Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

W niniejszym raporcie opisujemy implementację sond znakowanych fluoroforem w bliskiej podczerwieni do walidacji eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów in vivo za pomocą cytometrii przepływowej ex vivo i mikroskopii fluorescencyjnej wypreparowanych guzów ksenoprzeszczepu. Porównujemy jednodomenową nanokomórkę (s+16a, 17 kDa) ¹ i przeciwciało monoklonalne (Nika102, 150 kDa) ^2,3 skierowane na ten sam antygen docelowy do specyficznego obrazowania fluorescencji w bliskiej podczerwieni in vivo w modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka. Docelowy antygen ADP-rybozylotransferaza ARTC2.2 ulega ekspresji jako ektoenzym zakotwiczony w powierzchni komórki GPI przez komórki chłoniaka ^4-9.

Nanociała pochodzące z przeciwciał opartych wyłącznie na łańcuchach ciężkich wielbłądowatych są najmniejszymi dostępnymi fragmentami wiążącymi antygen ^10,11. Przy zaledwie ~15 kDa te małe fragmenty przeciwciał są rozpuszczalne, bardzo stabilne i są usuwane nerkowo z krążenia ^8,10. Te właściwości sprawiają, że są one szczególnie przydatne do specyficznego i skutecznego celowania w antygeny nowotworowe in vivo ^12-20. Typowymi celami antygenowymi dostępnych nanociał są receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR1 lub HER-1), ludzki naskórkowy czynnik wzrostu typu 2 (HER-2 lub CD340), antygen rakotwórczy (CEA) i cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych-1 (VCAM-1) ²¹. Koniugaty Nanobody są obiecującymi narzędziami w immunoterapii nowotworów i leczeniu chorób zapalnych ²².

Ostatnie badania wykazały, że nanociała pozwalają na wyższy stosunek guza do tła (T/B) niż konwencjonalne przeciwciała w zastosowaniach obrazowania molekularnego in vivo ^8,17,19. Tłumaczy się to głównie stosunkowo słabą i powolną penetracją tkanek przez konwencjonalne przeciwciała, powolnym usuwaniem z krążenia i długim zatrzymywaniem w tkankach niedocelowych ²³. Co więcej, nadmiar konwencjonalnych przeciwciał prowadzi do nieswoistej akumulacji w docelowych nowotworach antygenowo-ujemnych spowodowanych efektem zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) ^24,25. Oznacza to, że wyższe dawki konwencjonalnych przeciwciał mogą zwiększać nie tylko sygnały swoiste, ale także sygnały nieswoiste, zmniejszając w ten sposób maksymalny osiągalny stosunek guza do tła. W przeciwieństwie do tego, zwiększenie dawki nanociał zwiększa sygnały guzów antygenowo-dodatnich, ale nie normalnych tkanek lub guzów antygenowo-ujemnych (dane niepublikowane).

Poza porównaniem nanociał i konwencjonalnych przeciwciał, przedstawiamy wewnątrzosobniczą ocenę antygenowo-dodatnich i -ujemnych ksenoprzeszczepów u tych samych myszy w celu bezpośredniego porównania specyficznych i niespecyficznych sygnałów wynikających z efektu EPR. Sondy sprzężone z fluoroforem w bliskiej podczerwieni pozwoliły nam wykorzystać pojedynczą sondę in vivo i ex vivo przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni, cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Zastosowanie naszych protokołów pozwala na nieradioaktywną, bardzo czułą i niedrogą optymalizację eksperymentów obrazowania molekularnego in vivo, takich jak ocena nowych konstruktów przeciwciał do określonego celowania w guz

Celem tego badania instruktażowego jest podkreślenie wykorzystania obrazowania NIRF do oceny nowych konstruktów przeciwciał w przedklinicznym obrazowaniu molekularnym.

W tym protokole, wszystkie eksperymenty były przeprowadzane za pomocą systemu obrazowania NIRF dla małych zwierząt, cytometru przepływowego z aktywowanym fluorescencyjnie sorterem komórek (FACS) oraz mikroskopu konfokalnego.

UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt i zostały zatwierdzone przez lokalną komisję ds. dobrostanu zwierząt przy Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Hamburgu.

