Dodać 50 μl białka A Sepharose i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Dozować 1 ml zimnego buforu PBS do każdej probówki i odwirować przy 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    6. Zdekantować probówki, aby usunąć supernatant i wchłonąć resztki płynu na bibułę, delikatnie stukając w rurkę.
    7. Zmierz radioaktywność immunoprecypitacyjną we wszystkich probówkach, licząc przez 1 minutę w liczniku gamma.
    8. Wykreślić w skali logarytmicznej szybkości wiązania (B/T%) kalibratorów w odniesieniu do całkowitej aktywności, aby ustalić krzywą wzorcową, i odczytać stężenie w próbkach poza krzywą kalibracyjną10,
      UWAGA: Obszary o ograniczonym dostępie powinny być zaprojektowane do przechowywania, obchodzenia się i usuwania materiałów promieniotwórczych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalny projekt heterologicznej ekspresji docelowego białka rekombinowanego w różnych systemach produkcji jest opisany tutaj. W pierwszej kolejności skupiono się na ustawieniu różnych platform poprzez ustanowienie optymalnych warunków dla ekspresji białka docelowego w każdym systemie.

Ekspresja docelowego białka, hGAD65mut, została wywołana w potrójnych kulturach E. coli. Po 3 godzinach od odciągania w temperaturze 37 °C, komórki bakteryjne zebrano przez odwirowanie i poddano ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu porównano trzy różne platformy ekspresji rekombinowanego białka ludzkiego: komórki bakteryjne, komórki bakulowirusa/owadów i rośliny. Platforma oparta na roślinach była dalej badana, wykorzystując trzy szeroko stosowane technologie ekspresji (tj. transjenty - oparte na MagnICON i pK7WG2 - oraz stabilne). Białko docelowe wybrane do tego eksperymentu, hGAD65mut, było wcześniej eksprymowane w różnych układach13, a jego produkcja i funkcjonalność są łatwo wykrywalne i mierzalne14....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie zachodzi konflikt interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez akcję COST 'Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins' FA0804. Autorzy dziękują dr. Anatolijowi Giritchowi i prof. Yuri Glebie za udostępnienie wektorów MagnICON do celów badawczych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ekstrakt drożdżowySigmaY1333
TryptoneFormediumTRP03
Agar Klasa bakteriologicznaApplichemA0949
Sf-900 II SFM mediumGibco10902-088
Grace' s Pożywka dla owadów, nieuzupełnionaGibco11595-030
Odczynnik Cellfectin IIInvitrogen10362-100
MS pożywka zawierająca witaminyDuchefa BiochemieM0222
SacharozaDuchefa BiochemieS0809
Agar roślinnyDuchefa BiochemieP1001
Ampicylina sodowaDuchefa BiochemieA0104Toksyczny
siarczan gentamycynyDuchefa BiochemieG0124Toksyczny
ganciclovirInvitrogenI2562-023
Karbenicylina disodowaDuchefa BiochemieC0109Toksyczny
siarczan kanamycynySigmaK4000Toksyczna
ryfampicynaDuchefa BiochemieR0146Toksyczny i ndash; 25 mg/ml zapas w DMSO
Siarczan streptomycynyDuchefa BiochemieS0148Toksyczny
dichlorowodorek spektynomycynyDuchefa BiochemieS0188
IPTG (izopropil-β-D-1-tiogalattopiranozyd)SigmaI5502Toksyczny
hydrat MESSigmaM8250
MgCl2Biochemiczny436994U
AcetosyringoneSigmaD134406Toksyczny – 0,1 M zapas w
strzykawce DMSO (1 ml)Terumo
MgSO4Fluka63136
BAP (6-benzyloaminopuryna)SigmaB3408Toksyczny
NAA (kwas naftalenooctowy)Duchefa BiochemieN0903Drażniący
Cefotaksym,Mylan Generics
Trizma baseSigmaT1503Dostosuj pH za pomocą 1 N HCl, aby uzyskać bufor Tris-HCl
HClSigmaH1758
NaClSigmaS30141 M zapas
KClSigmaP9541
Na2HPO4SigmaS7907
KH2PO4SigmaP9791
PMSF (fluorek fenylometanosulfonylu)SigmaP7626, toksyczny
mocznikSigmaU5378
β-merkaptoetanolSigmaM3148Toxic
Tween-20SigmaP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Dithiothreitol)SigmaD0632Toxic – 1 M zapas, przechowywać w temperaturze -20 ° C
CHAPSDuchefa BiochemieC1374Toksyczny
koktajl inhibitorów proteazy roślinnejSigmaP9599Nie zamrażaj/nie rozmrażaj zbyt wiele razy
SDS (dodecylosiarczan sodu)SigmaL3771Łatwopalny, toksyczny, – 10% zapasu
GlicerolSigmaG5516
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
IsopropanolSigma24137Łatwopalny
kwas octowySigma27221
dekarboksylaza kwasu antyglutaminowego 65/67SigmaG5163Nie zamrażaj/nie rozmrażaj zbyt wiele razy
Przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)SigmaA6154Nie zamrażaj/nie rozmrażaj zbyt wiele razy
Życie komórek Sf9 Technologie11496
BL21 Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2530H
Białko A SepharozaSigmaP2545
Płytki do hodowli komórkowychZestaw do
Techno Genetics12650805Materiał radioaktywny
testów radioimmunologicznych Sigma CLS3516

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
  3. Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  4. Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
  5. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
  6. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
  7. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
  8. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
  9. Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
  10. Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
  11. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  12. Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
  13. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).
  14. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
  15. Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinant Protein ExpressionBacterial SystemsInsect Cell SystemsPlant Based SystemsTransient ExpressionStable Transgenic LinesProtein Yield AnalysisProduction Cost EvaluationInclusion Body FormationBiofactory Comparison

Related Articles