Artykuł metodologiczny

Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52462

⸱

6 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diagnostic and Interventional Radiology, University Medical Center, Hamburg, 2Institute of Immunology, University Medical Center, Hamburg, 3University Cancer Center Hamburg, University Medical Center, Hamburg, 4Department of Oncology and Hematology, University Medical Center, Hamburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Streszczenie

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia ex vivo walidacji eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów bliskiej fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Najpierw opisujemy, jak generować guzy podskórne u myszy, używając linii komórkowych antygenowo-ujemnych jako kontroli negatywnych i komórek antygenowo-dodatnich jako kontroli pozytywnych u tych samych myszy do porównania wewnątrzosobniczego. Opisujemy, jak podawać dożylnie nanociała specyficzne dla antygenu znakowane fluoroforem w bliskiej podczerwieni (AlexaFluor680) i przeciwciała konwencjonalne. Obrazowanie in vivo przeprowadzono za pomocą systemu NIRF-Imaging dla małych zwierząt. Po eksperymentach z obrazowaniem in vivo myszy zostały złożone w ofierze. Następnie opisujemy, jak przygotować guzy do równoległych analiz ex vivo za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej w celu walidacji wyników obrazowania in vivo.

Użycie nanociał znakowanych fluoroforem w bliskiej podczerwieni pozwala na nieinwazyjne obrazowanie in vivo tego samego dnia. Nasze protokoły opisują kwantyfikację ex vivo specyficznej skuteczności znakowania komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej i analizy rozmieszczenia konstruktów przeciwciał w guzach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Korzystanie z sond znakowanych fluoroforem w bliskiej podczerwieni pozwala na nieinwazyjne, ekonomiczne obrazowanie in vivo z unikalną możliwością wykorzystania tej samej sondy bez dalszego wtórnego znakowania do eksperymentów walidacyjnych ex vivo z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

Wprowadzenie

W niniejszym raporcie opisujemy implementację sond znakowanych fluoroforem w bliskiej podczerwieni do walidacji eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów in vivo za pomocą cytometrii przepływowej ex vivo i mikroskopii fluorescencyjnej wypreparowanych guzów ksenoprzeszczepu. Porównujemy jednodomenową nanokomórkę (s+16a, 17 kDa) 1 i przeciwciało monoklonalne (Nika102, 150 kDa) 2,3 skierowane na ten sam antygen docelowy do specyficznego obrazowania fluorescencji w bliskiej podczerwieni in vivo w modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka. Docelowy antygen ADP-rybozylotransferaza ARTC2.2 ulega ekspresji jako ektoenzym zakotwiczony w powierzchni komórki GPI przez komórki chłoniaka 4-9.

Nanociała pochodzące z przeciwciał opartych wyłącznie na łańcuchach ciężkich wielbłądowatych są najmniejszymi dostępnymi fragmentami wiążącymi antygen 10,11. Przy zaledwie ~15 kDa te małe fragmenty przeciwciał są rozpuszczalne, bardzo stabilne i są usuwane nerkowo z krążenia 8,10. Te właściwości sprawiają, że są one szczególnie przydatne do specyficznego i skutecznego celowania w antygeny nowotworowe in vivo 12-20. Typowymi celami antygenowymi dostępnych nanociał są receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR1 lub HER-1), ludzki naskórkowy czynnik wzrostu typu 2 (HER-2 lub CD340), antygen rakotwórczy (CEA) i cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych-1 (VCAM-1) 21. Koniugaty Nanobody są obiecującymi narzędziami w immunoterapii nowotworów i leczeniu chorób zapalnych 22.

Ostatnie badania wykazały, że nanociała pozwalają na wyższy stosunek guza do tła (T/B) niż konwencjonalne przeciwciała w zastosowaniach obrazowania molekularnego in vivo 8,17,19. Tłumaczy się to głównie stosunkowo słabą i powolną penetracją tkanek przez konwencjonalne przeciwciała, powolnym usuwaniem z krążenia i długim zatrzymywaniem w tkankach niedocelowych 23. Co więcej, nadmiar konwencjonalnych przeciwciał prowadzi do nieswoistej akumulacji w docelowych nowotworach antygenowo-ujemnych spowodowanych efektem zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) 24,25. Oznacza to, że wyższe dawki konwencjonalnych przeciwciał mogą zwiększać nie tylko sygnały swoiste, ale także sygnały nieswoiste, zmniejszając w ten sposób maksymalny osiągalny stosunek guza do tła. W przeciwieństwie do tego, zwiększenie dawki nanociał zwiększa sygnały guzów antygenowo-dodatnich, ale nie normalnych tkanek lub guzów antygenowo-ujemnych (dane niepublikowane).