1. Przygotowanie komórek nowotworowych, myszy i konstruktów przeciwciał

1. Przygotowanie komórek chłoniaka i porcjowanie macierzy podstawnej (Matrigel).
   1. Dzień przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych umieścić wysterylizowane pudełko z końcówkami (końcówki o pojemności 1000 μl) i odpowiednią pipetę w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
   2. Rozmrozić butelkę z matrycą podstawową na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C.
   3. W dniu wstrzyknięcia napełnić wiaderko z lodem i umieścić na lodzie matrycę podstawową wraz z pipetą, końcówkami i strzykawkami o pojemności 1 ml z igłami 30 G.
   4. Podwielokrotne komórki chłoniaka w objętości 100 μl pożywki RPMI w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dokładnie wymieszać ze 100 μl macierzy podstawowej. Pobrać do wstępnie schłodzonych strzykawek i umieścić na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
      UWAGA: Używaj dobrej sterylnej techniki i cały czas pracuj na lodzie, aby zapobiec zatkaniu matrycy piwnicznej.
2. Przygotowanie myszy
   1. Użyj 8-10 tygodniowych atymicznych nagich myszy (NMRI-Foxn1 ^nu).
   2. Aby zmniejszyć autofluorescencję jelita, myszy należy trzymać na diecie wolnej od lucerny przez 1 tydzień przed obrazowaniem in vivo.
   3. Do wstrzykiwań komórek chłoniaka znieczulić myszy do efektu 2% izofluranu w komorze indukcyjnej. Utrzymuj 1-2% izofluranu przez cały czas trwania zabiegu za pomocą kolektora izofluorowego.
   4. Komórki chłoniaka należy wstrzyknąć podskórnie w boki barku. W celu bezpośredniego porównania wewnątrzosobniczego wstrzyknąć komórki antygenowo-dodatnie i antygenowo-ujemne odpowiednio po prawej i lewej stronie.
      1. Użyj kciuka i palca wskazującego, aby uszczypnąć skórę myszy i odciągnąć ją od korpusu myszy. Wstrzykiwać powoli i równomiernie do torebki utworzonej przez palce, tworząc pojedyncze skupisko komórek pod skórą. Macierz podstawna pomaga utrzymać wstrzyknięte komórki na miejscu.
3. Przygotowanie konstruktów przeciwciał
   1. Oznaczyć przeciwciała monoklonalne i nanociała jednodomenowe dostępnym na rynku zestawem do znakowania białek barwnikiem fluorescencyjnym AlexaFluor-680 (AF680) (długość fali wzbudzenia = 679 nm, długość fali emisji = 702 nm) zgodnie z instrukcjami producenta. Oblicz liczbę barwników na nano i konwencjonalne przeciwciało, używając współczynników ekstynkcji molowej wynoszących odpowiednio 15 720 ^{mol-1 cm-1} i 203 000 ^{mol-1 cm-1}. Oceń czystość konstruktów przeciwciał przez frakcjonowanie wielkości SDS-PAGE i barwienie brylantowym błękitem Coomassie.
   2. Należy zapewnić specyficzność znakowanych koniugatów, przeprowadzając serię eksperymentów in vitro przed właściwymi badaniami obrazowymi. Zbadaj swoistość znakowanych konstruktów przeciwciał in vitro poprzez badania blokujące i niespecyficzne kontrole izotypowe ^8,20,
      UWAGA: W kroku 1.2.4 może być konieczne dostosowanie liczby komórek antygenowych i antygenowo-dodatnich (lub różnych linii komórkowych) do różnych szybkości wzrostu. W tych eksperymentach użyto komórek 0,5x10⁶ DC27.10 ARTC2 ujemnych i 1,5x10⁶ DC27.10 ARTC2 dodatnich w celu uzyskania guzów o podobnej wielkości. W kroku 1.3.1 proces znakowania i znakowania skuteczności sond przeciwciał z fluoroforami może się różnić w zależności od zastosowanego zestawu do znakowania.