Poza porównaniem nanociał i konwencjonalnych przeciwciał, przedstawiamy wewnątrzosobniczą ocenę antygenowo-dodatnich i -ujemnych ksenoprzeszczepów u tych samych myszy w celu bezpośredniego porównania specyficznych i niespecyficznych sygnałów wynikających z efektu EPR. Sondy sprzężone z fluoroforem w bliskiej podczerwieni pozwoliły nam wykorzystać pojedynczą sondę in vivo i ex vivo przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni, cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Zastosowanie naszych protokołów pozwala na nieradioaktywną, bardzo czułą i niedrogą optymalizację eksperymentów obrazowania molekularnego in vivo, takich jak ocena nowych konstruktów przeciwciał do określonego celowania w guz

.

Celem tego badania instruktażowego jest podkreślenie wykorzystania obrazowania NIRF do oceny nowych konstruktów przeciwciał w przedklinicznym obrazowaniu molekularnym.

W tym protokole, wszystkie eksperymenty były przeprowadzane za pomocą systemu obrazowania NIRF dla małych zwierząt, cytometru przepływowego z aktywowanym fluorescencyjnie sorterem komórek (FACS) oraz mikroskopu konfokalnego.

Protokół

UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt i zostały zatwierdzone przez lokalną komisję ds. dobrostanu zwierząt przy Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Hamburgu.

1. Przygotowanie komórek nowotworowych, myszy i konstruktów przeciwciał

  1. Przygotowanie komórek chłoniaka i porcjowanie macierzy podstawnej (Matrigel).
    1. Dzień przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych umieścić wysterylizowane pudełko z końcówkami (końcówki o pojemności 1000 μl) i odpowiednią pipetę w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
    2. Rozmrozić butelkę z matrycą podstawową na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C.
    3. W dniu wstrzyknięcia napełnić wiaderko z lodem i umieścić na lodzie matrycę podstawową wraz z pipetą, końcówkami i strzykawkami o pojemności 1 ml z igłami 30 G.
    4. Podwielokrotne komórki chłoniaka w objętości 100 μl pożywki RPMI w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dokładnie wymieszać ze 100 μl macierzy podstawowej. Pobrać do wstępnie schłodzonych strzykawek i umieścić na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
      UWAGA: Używaj dobrej sterylnej techniki i cały czas pracuj na lodzie, aby zapobiec zatkaniu matrycy piwnicznej.
  2. Przygotowanie myszy
    1. Użyj 8-10 tygodniowych atymicznych nagich myszy (NMRI-Foxn1 nu).
    2. Aby zmniejszyć autofluorescencję jelita, myszy należy trzymać na diecie wolnej od lucerny przez 1 tydzień przed obrazowaniem in vivo.
    3. Do wstrzykiwań komórek chłoniaka znieczulić myszy do efektu 2% izofluranu w komorze indukcyjnej. Utrzymuj 1-2% izofluranu przez cały czas trwania zabiegu za pomocą kolektora izofluorowego.
    4. Komórki chłoniaka należy wstrzyknąć podskórnie w boki barku. W celu bezpośredniego porównania wewnątrzosobniczego wstrzyknąć komórki antygenowo-dodatnie i antygenowo-ujemne odpowiednio po prawej i lewej stronie.
      1. Użyj kciuka i palca wskazującego, aby uszczypnąć skórę myszy i odciągnąć ją od korpusu myszy. Wstrzykiwać powoli i równomiernie do torebki utworzonej przez palce, tworząc pojedyncze skupisko komórek pod skórą. Macierz podstawna pomaga utrzymać wstrzyknięte komórki na miejscu.
  3. Przygotowanie konstruktów przeciwciał
    1. Oznaczyć przeciwciała monoklonalne i nanociała jednodomenowe dostępnym na rynku zestawem do znakowania białek barwnikiem fluorescencyjnym AlexaFluor-680 (AF680) (długość fali wzbudzenia = 679 nm, długość fali emisji = 702 nm) zgodnie z instrukcjami producenta. Oblicz liczbę barwników na nano i konwencjonalne przeciwciało, używając współczynników ekstynkcji molowej wynoszących odpowiednio 15 720 mol-1 cm-1 i 203 000 mol-1 cm-1. Oceń czystość konstruktów przeciwciał przez frakcjonowanie wielkości SDS-PAGE i barwienie brylantowym błękitem Coomassie.
    2. Należy zapewnić specyficzność znakowanych koniugatów, przeprowadzając serię eksperymentów in vitro przed właściwymi badaniami obrazowymi. Zbadaj swoistość znakowanych konstruktów przeciwciał in vitro poprzez badania blokujące i niespecyficzne kontrole izotypowe 8,20,
      UWAGA: W kroku 1.2.4 może być konieczne dostosowanie liczby komórek antygenowych i antygenowo-dodatnich (lub różnych linii komórkowych) do różnych szybkości wzrostu. W tych eksperymentach użyto komórek 0,5x106 DC27.10 ARTC2 ujemnych i 1,5x106 DC27.10 ARTC2 dodatnich w celu uzyskania guzów o podobnej wielkości. W kroku 1.3.1 proces znakowania i znakowania skuteczności sond przeciwciał z fluoroforami może się różnić w zależności od zastosowanego zestawu do znakowania.