2. Obrazowanie in vivo

1. Po 7-9 dniach, gdy guzy osiągną średnicę ~8 mm, wstrzyknij dożylnie 50 μg konstruktów przeciwciał znakowanych AlexaFluor680 w objętości 200 μl soli fizjologicznej do żyły ogonowej myszy (mAb-AF680: 50 μg z 2 barwnikami/cząsteczką ≈ ~4^14 fluorochromów ≈ ~0,8 μg fluorochromów; Nanobody-AF680: 50 μg z 0,3 barwnika/cząsteczkę ≈ ~5,6^14 fluorochromów ≈ ~1,1 μg fluorochromów).
2. Zainicjuj system obrazowania i znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu za pomocą systemu anestezjologicznego XGI-8 w komorze indukcyjnej przed obrazowaniem. Utrzymuj 1-2% izofluranu przez cały czas trwania procedury obrazowania, korzystając z kolektora izofrubranu umieszczonego w komorze obrazowania.
   1. Umieść myszy na podgrzanym etapie obrazowania z guzami skierowanymi w stronę kamery. Monitoruj prawidłowe znieczulenie, szczypiąc palec u nogi lub ogon zwierzęcia; Każda reakcja zwierzęcia wskazuje, że znieczulenie jest zbyt lekkie.
   2. Monitoruj częstość oddechów; znieczulenie jest zbyt lekkie, jeśli częstość oddechów jest zwiększona i zbyt głębokie, jeśli częstość oddechów jest zmniejszona, głęboka lub nieregularna. Chroń rogówki zwierzęcia maścią do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
3. Wybierz zestawy filtrów fluorescencyjnych 615-665 nm do wzbudzenia, 695-770 nm do emisji i 580-610 nm do odejmowania tła o rozmiarze matrycy 51 2x 512 pikseli. Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, grupowanie pikseli na średnie, a przysłonę F/Stop na 2,
   UWAGA: Krótsze czasy naświetlania umożliwiają większą liczbę klatek na sekundę; Dłuższe czasy naświetlania zapewniają większą czułość. Binning steruje rozmiarem pikseli w kamerze CCD. Zwiększenie kategoryzacji zwiększa rozmiar piksela, czułość i liczbę klatek na sekundę, ale zmniejsza rozdzielczość przestrzenną. Przysłona F/Stop określa rozmiar przysłony obiektywu aparatu. Rozmiar przysłony kontroluje ilość wykrywanego światła i głębię ostrości. Należy pamiętać, że ustawienia mogą się różnić w zależności od urządzenia do przetwarzania obrazu i konfiguracji eksperymentalnej. Zapoznaj się z instrukcją producenta, aby uzyskać optymalne wyniki.
   1. W oprogramowaniu do obrazowania zoptymalizuj czas ekspozycji, przysłonę / stopień i grupowanie pikseli w oparciu o poziom ekspresji linii komórkowej. Możesz zmienić te ustawienia w dowolnym momencie eksperymentu bez wpływu na wynik ilościowy. Można też pozwolić, aby oprogramowanie Kreatora obrazowania automatycznie określiło parametry.
4. Obraz myszy przed wstrzyknięciem i 6 godzin po wstrzyknięciu konstruktów przeciwciał.
   UWAGA: Skuteczność znakowania może mieć wpływ na wymaganą dawkę potrzebną do uzyskania optymalnych wyników obrazowania. W związku z tym ilość konstruktu przeciwciał wymagana do uzyskania optymalnych wyników obrazowania musi zostać określona empirycznie. Może się różnić w zależności od znakowania, skuteczności i wielkości konstruktu, a także modelu guza i ekspresji docelowego antygenu.

3. Pobieranie i przygotowanie nowotworów

1. Napełnij wiadro z lodem i umieść na lodzie 4% soli fizjologicznej buforowanej fosforanem paraformaldehydu (PFA), soli fizjologicznej (PBS)/inhibitora proteazy (AEBSF) i PBS/0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
2. Po zakończeniu sesji obrazowania należy zwiększyć stężenie izofluranu do 4%. Po tym, jak zwierzę przestanie oddychać, usuń je z etapu obrazowania i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
3. Zamontuj mysz na bloku styropianowym i spryskaj 70% etanolem.
4. Użyj nożyczek i kleszczy, aby przeciąć zewnętrzną skórę i ostrożnie ją odciągnij, aby odsłonić guzy. Usuń guzy za pomocą skalpela, aby upewnić się, że tkanka nowotworowa pozostaje nienaruszona.
5. Przetnij guzy na pół za pomocą skalpela. Umieść jedną połowę w probówce zbiorczej z PBS/AEBSF do analiz FACS, a drugą połowę w probówce o pojemności 50 ml z 4% PFA do immunohistochemii.
6. Przygotowanie do immunohistochemii
   1. Przechowuj guzy w 4% PFA w lodówce w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Przenieś guzy do probówki z PBS/30% sacharozą i trzymaj w lodówce w temperaturze 4 °C, aż guz opadnie na dno probówki.
   2. Pokrój guzy na odpowiednie kawałki dla krioform. Umieść guzy w krioformach i wypełnij związkiem OCT, aby guzy zostały pokryte.
   3. Połóż foremki na suchym lodzie i poczekaj, aż związek całkowicie zamarznie. Przenieś zamrożone guzy do zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowuj do celów immunohistochemicznych.
   4. Wytnij zamrożone guzy na odcinkach 8 μm za pomocą mikrotomu. Użyj standardowego protokołu immunohistochemicznego do barwienia przeciwciałem przeciwko CD31-AF488 w celu wizualizacji naczyń krwionośnych i diamidynofenyloindolu (DAPI) w celu wizualizacji jąder.
      UWAGA: Skrawki guza są bardzo wrażliwe na światło, ponieważ zawierają już przeciwciała znakowane fluorescencyjnie. Zminimalizuj ekspozycję na światło tak bardzo, jak to możliwe.
7. Przygotowanie do analizy FACS
   1. Umieścić szalkę Petriego na lodzie i wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 2,0 ml. Umieść guz w sitku komórkowym i delikatnie pokrój go na 3-4 części za pomocą skalpela. Wlej początkowy PBS na szalkę Petriego i użyj płaskiego końca tłoka, aby rozgnieść guz w sitku do komórek.
   2. Przepłukać sitko do komórek początkowym PBS, aby wypłukać wszystkie komórki pipetą o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę komórek do nowej probówki i wirować z prędkością 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS/0,2% masy ciała. Policz komórki.
   3. Podwielokrotność 1-5 x 10⁶ komórek chłoniaka w probówce FACS o pojemności 5 ml. Ponownie odwirować komórki (500 x g), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl PBS/0,2% BSA.
   4. Opcjonalnie zablokuj FcR za pomocą anty-CD16/CD32-mAb (FcgR3/2), który wiąże się z FcγR na lodzie przez 10 minut. Umyj komórki raz PBS/0,2% BSA.
   5. Dodaj anty-CD45-mAb, aby odróżnić leukocyty od innych komórek. Inkubować przez 20 minut na lodzie w ciemności, a następnie dwukrotnie przemyć PBS/0,2% BSA.
   6. Tuż przed analizą FACS zabarwić jodkiem propidyny przez 15 minut na lodzie, aby rozpoznać martwe komórki, a następnie dwukrotnie przepłukać zwykłym PBS. Zawiesić w 150 μl do analizy FACS.
      UWAGA: W kroku 3.7.4 i kroku 3.7.5 można zastosować inne przeciwciała w zależności od jednostki nowotworowej.

4. Analiza FACS

1. Użyj szeregu narzędzi do bramkowania, aby bramkować populację zainteresowania w postaci dużego rozproszenia, dyskryminacji dubletowej, wykluczenia martwych komórek, bramkowania dla komórek CD45 dodatnich i bramkowania dla komórek dodatnich pod względem antygenu.
   1. Na początku odbramuj szczątki komórek w rozproszeniu do przodu (FSC-A) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC-A) przy użyciu wykresu dwuparametrowego. Następnie odrzuć dublety komórek. Na koniec odblokuj komórki nie-CD45-dodatnie (CD45) i martwe/umierające (LD – żywe/martwe barwienie).
2. Rejestruj próbki przy użyciu tego samego szablonu dla wszystkich eksperymentów.
   UWAGA: Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać porady techniczne dotyczące korzystania ze sprzętu i oprogramowania analitycznego.