2. Obrazowanie in vivo

  1. Po 7-9 dniach, gdy guzy osiągną średnicę ~8 mm, wstrzyknij dożylnie 50 μg konstruktów przeciwciał znakowanych AlexaFluor680 w objętości 200 μl soli fizjologicznej do żyły ogonowej myszy (mAb-AF680: 50 μg z 2 barwnikami/cząsteczką ≈ ~4^14 fluorochromów ≈ ~0,8 μg fluorochromów; Nanobody-AF680: 50 μg z 0,3 barwnika/cząsteczkę ≈ ~5,6^14 fluorochromów ≈ ~1,1 μg fluorochromów).
  2. Zainicjuj system obrazowania i znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu za pomocą systemu anestezjologicznego XGI-8 w komorze indukcyjnej przed obrazowaniem. Utrzymuj 1-2% izofluranu przez cały czas trwania procedury obrazowania, korzystając z kolektora izofrubranu umieszczonego w komorze obrazowania.
    1. Umieść myszy na podgrzanym etapie obrazowania z guzami skierowanymi w stronę kamery. Monitoruj prawidłowe znieczulenie, szczypiąc palec u nogi lub ogon zwierzęcia; Każda reakcja zwierzęcia wskazuje, że znieczulenie jest zbyt lekkie.
    2. Monitoruj częstość oddechów; znieczulenie jest zbyt lekkie, jeśli częstość oddechów jest zwiększona i zbyt głębokie, jeśli częstość oddechów jest zmniejszona, głęboka lub nieregularna. Chroń rogówki zwierzęcia maścią do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  3. Wybierz zestawy filtrów fluorescencyjnych 615-665 nm do wzbudzenia, 695-770 nm do emisji i 580-610 nm do odejmowania tła o rozmiarze matrycy 51 2x 512 pikseli. Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, grupowanie pikseli na średnie, a przysłonę F/Stop na 2,
    UWAGA: Krótsze czasy naświetlania umożliwiają większą liczbę klatek na sekundę; Dłuższe czasy naświetlania zapewniają większą czułość. Binning steruje rozmiarem pikseli w kamerze CCD. Zwiększenie kategoryzacji zwiększa rozmiar piksela, czułość i liczbę klatek na sekundę, ale zmniejsza rozdzielczość przestrzenną. Przysłona F/Stop określa rozmiar przysłony obiektywu aparatu. Rozmiar przysłony kontroluje ilość wykrywanego światła i głębię ostrości. Należy pamiętać, że ustawienia mogą się różnić w zależności od urządzenia do przetwarzania obrazu i konfiguracji eksperymentalnej. Zapoznaj się z instrukcją producenta, aby uzyskać optymalne wyniki.
    1. W oprogramowaniu do obrazowania zoptymalizuj czas ekspozycji, przysłonę / stopień i grupowanie pikseli w oparciu o poziom ekspresji linii komórkowej. Możesz zmienić te ustawienia w dowolnym momencie eksperymentu bez wpływu na wynik ilościowy. Można też pozwolić, aby oprogramowanie Kreatora obrazowania automatycznie określiło parametry.
  4. Obraz myszy przed wstrzyknięciem i 6 godzin po wstrzyknięciu konstruktów przeciwciał.
    UWAGA: Skuteczność znakowania może mieć wpływ na wymaganą dawkę potrzebną do uzyskania optymalnych wyników obrazowania. W związku z tym ilość konstruktu przeciwciał wymagana do uzyskania optymalnych wyników obrazowania musi zostać określona empirycznie. Może się różnić w zależności od znakowania, skuteczności i wielkości konstruktu, a także modelu guza i ekspresji docelowego antygenu.