5. Analiza mikroskopowa

1. Analizuj barwione kriosekcje guza za pomocą mikroskopu konfokalnego z soczewką immersyjną z olejkiem (obiektyw 40X). Użyj wzbudzenia laserowego He-Neon 633 nm AF680, lasera argonowego do AF488 i diody 405 do DAPI.
2. Przetwarzaj surowe dane obrazu za pomocą oprogramowania kompatybilnego z mikroskopem. W razie potrzeby wykonaj korekcję tła i filtrowanie szumów. Wykonaj dodatkowe korekty obrazu, takie jak sekcje, przycinanie, a także regulacje jasności i kontrastu.
   1. Na koniec wygeneruj pojedynczy obraz nakładki kompozytowej ze wszystkich kanałów detekcji. Dostosuj jasność i kontrast poszczególnych warstw. Złożone obrazy pokażą lokalizację komórek (barwienie DAPI, kolor niebieski), rozmieszczenie znakowanych konstruktów przeciwciał (barwienie AF680, kolor czerwony) i naczyń krwionośnych (barwienie AF488, kolor zielony).

6. Analiza obrazowania in vivo

1. Otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu i utwórz obraz nakładki, łącząc dane obrazu zdjęcia z danymi obrazu fluorescencyjnego. Zoptymalizuj wyświetlanie obrazu, usuwając sygnał tła autofluorescencji tkanek z określonego sygnału fluorescencyjnego. Można to zrobić, odejmując obraz uzyskany za pomocą zestawu filtrów tła od obrazu uzyskanego za pomocą zestawu filtrów specyficznego dla śledzącego.
2. Narysuj identyczne okrągłe obszary pomiarowe zainteresowania (ROI) wokół guza antygenu dodatniego i guza antygenowo-ujemnego. Aby określić intensywność sygnału tła, umieść okrągły zwrot z inwestycji w obszarze zwierzęcia, w którym oczekuje się, że sygnał fluorescencji będzie niski (np. Tylna noga).
   1. Używaj tych samych zwrotów z inwestycji dla wszystkich zwierząt we wszystkich punktach czasowych. Do pozycjonowania użyj fotograficznych czarno-białych obrazów, aby zidentyfikować marginesy guza.
3. Wyświetlanie danych ROI w tabeli pomiarów. Wykorzystanie danych dotyczących średniej wydajności promieniowania, które umożliwiają bardziej ilościowe porównanie sygnałów fluorescencyjnych w celu dalszych analiz statystycznych.
   1. Wyświetlaj i porównuj dane jako bezwzględne natężenia sygnału lub obliczaj stosunek sygnału do tła, korzystając ze zmierzonych danych ROI z docelowej tkanki i tkanki tła. Oblicz stosunek guza do tła, dzieląc wartość wychwytu guza przez wartość tła określoną dla kończyny tylnej.
   2. Jako grupa kontrolna analizuje również guzy antygenowo-ujemne i antygenowo-dodatnie u tych samych zwierząt, a także u zwierząt, którym wstrzyknięto znakowane kontrole izotypowe, aby ocenić specyficzność sygnałów in vivo.

Sondy znakowane fluorescencyjnie pozwalają na kombinację różnych technik obrazowania NIRF (Rysunek 1A). Naszym celem było sekwencyjne obrazowanie NIRF in vivo, cytometria przepływowa i mikroskopia fluorescencyjna w celu porównania znakowanych fluorescencyjnie nanociał i przeciwciał monoklonalnych do specyficznego obrazowania in vivo (Figura 1B).

Myszom wstrzyknięto 50 μg nanowirusa i przeciwciała monoklonalnego, aby ocenić specyficzność fluorescencyjnie znakowanych konstruktów do obrazowania in vivo. Wyniki wykazały specyficzne znakowanie guzów antygenowo-dodatnich zarówno za pomocą nanocząsteczki, jak i przeciwciała monoklonalnego po 6 godzinach od wstrzyknięcia (ryc. 2). Analizy ROI guzów antygenowo-dodatnich wykazały znacznie wyższy stosunek T/B wynoszący ~12 dla nano w porównaniu do ~6 dla przeciwciała monoklonalnego. Co więcej, przeciwciało monoklonalne nie wykazało niespecyficznego sygnału w guzach antygenowo-ujemnych, podczas gdy przeciwciało monoklonalne wykazało niespecyficzne sygnały zakłócające w guzach antygenowo-ujemnych.