3. Pobieranie i przygotowanie nowotworów

  1. Napełnij wiadro z lodem i umieść na lodzie 4% soli fizjologicznej buforowanej fosforanem paraformaldehydu (PFA), soli fizjologicznej (PBS)/inhibitora proteazy (AEBSF) i PBS/0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
  2. Po zakończeniu sesji obrazowania należy zwiększyć stężenie izofluranu do 4%. Po tym, jak zwierzę przestanie oddychać, usuń je z etapu obrazowania i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Zamontuj mysz na bloku styropianowym i spryskaj 70% etanolem.
  4. Użyj nożyczek i kleszczy, aby przeciąć zewnętrzną skórę i ostrożnie ją odciągnij, aby odsłonić guzy. Usuń guzy za pomocą skalpela, aby upewnić się, że tkanka nowotworowa pozostaje nienaruszona.
  5. Przetnij guzy na pół za pomocą skalpela. Umieść jedną połowę w probówce zbiorczej z PBS/AEBSF do analiz FACS, a drugą połowę w probówce o pojemności 50 ml z 4% PFA do immunohistochemii.
  6. Przygotowanie do immunohistochemii
    1. Przechowuj guzy w 4% PFA w lodówce w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Przenieś guzy do probówki z PBS/30% sacharozą i trzymaj w lodówce w temperaturze 4 °C, aż guz opadnie na dno probówki.
    2. Pokrój guzy na odpowiednie kawałki dla krioform. Umieść guzy w krioformach i wypełnij związkiem OCT, aby guzy zostały pokryte.
    3. Połóż foremki na suchym lodzie i poczekaj, aż związek całkowicie zamarznie. Przenieś zamrożone guzy do zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowuj do celów immunohistochemicznych.
    4. Wytnij zamrożone guzy na odcinkach 8 μm za pomocą mikrotomu. Użyj standardowego protokołu immunohistochemicznego do barwienia przeciwciałem przeciwko CD31-AF488 w celu wizualizacji naczyń krwionośnych i diamidynofenyloindolu (DAPI) w celu wizualizacji jąder.
      UWAGA: Skrawki guza są bardzo wrażliwe na światło, ponieważ zawierają już przeciwciała znakowane fluorescencyjnie. Zminimalizuj ekspozycję na światło tak bardzo, jak to możliwe.
  7. Przygotowanie do analizy FACS
    1. Umieścić szalkę Petriego na lodzie i wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 2,0 ml. Umieść guz w sitku komórkowym i delikatnie pokrój go na 3-4 części za pomocą skalpela. Wlej początkowy PBS na szalkę Petriego i użyj płaskiego końca tłoka, aby rozgnieść guz w sitku do komórek.
    2. Przepłukać sitko do komórek początkowym PBS, aby wypłukać wszystkie komórki pipetą o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę komórek do nowej probówki i wirować z prędkością 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS/0,2% masy ciała. Policz komórki.
    3. Podwielokrotność 1-5 x 106 komórek chłoniaka w probówce FACS o pojemności 5 ml. Ponownie odwirować komórki (500 x g), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl PBS/0,2% BSA.
    4. Opcjonalnie zablokuj FcR za pomocą anty-CD16/CD32-mAb (FcgR3/2), który wiąże się z FcγR na lodzie przez 10 minut. Umyj komórki raz PBS/0,2% BSA.
    5. Dodaj anty-CD45-mAb, aby odróżnić leukocyty od innych komórek. Inkubować przez 20 minut na lodzie w ciemności, a następnie dwukrotnie przemyć PBS/0,2% BSA.
    6. Tuż przed analizą FACS zabarwić jodkiem propidyny przez 15 minut na lodzie, aby rozpoznać martwe komórki, a następnie dwukrotnie przepłukać zwykłym PBS. Zawiesić w 150 μl do analizy FACS.
      UWAGA: W kroku 3.7.4 i kroku 3.7.5 można zastosować inne przeciwciała w zależności od jednostki nowotworowej.

4. Analiza FACS

  1. Użyj szeregu narzędzi do bramkowania, aby bramkować populację zainteresowania w postaci dużego rozproszenia, dyskryminacji dubletowej, wykluczenia martwych komórek, bramkowania dla komórek CD45 dodatnich i bramkowania dla komórek dodatnich pod względem antygenu.
    1. Na początku odbramuj szczątki komórek w rozproszeniu do przodu (FSC-A) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC-A) przy użyciu wykresu dwuparametrowego. Następnie odrzuć dublety komórek. Na koniec odblokuj komórki nie-CD45-dodatnie (CD45) i martwe/umierające (LD – żywe/martwe barwienie).
  2. Rejestruj próbki przy użyciu tego samego szablonu dla wszystkich eksperymentów.
    UWAGA: Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać porady techniczne dotyczące korzystania ze sprzętu i oprogramowania analitycznego.

5. Analiza mikroskopowa

  1. Analizuj barwione kriosekcje guza za pomocą mikroskopu konfokalnego z soczewką immersyjną z olejkiem (obiektyw 40X). Użyj wzbudzenia laserowego He-Neon 633 nm AF680, lasera argonowego do AF488 i diody 405 do DAPI.
  2. Przetwarzaj surowe dane obrazu za pomocą oprogramowania kompatybilnego z mikroskopem. W razie potrzeby wykonaj korekcję tła i filtrowanie szumów. Wykonaj dodatkowe korekty obrazu, takie jak sekcje, przycinanie, a także regulacje jasności i kontrastu.
    1. Na koniec wygeneruj pojedynczy obraz nakładki kompozytowej ze wszystkich kanałów detekcji. Dostosuj jasność i kontrast poszczególnych warstw. Złożone obrazy pokażą lokalizację komórek (barwienie DAPI, kolor niebieski), rozmieszczenie znakowanych konstruktów przeciwciał (barwienie AF680, kolor czerwony) i naczyń krwionośnych (barwienie AF488, kolor zielony).

6. Analiza obrazowania in vivo

  1. Otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu i utwórz obraz nakładki, łącząc dane obrazu zdjęcia z danymi obrazu fluorescencyjnego. Zoptymalizuj wyświetlanie obrazu, usuwając sygnał tła autofluorescencji tkanek z określonego sygnału fluorescencyjnego. Można to zrobić, odejmując obraz uzyskany za pomocą zestawu filtrów tła od obrazu uzyskanego za pomocą zestawu filtrów specyficznego dla śledzącego.
  2. Narysuj identyczne okrągłe obszary pomiarowe zainteresowania (ROI) wokół guza antygenu dodatniego i guza antygenowo-ujemnego. Aby określić intensywność sygnału tła, umieść okrągły zwrot z inwestycji w obszarze zwierzęcia, w którym oczekuje się, że sygnał fluorescencji będzie niski (np. Tylna noga).
    1. Używaj tych samych zwrotów z inwestycji dla wszystkich zwierząt we wszystkich punktach czasowych. Do pozycjonowania użyj fotograficznych czarno-białych obrazów, aby zidentyfikować marginesy guza.
  3. Wyświetlanie danych ROI w tabeli pomiarów. Wykorzystanie danych dotyczących średniej wydajności promieniowania, które umożliwiają bardziej ilościowe porównanie sygnałów fluorescencyjnych w celu dalszych analiz statystycznych.
    1. Wyświetlaj i porównuj dane jako bezwzględne natężenia sygnału lub obliczaj stosunek sygnału do tła, korzystając ze zmierzonych danych ROI z docelowej tkanki i tkanki tła. Oblicz stosunek guza do tła, dzieląc wartość wychwytu guza przez wartość tła określoną dla kończyny tylnej.
    2. Jako grupa kontrolna analizuje również guzy antygenowo-ujemne i antygenowo-dodatnie u tych samych zwierząt, a także u zwierząt, którym wstrzyknięto znakowane kontrole izotypowe, aby ocenić specyficzność sygnałów in vivo.

Wyniki

Sondy znakowane fluorescencyjnie pozwalają na łączenie różnych technik obrazowania NIRF (Rysunek 1A). Naszym celem było sekwencyjne przeprowadzenie obrazowania NIRF in vivo, cytometrii przepływowej oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu porównania nanociał znakowanych fluorescencyjnie oraz przeciwciał monoklonalnych w specyficznym obrazowaniu in vivo (Rysunek 1B).

Myszom wstrzyknięto 50 μg nanociała oraz przeciwciała monoklonalnego, aby ocenić specyficzność znakowanych fluorescencyjnie konstruktów w obrazowaniu in vivo. Wyniki wykazały specyficzne znakowanie guzów antygenowo-dodatnich zarówno nanociałem, jak i przeciwciałem monoklonalnym 6 h po iniekcji (Rysunek 2). Analizy ROI guzów antygenowo-dodatnich wykazały znacznie wyższy stosunek T/B dla nanociała (~12) w porównaniu do przeciwciała monoklonalnego (~6). Co więcej, nanociało nie wykazało niespecyficznego sygnału w guzach antygenowo-ujemnych, podczas gdy w przypadku przeciwciała monoklonalnego w guzach antygenowo-ujemnych zaobserwowano niespecyficzne sygnały zakłócające.

Oprócz niespecyficznego sygnału w guzach ujemnych, przeciwciało monoklonalne wywołało również niespecyficzne sygnały tła w całym organizmie zwierzęcia. Jest to prawdopodobnie wynik nadmiernej ilości wolnych przeciwciał krążących, które są zbyt duże, aby zostać wydalone przez nerki. Przeciwnie, u zwierząt wstrzykniętych nanociałami sygnały niespecyficzne wystąpiły jedynie w nerkach ze względu na eliminację nerkową tych małych nanociał.

Analizy cytometrii przepływowej zawiesin komórek nowotworowych wykazały specyficzne znakowanie komórek nowotworowych dodatnich pod kątem antygenu za pomocą obu koniugatów AF680 6 h po wstrzyknięciu. Silniejszy sygnał fluorescencji komórek znakowanych nanociałem w porównaniu do komórek znakowanych przeciwciałem monoklonalnym odzwierciedla wyniki obrazowania NIRF in vivo. Co ważne, analizy cytometryczne ujawniają brak niespecyficznego znakowania komórek ujemnych pod kątem antygenu przez oba konstrukty (Rysunek 3).

Mikroskopia fluorescencyjna krioprzestrojów guza wykazała silne i niemal jednorodne znakowanie komórek pozytywnych pod kątem antygenu nanociałem 6 hr po wstrzyknięciu. Przeciwnie, przeciwciało monoklonalne wykazało znacznie słabsze i raczej niejednorodne barwienie (Rysunek 4A). Guzy negatywne pod kątem antygenu nie wykazują barwienia 6 hr po wstrzyknięciu nanociała, podczas gdy guzy negatywne pod kątem antygenu, w które wstrzyknięto konwencjonalne przeciwciało, wykazują nieswoiste, rozproszone barwienie w przestrzeni śródmiąższowej (Rysunek 4B).

Schemat obrazowania multimodalnego: NIRF AF680 z obrazowaniem in vivo, FACS, mikroskopią; porównanie nanociała i przeciwciała.
Rycina 1: Obrazowanie fluorescencyjne i konstrukty przeciwciał. (A) Układ obrazowania do oceny koniugatów AF680: obrazowanie NIRF in vivo, a następnie cytometria przepływowa i mikroskopia fluorescencyjna. (B) Schemat nanociała s+16a (czerwone) i przeciwciała monoklonalnego Nika102 (niebieskie) znakowanych AlexaFluor680. Pomarańczowe gwiazdki oznaczają fluorochromy AlexaFluor680.

Obrazowanie fluorescencyjne myszy wykazujące rozkład związków Nika102 i s+16a w 0 h i 6 h.
Rysunek 2: Obrazowanie NIRF in vivo. Obrazy sygnału fluorescencji w guzach antygen-dodatnich (+) i antygen-ujemnych (-) u myszy, którym wstrzyknięto nanociało s+16a (A) oraz przeciwciało monoklonalne Nika102 (B). Obrazowanie in vivo przeprowadzono przed (0 h) oraz 6 h po wstrzyknięciu. Intensywności sygnału przedstawiono jako wydajność promieniowania (p/sec/cm2/sr) / (µW/cm2).

Schemat analizy wykresu rozrzutu cytometrii przepływowej pokazujący detekcję komórek ARTC2+ poprzez intensywność fluorescencji.
Rycina 3: Analizy FACS ex vivo konstruktów przeciwciał związanych z komórkami w zawiesinach komórek nowotworowych. (A) Strategia bramkowania dla analiz FACS komórek nowotworowych. (B) Histogramy przedstawiają ilość nanociała s+16a oraz przeciwciała Nika102 skoniugowanych z AF680, wstrzykniętych dożylnie, które związały się specyficznie z komórkami nowotworowymi in vivo. Nowotwory antygenowo ujemne przedstawiono jako histogramy niezakreślone, a nowotwory antygenowo dodatnie jako histogramy zakreślone.

Mikroskopia fluorescencyjna s+16a<sub>680</sub> i Nika102<sub>680</sub>, ARTC2 pozytywne/negatywne.
Rysunek 4: Ex vivo mikroskopia fluorescencyjna. (A) Przeglądowy obraz mikroskopii fluorescencyjnej całych krioprzekrojów guzów antygenowo-dodatnich 6 h po wstrzyknięciu s+16a680 lub Nika102680. Intensywności sygnału z koniugatów AF680 wstrzykniętych dożylnie in vivo bez zastosowania wtórnych markerów są przedstawione na czerwono. Jądra komórkowe barwione przeciwbarwieniem ex vivo są przedstawione na niebiesko, a naczynia na zielono. Linie przerywane wskazują zewnętrzne krawędzie całych guzów. (B) Zbliżenie mikroskopii fluorescencyjnej guzów antygenowo-dodatnich i antygenowo-ujemnych.

Dyskusja

Użyliśmy nanociał znakowanych fluoroforem w bliskiej podczerwieni i konwencjonalnych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko temu samemu celowi na komórkach chłoniaka do multimodalnego porównania analiz in vivo i ex vivo . Wykazaliśmy, że nanociała doskonale nadają się jako narzędzia diagnostyczne do szybkiego i swoistego wykrywania chłoniaków in vivo .

In vivo s+16a680 umożliwił szybkie i bardziej szczegółowe wykrywanie ksenoprzeszczepów ARTC2-dodatnich. Oprócz różnej kinetyki zapewniającej najlepszą wizualizację guza in vivo, główną wadą Nika102680 był wysoki niespecyficzny sygnał z guzów ARTC2-ujemnych i niespecyficzne sygnały tła.

Analizy ex vivo cytometrii przepływowej rozproszonych komórek z wypreparowanych guzów nie wykazały niespecyficznego wiązania z komórkami chłoniaka ARTC2-ujemnymi koniugatów AF680, którym wstrzyknięto implant. Fluorescencja ex vivo wykazała silne i prawie jednorodne zabarwienie komórek w ART2C-dodatnich skrawkach guza w przypadku nanobody s+16a, potwierdzając, że nanobody był w stanie dotrzeć nawet do odległych miejsc w obrębie guza po 6 godzinach. Natomiast przeciwciało monoklonalne wykazało słabsze i niejednorodne zabarwienie komórek w guzach ARTC2-dodatnich po 6 godzinach. Lepsze wyniki obrazowania z konwencjonalnym przeciwciałem można osiągnąć po 24 godzinach lub 48 godzinach (dane nie pokazane). W celu przeprowadzenia dokładnego porównania dwóch konstruktów o różnych rozmiarach, należy przeprowadzić obrazowanie w różnych punktach czasowych (obrazowanie seryjne) w celu zidentyfikowania optymalnego punktu czasowego obrazowania dla każdego konstruktu.

Podobnie jak w przypadku innych wcześniejszych badań, przedstawione tutaj wyniki podkreślają, że obrazowanie molekularne in vivo za pomocą znakowanych nanociał umożliwia szybkie i specyficzne obrazowanie guza tego samego dnia z wysokimi stosunkami guza do tła 12-15,17-19. Przeciwnie, konwencjonalne przeciwciała powodują niski stosunek guza do tła i niespecyficzne sygnały z guzów antygenowo-ujemnych wcześnie po wstrzyknięciu ze względu na ich powolny klirens z organizmu. W celu uzyskania optymalnych wyników obrazowania za pomocą konwencjonalnych przeciwciał często potrzebne są punkty czasowe obrazowania 24 godziny lub nawet 48 godzin po wstrzyknięciu. Odkrycia te są zgodne z wcześniejszymi badaniami, które sugerowały, że konwencjonalne przeciwciała o udowodnionych korzyściach terapeutycznych mają ograniczoną użyteczność w obrazowaniu molekularnym 17,19,26. W związku z tym konwencjonalne przeciwciała mogą być raczej odpowiednie do celów terapeutycznych ze względu na ich długi okres półtrwania w osoczu, podczas gdy nanociała są raczej odpowiednie do celów obrazowania ze względu na ich szybki klirens z krążenia. Różnice te wynikają z faktu, że każdy nadmiar mniejszych nanociał (15-17 kDa) jest szybko usuwany poprzez eliminację nerkową, podczas gdy nadmiar większych konwencjonalnych przeciwciał (150 kDa) jest zatrzymywany w krążeniu. Tak więc główną zaletą nanociał do obrazowania molekularnego jest niski sygnał tła we wczesnych punktach czasowych obrazowania, niezależnie od wstrzykniętej dawki. Umożliwia to obrazowanie tego samego dnia i może być przełożone na warunki kliniczne. Z drugiej strony, konwencjonalne przeciwciała muszą być dokładnie miareczkowane, aby zminimalizować niespecyficzne sygnały tła, przy jednoczesnym utrzymaniu wystarczającej ilości specyficznego sygnału z tkanki docelowej (dane niepublikowane).

Jednym z ograniczeń techniki obrazowania NIRF in vivo jest niska głębokość penetracji, która generalnie pozwala tylko na obrazowanie podskórnych, ale nie ortotopowych modeli guza. Jednak to ograniczenie może zostać przezwyciężone w warunkach eksperymentalnych przez niedawno opracowane tomograficzne techniki fotoakustyczne, które umożliwiają obrazowanie całego ciała żywych myszy 27. Kolejnym ograniczeniem techniki obrazowania NIRF jest ocena dawki tkankowej w porównaniu z obrazowaniem za pośrednictwem radionuklidów. Nanociała mogą być jednak znakowane radioizotopowo w celu obrazowania modeli ksenoprzeszczepów za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i dokładnej ilościowej oceny biodystrybucji znaczników. Rzeczywiście, nasze wyniki obrazowania NIRF są zgodne z niedawnym badaniem, w którym porównano nanociała i konwencjonalne przeciwciała do obrazowania PET. Autorzy doszli również do wniosku, że nanociała umożliwiają obrazowanie tego samego dnia z wysokimi stosunkami guza do tła 15.

Jednak tylko znakowanie konstruktów przeciwciał barwnikiem fluorescencyjnym AF680 w bliskiej podczerwieni pozwoliło nam na kompleksowe porównanie obrazowania fluorescencji w bliskiej podczerwieni in vitro, in vivo i ex vivo przy użyciu cytometrii przepływowej, mikroskopii fluorescencyjnej i obrazowania NIRF. Z tego powodu, a także dlatego, że jest nieradioaktywny, bardzo czuły, niedrogi i wykorzystuje stosunkowo łatwe do wyprodukowania sondy celowane, opowiadamy się za stosowaniem techniki obrazowania NIRF do oceny nowych konstruktów przeciwciał w przedklinicznym obrazowaniu molekularnym.

Oświadczenia

Friedrich Koch-Nolte i Friedrich Haag otrzymują udział w sprzedaży przeciwciał i białek za pośrednictwem MediGate GmbH, spółki zależnej należącej w całości do Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez szkołę podyplomową "Zapalenie i regeneracja" Centrum Badań Współpracy 841 Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), przez Collaborative Research Centre 877 Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte), przez Fundację Wernera Otto (Peter Bannas), przez Fundację Wilhelma Sandera (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), oraz przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag i Friedrich Koch-Nolte). Dziękujemy Uniwersyteckiemu Centrum Onkologii w Hamburgu (UCCH) In Vivo Optical Imaging Core Facility oraz personelowi UKE za konsultacje i wysoką jakość usług. Program Core Facility był częściowo wspierany przez dotacje z Deutsche Krebshilfe (Niemiecka Pomoc w Walce z Rakiem).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do znakowania białek AF680InvitrogenA20172
Przeciwciało anty-CD16/CD32BioXCellBE0008
Przeciwciało anty-CD31Santa Cruzsc-1506znakowane przeciwciałem drugorzędowym z przeciwciałem anty-CD45 AF488
Przeciwciało V450BD Biosciences560501
oprogramowanie AxioVision LEZeisswww.zeiss.com
Macierz błony podstawnejBD Biosciences354234Można zastosować produkt alternatywny
Sitko komórkowe 70 µ mCorning431751Alternatywny produkt może być użyty
Mikroskop konfokalnyLeica www.leica-microsystems.comLeica SP5 z następującymi laserami: He-Neon do AF680, Argon Laser do AF488 oraz 405-diodowy do DAPI
DAPIOgniwa molekularneD1306
DC27.10 specyficzneMożna stosować inne komórki o różnych celach powierzchniowych
DPBSSigma AldrichD8662
FACS Canto IIBD Bioscienceswww.bdbiosciences.com
Mirkoskop fluorescencyjnyZeisswww.zeiss.comZeiss Axiovert 200 z zestawem filtrów #32 dla AF680: 000000-1031-354
OprogramowanieImageJ NIHhttp://imagej.nih.gov/ij/
IVIS 200Perkin Elmerwww.perkinelmer.comAlternatywny system obrazowania in vivo może być używany
Oprogramowanie Leica LASOprogramowanie Leicawww.leica-microsystems.comspecyficzne dla używanego mikroskopu
Oprogramowanie Living ImagePerkin Elmerwww.perkinelmer.comOprogramowanie specyficzne dla używanego systemu obrazowania
Igły 30 GBD Nauki biologiczne305128Można zastosować produkt alternatywny
Przeciwciało Nika102 AF680specyficzneMożna stosować inne przeciwciała przeciwko różnym celom powierzchniowym
ParaformaldehydSigma AldrichP6148Potencjalne zagrożenia: rakotwórcze, może podrażniać oczy i skórę, kontakt może powodować wysuszenie skóry i/lub alergiczne zapalenie skóry
s+16a-nanobody AF680laboratorium specyficznyMożna stosować inne przeciwciała przeciwko różnym celom powierzchniowym
Strzykawki 1 mlBraun916 1406 VMożna użyć alternatywnego produktu
dla laboratorium dla laboratorium

Bibliografia

  1. Koch-Nolte, F., et al. Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).
  2. Koch-Nolte, F., et al. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).
  3. Koch-Nolte, F., et al. Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation. Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).
  4. Bannas, P., et al. Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts. Blood. 105, 3663-3670 (2005).
  5. Bannas, P., et al. Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells. Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).
  6. Bannas, P., et al. Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death. Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).
  7. Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases. Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).
  8. Bannas, P., et al. In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies. Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).
  9. Scheuplein, F., et al. NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells. J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).
  10. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  11. Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).
  12. Vaneycken, I., et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).
  13. Xavier, C., et al. Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer. J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).
  14. Tchouate Gainkam, L. O., et al. Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy. Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).
  15. Vosjan, M. J., et al. Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).
  16. Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy. Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).
  17. Kijanka, M., et al. Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).
  18. Zaman, M. B., et al. Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer. J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).
  19. Oliveira, S., et al. Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody. Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).
  20. Gainkam, L. O., et al. Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT. J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).
  21. Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging. Theranostics. 4, 386-398 (2014).
  22. Siontorou, C. G. Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy. International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).
  23. Kaur, S., et al. Recent trends in antibody-based oncologic imaging. Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).
  24. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).
  25. Jain, R. K., Stylianopoulos, T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).
  26. Lisy, M. R., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice. Radiology. 247, 779-787 (2008).
  27. Herzog, E., et al. Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography. Radiology. 263, 461-468 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnaksenoprzeszczep nowotworuwalidacja nanociałznakowanie przeciwciałanaliza ex vivoobrazowanie in vivobliska podczerwień
Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.