Oprócz niespecyficznego sygnału ujemnych guzów, przeciwciało monoklonalne wywołało również niespecyficzne sygnały tła u całego zwierzęcia. Jest to prawdopodobnie spowodowane nadmiarem wolnych krążących przeciwciał, które są zbyt duże, aby mogły zostać wydalone przez nerki. Z drugiej strony, zwierzęta, którym wstrzyknięto nanociała, wykazywały niespecyficzne sygnały tylko w nerkach ze względu na eliminację małych nanociał przez nerki.

Analizy cytometrii przepływowej zawiesin komórek nowotworowych wykazały specyficzne znakowanie komórek nowotworowych antygenowo-dodatnich za pomocą obu koniugatów AF680 6 godzin po wstrzyknięciu. Silniejszy sygnał fluorescencyjny komórek znakowanych nanoklonami w porównaniu z komórkami znakowanymi przeciwciałami monoklonalnymi odzwierciedla wyniki obrazowania NIRF in vivo. Co ważne, analizy cytometrii przepływowej ujawniają, że nie ma niespecyficznego znakowania komórek antygenowo-ujemnych za pomocą żadnego z dwóch konstruktów (ryc. 3).

Mikroskopia fluorescencyjna kriosekcji guza wykazała silne i prawie jednorodne znakowanie komórek antygenu za pomocą nanoniki 6 godzin po wstrzyknięciu. Przeciwnie, przeciwciało monoklonalne wykazało znacznie słabsze i raczej niejednorodne barwienie (ryc. 4A). Guzy antygenowo-ujemne nie wykazują barwienia 6 godzin po wstrzyknięciu nanociała, podczas gdy guzy antygenowo-ujemne wstrzyknięte konwencjonalnym przeciwciałem wykazują niespecyficzne rozproszone barwienie w przestrzeni śródmiąższowej (Figura 4B).

Rycina 1: Obrazowanie fluorescencyjne i konstrukty przeciwciał. (A) Konfiguracja obrazowania do oceny koniugatów AF680: Obrazowanie NIRF in vivo, a następnie cytometria przepływowa i mikroskopia fluorescencyjna. (B) Schemat AlexaFluor680 znakowanego nanobody s+16a (czerwony) i przeciwciała monoklonalnego Nika102 (niebieski). Pomarańczowe gwiazdki oznaczają fluorochromy AlexaFluor680.

Rycina 2: Obrazowanie in vivo NIRF. Obrazy sygnału fluorescencyjnego guzów antygenowo-dodatnich (+) i antygenowo-ujemnych (-) u myszy, którym wstrzyknięto nano s + 16a (A) i przeciwciało monoklonalne Nika102 (B). Obrazowanie in vivo wykonano przed (0 h) i 6 h po wstrzyknięciu. Natężenia sygnału są wyświetlane jako wydajność promieniowania (p/s/cm2/sr) / (μW/cm2).

Rycina 3: Analizy ex vivo FACS konstruktów przeciwciał związanych z komórkami z zawiesin komórek nowotworowych. (A) Strategia bramkowania dla analiz FACS komórek nowotworowych. (B) Histogramy pokazują ilość wstrzykniętego dożylnie nononika s + 16a sprzężonego z AF680 i przeciwciała Nika102 specyficznie związanego z komórkami nowotworowymi in vivo. Guzy antygenowo-ujemne są wyświetlane jako niewypełnione histogramy, a guzy antygenowo-dodatnie są wyświetlane jako wypełnione histogramy.

Ryc. 4: Mikroskopia fluorescencyjna ex vivo.(A) Przegląd mikroskopii fluorescencyjnej całych kriosekcji guza antygenu dodatniego 6 godzin po wstrzyknięciu s + 16a680 lub Nika102680. Natężenie sygnału koniugatów AF680 wstrzykniętych in vivo dożylnie bez żadnych wtórnych środków znakujących jest wyświetlane na czerwono. Jądra barwione przeciwstawnie ex vivo są wyświetlane na niebiesko, a naczynia na zielono. Przerywane linie wskazują zewnętrzne brzegi całych guzów. (B) Mikroskopia fluorescencyjna z bliska guzów antygenowo-dodatnich i antygenowo-ujemnych.

Friedrich Koch-Nolte i Friedrich Haag otrzymują udział w sprzedaży przeciwciał i białek za pośrednictwem MediGate GmbH, spółki zależnej należącej w całości do Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf.