Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

38.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52488

⸱

24 lutego 2015

 ,  , 
1Department of Physiology, University of Oklahoma College of Medicine, 2Department of Geriatric Medicine, University of Oklahoma College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Streszczenie

Rola procesów epigenetycznych w kontroli ekspresji genów jest znana od wielu lat. Metylacja DNA na resztach cytozyny jest szczególnie interesująca w badaniach epigenetycznych, ponieważ wykazano, że jest ona zarówno długotrwałym, jak i dynamicznym regulatorem ekspresji genów. Wysiłki mające na celu zbadanie zmian epigenetycznych w zdrowiu i chorobie są utrudnione przez brak metod o wysokiej przepustowości i dokładności ilościowej. Wraz z pojawieniem się i popularyzacją technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), narzędzia te są obecnie stosowane w epigenomice jako dodatek do istniejących metodologii genomicznych i transkryptomicznych. Do badań epigenetycznych metylacji cytozyny, w których zidentyfikowano obszary zainteresowania, takie jak określone promotory genów lub wyspy CpG, i istnieje potrzeba zbadania znacznej liczby próbek z dużą dokładnością ilościową, opracowaliśmy metodę zwaną sekwencjonowaniem amplikonów wodorosiarczynowych (BSAS). Metoda ta łączy konwersję wodorosiarczynu z ukierunkowaną amplifikacją obszarów zainteresowania, budową biblioteki za pośrednictwem transposomów i laboratoryjnym NGS. BSAS oferuje szybką i wydajną metodę analizy do 10 kb docelowych regionów w maksymalnie 96 próbkach jednocześnie, która może być wykonywana przez większość grup badawczych posiadających podstawowe umiejętności w zakresie biologii molekularnej. Wyniki zapewniają bezwzględną ilościową ocenę metylacji cytozyny ze swoistością zasadową. BSAS można zastosować do dowolnego regionu genomu z dowolnego źródła DNA. Metoda ta jest przydatna do testowania hipotez w docelowych regionach zainteresowania, a także do potwierdzania regionów zidentyfikowanych w analizach metylacji całego genomu, takich jak sekwencjonowanie wodorosiarczynów całego genomu, sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji i sekwencjonowanie immunoprecypitacji metylowanego DNA.

Wprowadzenie

Minęło ponad pół wieku od pierwszego doniesienia o naturalnie występujących modyfikacjach DNA w postaci metylacji cytozyny1. Metylacja cytozyny to zmodyfikowana zasada nukleotydowa cytozyny, w którejpiąty węgiel na pierścieniu zasadowym ma grupę metylową (5-mC), najczęściej występującą w motywie dinukleotydowym CpG w genomach ssaków. Funkcjonalna obecność 5-mC w promotorach genów jest na ogół związana z represją transkrypcji, podczas gdy brak jest związany z aktywnością transkrypcyjną2.

Ogromny postęp został osiągnięty w naszym zrozumieniu roli metylacji DNA w rozwoju3, transgeneracyjnym rozprzestrzenianiu profili epigenetycznych4, patogenezie raka5,6 i wielu innych obszarach badawczych. Wiele z tych postępów nastąpiło w ciągu ostatnich kilku lat, gdy opracowano nowe metodologie profilowania metylacji DNA7. Wraz z pojawieniem się i popularyzacją technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) istnieje obecnie wiele metod profilowania metylacji DNA w całym genomie lub dużych regionach genomu8. Podejścia te otwierają możliwość badań odkrywczych, które określają ilościowo wzorce metylacji DNA i różnice w metylacji DNA. Oprócz tych podejść generujących hipotezy, istnieje znaczne zapotrzebowanie na metody ilościowego testowania metylacji DNA w oparciu o hipotezy.

Pirosekwencjonowanie, PCR specyficzny dla metylacji i bezpośrednie sekwencjonowanie Sangera DNA przekształconego w wodorosiarczyn były najczęściej stosowanymi metodami analizy docelowych regionów (tj. regionu promotorowego pojedynczego genu lub wyspy CpG)9-12. Wszystkie te metody opierają się na konwersji wodorosiarczynów, chemicznej reakcji deaminacji, w której niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, podczas gdy metylowane cytozyny pozostają nienaruszone13,14. Amplifikacja PCR DNA przekształconego w wodorosiarczyn powoduje zastąpienie uracylu tyminą15, co pozwala na odczytanie metylacji różnicowej jako różnicy zasad. Chociaż są one bardzo przydatne, ograniczenia tych metod obejmują niską dokładność ilościową, krótki czas odczytu i niską przepustowość próbki. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy metodę, którą nazwaliśmy sekwencjonowaniem amplikonów wodorosiarczynowych (BSAS)16. Celem tej metody jest możliwość analizy docelowych regionów genomowych będących przedmiotem zainteresowania w dużej liczbie próbek z dużą dokładnością ilościową.

BSAS wykorzystuje elementy istniejących metod (konwersja wodorosiarczynu i specyficzna dla regionu amplifikacja PCR) i łączy je z prostą konstrukcją biblioteki nowej generacji (za pośrednictwem transposomów)17 i laboratoryjnym NGS18 (Rysunek 1). Podejście to zapewnia bardziej ilościową i bardziej przepustową metodę badania metylacji cytozyny w dowolnym regionie zainteresowania. W tym miejscu szczegółowo przedstawiamy metodę i opisujemy podejścia do rozwiązywania problemów i sprawdzania jakości procesu BSAS.

Protokół

1. Izolacja kwasów nukleinowych z tkanki

UWAGA: Wspólna izolacja DNA i RNA z tej samej próbki tkanki stwarza możliwość pobrania DNA do analizy epigenetycznej oraz powiązanego RNA do analizy ekspresji genów. Przedstawiony tutaj przykład jest formą oczyszczania kolumienkowego z tkanki eksperymentalnej, jednak w zależności od rodzaju próbki można zastosować alternatywne podejścia lub inne metody izolacji. Podstawowym wymogiem jest uzyskanie wysoko oczyszczonych kwasów nukleinowych, wolnych od zanieczyszczeń białkowych lub rozpuszczalników organicznych.

  1. Wybrać fragment świeżo zamrożonej lub świeżej tkanki do homogenizacji mechanicznej i umieścić go w lodzie. Przechowywać lub przenieść tkankę do probówki do mikrocentryfugi o okrągłym dnie o pojemności 2,0 ml.
  2. Do każdej probówki zawierającej tkankę dodać jedną stalową kuleczkę o średnicy 5 mm. Dodać odpowiednią ilość buforu lizującego, zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi liczby komórek lub masy tkanki.
  3. Zhomogenizować tkankę za pomocą mechanicznej homogenizacji w młynku kulkowym przy 30 Hz przez 30 s.
    UWAGA: Częstotliwość i czas homogenizacji mechanicznej zależą od rodzaju tkanki. Tkanki miękkie zostaną całkowicie zhomogenizowane przy zalecanych ustawieniach, natomiast tkanki twardsze wymagają optymalizacji ustawień.
  4. Przeprowadzić izolację DNA i RNA przy użyciu kolumienek spinowych z krzemionką w temperaturze pokojowej, zgodnie z protokołem producenta.
    1. Eluować RNA do 50 µl wody wolnej od RNaz i umieścić w lodzie. Wykorzystać RNA do analizy ekspresji mRNA metodą qPCR.
    2. Eluować DNA do 100 µl buforu TE. Powtórzyć eluowanie z kolumienki do DNA przy użyciu eluentu w celu zwiększenia stężenia i wydajności DNA. Wykorzystać DNA do ilościowego oznaczania metylacji celowanej.
  5. Ocenić jakość DNA i RNA za pomocą standardowego spektrofotometru, mierząc absorbancję przy 230 nm, 260 nm, 280 nm i 320 nm.
    UWAGA: Stosunek A260/A280 dla wysokiej jakości DNA powinien wynosić ~1,8-2. Stosunek A260/A280 dla wysokiej jakości RNA powinien wynosić ~2. Obecność nadmiarowej absorbancji przy 230 nm wskazuje na zanieczyszczenia pochodzące z procedury izolacji.
  6. Dalszą kontrolę jakości RNA przeprowadzić za pomocą chipa do elektroforezy kapilarnej zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Wysokiej jakości RNA będzie miała wskaźnik integralności RNA (RIN) >8. Obecność dodatkowych pików na elektroferogramie poza pikami rRNA wskazuje na zanieczyszczenie próbki.
  7. Ilościowo oznaczyć DNA i RNA za pomocą testu fluorescencyjnego zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Zastosowanie analizy fluorometrycznej jest bardziej czułe i specyficzne w oznaczaniu ilościowym kwasów nukleinowych niż sama spektrofotometria.
  8. Przechowywać wyizolowane DNA i RNA w temperaturze -80 °C.

2. Identyfikacja celu i projektowanie starterów

  1. Określić region(y) genomowe przeznaczone do analizy metodą BSAS w oparciu o odpowiednią sekwencję genomu referencyjnego. Promotory genów różnicowo wyrażonych są częstymi celami ilościowego oznaczania metylacji.
  2. Przygotować in silico referencyjny genom przekonwertowany bisulfitowo do późniejszego dopasowania odczytów sekwencjonowania poprzez zmodyfikowanie pliku sekwencji .fasta w edytorze tekstu. W orientacji 5’-3’ zastąpić cytosyny niebędące w kontekście CpG tyminami (Rycina 2).
  3. Zaprojektować zestawy starterów do amplifikacji regionów zainteresowania z DNA przekonwertowanego bisulfitowo.
    1. Wybrać i skopiować nieprzekonwertowany region zainteresowania w orientacji 5’-3’ do programu do projektowania starterów PCR specyficznych dla konwersji bisulfitowej (Rycina 3).
      UWAGA: Optymalna długość amplikonu w bisulfit-PCR wynosi 250-400 bp na amplikon, ponieważ traktowanie bisulfitami fragmentuje DNA i utrudnia amplifikację dużych regionów >400 bp. Jeśli regionem zainteresowania jest np. obszar o wielkości 1 kb, można zaprojektować wiele par starterów, aby pokryć ten region. Zaprojektować amplikony o tej samej wielkości w bp dla ułatwienia ich łączenia. Unikać amplikonów o długości <250 bp, ponieważ mogą one mieć niewystarczającą długość do generowania biblioteki. Optymalna długość startera dla BSAS to > 20 bp na starter.
    2. Wybrać zakres Tm od 55-65 °C oraz maksymalną różnicę Tm między starterem prawym a lewym wynoszącą 1-2 °C.
    3. Wybrać pary starterów, które najlepiej pokrywają region zainteresowania. Nie wybierać starterów zawierających miejsca CpG lub bezpośrednio przylegających do miejsc CpG, ponieważ spowoduje to błąd systematyczny w reakcjach PCR. Użyć standardowych starterów PCR, które można zamówić u wielu dostawców akademickich lub komercyjnych.
    4. Zrekonstytuować liofilizowane startery w wodzie wolnej od RNaz/DNaz do stężenia roboczego 100 µM.
  4. Przechowywać startery PCR w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć zapas startera o stężeniu 100 µM do stężenia roboczego 10 µM do reakcji PCR.

3. Optymalizacja specyficznej reakcji PCR z użyciem bisyulfitu

UWAGA: W celu konwersji bisulfitowej genomowego DNA dostępnych jest wiele różnych komercyjnych zestawów do konwersji bisulfitowej. Należy wybrać zestaw lub protokół, który najlepiej odpowiada planowanemu eksperymentowi.

  1. Należy użyć od 200 ng do 2 µg DNA genomicznego. W przypadku eksperymentów optymalizacyjnych należy przeprowadzić wiele reakcji konwersji, aby uzyskać wystarczającą ilość DNA konwertowanego pirosiarczynem do wielu reakcji BS-PCR.
  2. Należy stosować małe objętości eluowania (np. 10 µl) DNA konwertowanego pirosiarczynem, aby utrzymać wysokie stężenia DNA.
    UWAGA: 1-2 µl DNA konwertowanego pirosiarczynem jest wystarczające dla reakcji optymalizacyjnego PCR, jeśli do konwersji użyto 1 µg DNA genomicznego.
  3. Należy przeprowadzić amplifikację DNA konwertowanego pirosiarczynem za pomocą specyficznej reakcji BS-PCR. Reakcje BS-PCR wymagają użycia polimerazy Taq zdolnej do amplifikacji DNA konwertowanego pirosiarczynem.
    1. Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną w celu optymalizacji amplifikacji docelowej dla pojedynczego amplikonu. W przypadku wielu próbek reakcje należy przygotować na 96-dołkowej płytce PCR.
      25 µl buforu reakcyjnego 2x
      0.5 µl mieszaniny dNTP
      5 µl startera Forward 10 µM (stężenie końcowe 1 µM)
      5 µl startera Reverse 10 µM (stężenie końcowe 1 µM)
      2 µl matrycy w postaci DNA konwertowanego pirosiarczynem
      0.4 µl (5 U/µl) polimerazy DNA
      12.1 µl wody wolnej od DNaz (końcowa objętość reakcji 50 µl)
    2. Uszczelnić płytkę PCR odpowiednią folią samoprzylepną lub folią zgrzewaną termicznie.
    3. Umieścić reakcję w odpowiednim termocyklerze i zastosować następujące warunki cykliczne z podgrzewaną pokrywą:
      1. Przeprowadzić wstępną denaturację w 95 °C przez 10 min.
      2. Denaturować w 95 °C przez 30 s.
      3. Przeprowadzić przyłączanie przez 30 s w temperaturze Tm specyficznej dla używanych starterów. W reakcjach optymalizacyjnych należy zacząć od temperatury przyłączania o kilka °C niższej niż Tm startera.
        UWAGA: Optymalne temperatury przyłączania można również wyznaczyć za pomocą termocyklera z gradientem temperatury w celu przetestowania zakresu temperatur.
      4. Przeprowadzić elongację w 72 °C przez 30 s. W przypadku dłuższych amplikonów należy wydłużyć czas elongacji.
      5. Powtórzyć kroki 3.3.3.2-3.3.3.4 łącznie przez 35 cykli w ramach wstępnej optymalizacji. Może być konieczna większa liczba cykli, ale należy jej zazwyczaj unikać, aby zapobiec amplifikacjom klonalnym, które tworzą artefakty reakcji.
      6. Przeprowadzić końcową elongację w 72 °C przez 7 min.
      7. Przechowywać reakcje w 4 °C.
    4. Wizualizować amplikony za pomocą elektroforezy PAGE. Alternatywnie można zastosować chip do elektroforezy kapilarnej DNA zgodnie z protokołem producenta.
      1. Wymieszać 24 µl reakcji PCR z 6 µl barwnika do ładowania 5x w lodzie i wymieszać w wortexie.
      2. Przygotować 1 L buforu do elektroforezy TBE 1x, mieszając 200 ml buforu do elektroforezy TBE 5x i 800 ml ddH2O. Rozcieńczyć drabinę DNA do końcowego stężenia 0.5 µg na dołek w ddH2O i barwniku do ładowania.
      3. Napełnić dołki 30 µl reakcji PCR lub drabiny.
      4. Prowadzić elektroforezę przy 200 V przez ok. 45 min. Przerwać bieg żelu, gdy pierwszy front barwnika dotrze do końca żelu.
      5. Przebarwić żel bromkiem etydyny w stężeniu 5 µg/ml, mieszając 5 µl roztworu 10 mg/ml w 100 ml ddH2O. Przykryć cały żel i inkubować przez ok. 5 min.
      6. Wykonać obrazowanie żelu za pomocą kasetki UV lub imager'a multimodalnego przy długości fali wzbudzenia 482 nm.
      7. W odniesieniu do drabiny określić wielkość amplikonów PCR i ocenić specyficzność reakcji, sprawdzając obecność wielu prążków innych niż oczekiwana wielkość amplikonu (Rycina 4A i C).
    5. Po wyznaczeniu optymalnych warunków dla BS-PCR, przeprowadzić BS-PCR na próbkach eksperymentalnych.
      1. Oczyścić amplikony z pozostałych starterów i innych komponentów reakcji. Przeprowadzić oczyszczanie na kolumnie krzemionkowej, za pomocą kulek SPRI lub oczyszczanie w żelu i kwantyfikację.
      2. Eluować amplikony w 30 µl buforu TE.
      3. Zilozować amplikony za pomocą metody fluorometrycznej zgodnie z protokołami producenta.
      4. Jeśli w jednej próbce znajduje się wiele amplikonów, połączyć je w równych ilościach masy na objętość i przechowywać w -20 °C.

4. Przygotowanie biblioteki NGS i kontrola jakości biblioteki

UWAGA: Przygotowanie biblioteki NGS w metodzie BSAS wykorzystuje uproszczony protokół oparty na transposomach z podwójnym indeksowaniem (szczegóły dotyczące wyboru zestawu do przygotowania biblioteki znajdują się w liście materiałów). Metoda ta zapewnia niezwykle szybką i wysokoprzepustową drogę konstrukcji biblioteki, która została zwalidowana i wykazuje niewielkie lub żadne odchylenia w zastosowaniach sekwencjonowania z konwersją bisulfitową16,19. Podwójne indeksowanie umożliwia większy stopień multipleksowania próbek niż indeksowanie pojedyncze. Inne style przygotowania biblioteki mogą być możliwe, ale nie zostały przetestowane.

  1. Przygotować biblioteki NGS z amplikonów BS PCR w 96-dołkowej płytce PCR. Rozcieńczyć amplikony do stężenia 0,2 ng/µl, aby uzyskać końcową masę wejściową 1 ng (lub 5 µl rozcieńczenia 0,2 ng/µl). Przeprowadzić oczyszczanie wygenerowanych bibliotek przy użyciu kulek SPRI. Do izolacji bibliotek w ramach tego protokołu użyć od 50 do 90 µl kulek SPRI. Objętość kulek SPRI zależy od docelowego rozmiaru biblioteki oraz liczby cykli pożądanych reakcji sekwencjonowania.
    UWAGA: Do resuspensji kulek należy użyć wstrząsarki do mikropłytek lub wortexera do płytek.
    1. Eluować biblioteki z kulek, przenieść do nowej płytki 96-dołkowej i zamknąć folią do zgrzewania termicznego w celu przechowywania w temperaturze -20 °C.
  2. Wyznaczyć rozmiar i stężenie bibliotek (Rysunek 4B i D).
    1. Przeanalizować biblioteki na chipie do oznaczania rozmiaru DNA metodą elektroforezy kapilarnej zgodnie z protokołami producenta.
      1. Użyć wysokoczułego testu elektroforezy kapilarnej DNA w celu wyznaczenia średniego rozmiaru wykrytych pików biblioteki oraz szacunkowej molarności zgodnie z protokołami producenta.
    2. Ilościowo oznaczyć biblioteki metodą qPCR, stosując primery zaprojektowane przeciwko sekwencjom adapterów w wygenerowanych bibliotekach oraz standardy o znanym stężeniu.
      1. Przeprowadzić reakcje qPCR na urządzeniu do qPCR w czasie rzeczywistym, korzystając z ustawień ilościowania absolutnego zgodnie z protokołami producenta.
      2. Wykorzystać rozmiar bibliotek oraz ilościowanie molarne z qPCR do obliczenia stężeń molarnych bibliotek.
  3. Rozcieńczyć biblioteki do stężenia 4 nM, używając 10 mM Tris-Cl z 0,1% Tween-20 o pH 8,5. Przechowywać biblioteki w 96-dołkowej płytce PCR zamkniętej folią do zgrzewania termicznego w temperaturze -20 °C.

5. Przygotowywanie bibliotek do sekwencjonowania przy użyciu sekwenatora stołowego

  1. Rozmrozić i przygotować odczynniki zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Rozmrozić biblioteki o stężeniu 4 nM na lodzie.
  3. Przygotować 1 ml 0,2 N NaOH w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
  4. Połączyć biblioteki 4 nM w równych objętościach, jeśli używanych jest kilka bibliotek.
  5. Rozcieńczyć i zdenaturować połączone biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta do pożądanego końcowego stężenia molowego.
    1. Przechowywać rozcieńczoną i zdenaturowaną połączoną bibliotekę na lodzie do momentu załadowania do kartridża z odczynnikami.
  6. Utworzyć arkusz próbek zawierający nazwy próbek i odpowiadające im informacje o indeksach oraz określić generowanie wyłącznie plików .fastq.
    1. Wgrać arkusz próbek do odpowiedniego folderu z arkuszami próbek w sekwenatorze.
  7. Dodać łącznie 600 µl rozcieńczonej i zdenaturowanej biblioteki do odpowiedniego dołka w kartridżu z odczynnikami.
  8. Przeprowadzić reakcje sekwencjonowania do ich zakończenia.

6. Analiza danych ilościowych metylacji

UWAGA: Do analizy danych NGS dostępnych jest wiele programów, zarówno komercyjnych, jak i otwartoźródłowych. Szczegółowe informacje na temat uruchamiania programów znajdują się w dokumentacji każdego konkretnego pakietu. Ogólne instrukcje są podane w każdym kroku wraz ze specyficznymi poleceniami dla tego pakietu oprogramowania. (Szczegóły dotyczące oprogramowania użytego w tym protokole znajdują się w Liście Materiałów).

  1. Zaimportuj pliki .fastq.gz do odpowiedniego rurociągu analizy sekwencjonowania, zachowując wyniki jakości (Qscores) do przycięcia odczytów. (W tym programie przykładu wybierz „Import”, a następnie wybierz metodę sekwencjonowania użytą do generowania odczytów. Wybierz pliki odczytów .fastq.gz do importu i zachowaj Qscores z plików .fastq dla zastosowań przycinania odczytów, odznaczając opcję „Discard quality scores” w sekcji „General Options”. Wybierz lokalizację dla zaimportowanych odczytów i wybierz „Finish”.)
    1. Przytnij i zachowaj odczyty, korzystając z następujących ustawień w rurociągu analizy danych NGS. (W tym programie wybierz „Trim Sequences” w sekcji „NGS Core Tools”, a następnie wybierz odczyty do przycięcia.)
      1. Zachowaj tylko odczyty zawierające wyniki ≥ Q30. (W tym programie wybierz „Trim using quality scores” i ustaw limit na 0.001.)
      2. Zachowaj tylko odczyty zawierające ≤ 1 niejednoznaczny nukleotyd. (W tym programie wybierz „Trim ambiguous nucleotides” i ustaw „maximum number of ambiguities” na 1. Wybierz lokalizację zapisu przyciętych odczytów i wybierz „Finish”.)
    2. Zmapuj przycięte odczyty do referencyjnego genu przekonwertowanego metodą bisulfitową in silico z punktu 2.2. (W przykładowym oprogramowaniu wybierz „Map Reads to Reference” w sekcji „NGS Core Tools”. Wybierz przycięte odczyty do zmapowania i wybierz „next”. Wybierz przekonwertowaną sekwencję referencyjną i wybierz „no masking” w sekcji „reference masking”. Wybierz „next”.)
      1. Przypisz maksymalną karę za niedopasowania, insercje i delecje. Ustaw parametry tak, aby wymagane było zmapowanie 100% długości odczytu z 90% tożsamością sekwencji. W przykładowym oprogramowaniu przypisz wartość 3 dla niedopasowań, insercji i delecji. Przypisz wartość 1 dla minimalnej frakcji długości odczytu zmapowanej do referencji oraz wartość 0.9 dla minimalnej frakcji tożsamości między zmapowanym odczytem a referencją.
      2. Odrzuć lub zignoruj odczyty nieswoiste zmapowane do referencji. Odczyty te mogą mapować równie dobrze do wielu regionów. W przykładowym oprogramowaniu wybierz „Ignore” w sekcji „Non-specific match handling” i wybierz „next”.
      3. Dla wyników dopasowania wygeneruj każdą próbkę jako oddzielny plik. W przykładowym oprogramowaniu wybierz „Create stand-alone read mappings” w sekcji „Output options” oraz „Save” w sekcji „Result handling”. Wybierz lokalizację zapisu mapowania odczytów i wybierz „Finish”.
    3. Uruchom przepływ pracy wywoływania wariantów (variant calling) dla zmapowanych odczytów. W przykładowym oprogramowaniu wybierz „Probabilistic Variant Detection” w sekcji „Resequencing Analysis”, wybierz mapowanie odczytów do analizy i wybierz „next”. Wybierz „Ignore non-specific matches” w sekcji „Read filters” i wybierz „next”.
      1. Upewnij się, że sekwencja ma głębokość ≥ 1000 X, ustawiając „minimum coverage” w sekcji „Significance” na 1,000.
      2. Upewnij się, że wywołany wariant jest obecny zarówno w odczytach forward, jak i reverse. W przykładowym oprogramowaniu wybierz „Require presence in both forward and reverse stands” w sekcji „Variant filters” i wybierz „next”.
      3. Eksportuj dopasowane dane z wywołanymi wariantami jako tabelę z adnotacjami. W przykładowym oprogramowaniu wybierz „Create annotated table” w sekcji „Output options” i wybierz lokalizację zapisu pliku tabeli wariantów. Wybierz „Finish”.
  2. Oblicz procent 5-mC, korzystając z częstotliwości wariantów w adnotowanych miejscach CpG w interesującym regionie z pliku tabeli wariantów. Częstotliwość cytozyny w pozycji referencyjnej C w CG stanowi procent 5-mC.
    UWAGA: Przy użyciu algorytmów wywoływania wariantów dla silnie zmetylowanych CpG, zastąp cytozyny w CpG tyminami. Pozwoli to zidentyfikować zmapowane cytozyny jako warianty, co umożliwi wyznaczenie częstotliwości cytozyny w miejscach CpG.
  3. Wyznacz wydajność konwersji bisulfitowej (bsc), obliczając najpierw procent C nieznajdujących się w miejscach CpG w referencji (C). Pomnóż procent nie-CpG C przez całkowitą liczbę zmapowanych T (Tmp) i podziel przez całkowitą liczbę zmapowanych C w pozycjach referencyjnych T (CmpT). 100 minus obliczona częstotliwość to wydajność konwersji bisulfitowej (bsc) danej biblioteki (Równanie 1).

równanie bsc: \(bsc = 100 - \frac{(C \times Tmp)}{CmpT}\); formuła matematyczna i analiza.

Równanie 1. Wydajność konwersji pirosiarczynowej.
UWAGA: Podczas gdy genomy ssaków zawierają bardzo niskie ilości metylacji cytozyny poza miejscami CpG (z potencjalnym wyjątkiem komórek macierzystych20), genomy roślin zawierają ich znaczną ilość. Aby określić wydajność konwersji pirosiarczynowej w tych genomach referencyjnych, odpowiednią metodą jest sekwencjonowanie fragmentu genomu mitochondrialnego, genomu chloroplastowego lub znanych genów niemetylowanych obecnych w genomach roślin21 i obliczenie wydajności konwersji zgodnie z powyższym opisem. Wydajność konwersji pirosiarczynowej powinna wynosić ≥98% w większości przypadków, przy czym niekonwertowane C mogą wynikać z metylacji poza miejscami CpG.

Wyniki

BSAS prawidłowo dopasowane do przekonwertowanej sekwencji referencyjnej będą przypominać Rysunek 5. Dinukleotydy CpG można wyraźnie zidentyfikować, a stan metylacji można oszacować poprzez obserwację odczytów zasad w miejscach CpG w zmapowanych odczytach. Na przykład, w przypadku kontroli metylacji, 0% metylacji spowoduje, że wszystkie odczyty zmapowane do miejsc CpG będą zawierać T (Rysunek 5A). Kontrole 100% metylacji spowodują, że wszystkie zmapowane odczyty w miejscach CpG będą zawierać C (Rysunek 5B).

Ilościowe określenie częstotliwości występowania cytozyny (C/C+T) w miejscach CpG pozwala na wyznaczenie częstotliwości metylacji w pierwotnej próbce. Reprezentatywna krzywa wzorcowa wygenerowana z kontroli metylacji całego genomu (n = 3/stosunek metylacji) wykazuje liniowość oznaczania metylacji oraz precyzję pomiaru dla każdego stosunku metylacji (Rysunek 6). Jako przykład zastosowania tej metody w całości, RNA i DNA wyizolowano wspólnie z móżdżku oraz siatkówki myszy (n=4/grupa). Ekspresję rodopsyny, selektywnie wyrażanej w tkance siatkówki, zmierzono za pomocą qPCR. Ekspresję wykryto wyłącznie w siatkówce (Rysunek 7A). Za pomocą BSAS określono ilościowo poziomy metylacji CpG w regionie promotora rodopsyny. Skumulowane poziomy metylacji w całym regionie promotora wynosiły >80% w móżdżku w porównaniu do <15% w siatkówce (p < 0,001, parametryczny test t) (Rysunek 7B). Oznaczanie metylacji metodą BSAS pozwala na ilościową analizę metylacji w konkretnych miejscach, dzięki czemu poziomy metylacji mogą być porównywane w odniesieniu do konkretnych miejsc CpG w dowolnym regionie genomowym. Poziomy metylacji CpG w promotorze rodopsyny były znacząco wyższe w próbkach z móżdżku w porównaniu z próbkami z siatkówki (p <0,001, parametryczny test t dla każdego miejsca CpG) (Rysunek 7C).

Schemat sekwencjonowania z bisulfitami; konwersja genomowego DNA do analizy metylacji. Etapy PCR i tagmentacji.
Rysunek 1: Schemat metody BSAS.W tej metodzie genomowe DNA poddawane jest konwersji bisulfitowej w celu zamiany niezmetylowanych cytozyn w uracyle. Następnie, podczas reakcji PCR, uracyle te zostają zamienione na tyminy. Amplifikacja PCR jest skierowana na regiony zainteresowania, co pozwala na silne wzbogacenie wyłącznie tych sekwencji. Powstałe amplikony PCR są przekształcane w biblioteki z podwójnymi indeksami poprzez prosty proces tagmentacji. Następnie biblioteki są sekwencjonowane na nadblatowym sekwenatorze nowej generacji, a odczyty z sekwencjonowania są mapowane do konwertowanej in silico sekwencji referencyjnej, co pozwala na określenie procentowego poziomu metylacji cytozyn w sposób specyficzny dla poszczególnych zasad.

Schemat regionu chromosomalnego; analiza sekwencji DNA; konwersja cytozyn non-CpG do T; mapowanie genetyczne.
Rycina 2: In silico konwersja bisulfitowa regionu zainteresowania. Do konwersji bisulfitowej in silico można wybrać dowolny region zainteresowania z dowolnej referencyjnej sekwencji genomowej. Cytozyny non-CpG w sekwencji referencyjnej są zastępowane tyminami. Cytozyny CpG pozostają cytozynami w referencji poddanej konwersji bisulfitowej.

Schemat projektowania starterów do sekwencjonowania DNA przedstawiający prawidłowe i błędne rozmieszczenie starterów w obrębie miejsc CpG.
Rycina 3: Rozmieszczenie starterów. Startery do PCR po konwersji bisulfitowej projektuje się w oparciu o sekwencję referencyjną poddaną konwersji bisulfitowej in silico. Startery powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby nie nakładać się na dinukleotydy CG ani nie znajdować się bezpośrednio obok dinukleotydów CG.

Wyniki elektroforezy wraz z chromatogramami przedstawiające rozdział fragmentów DNA w parach zasad (bp).
Rycina 4: Przykłady amplikonów PCR oraz bibliotek sekwencyjnych o wysokiej i niskiej jakości. Reprezentatywne ślady elektroferogramu i żel pokazują (A) idealny amplikon do generowania biblioteki za pośrednictwem transposomu z pojedynczym produktem o wysokim stężeniu. (B) Biblioteka wygenerowana z tego amplikonu wykazuje wysokie stężenie i równomierny rozkład wielkości. (C) Niskiej jakości amplikony PCR mogą charakteryzować się małą wielkością, niskim stężeniem oraz zawierać wiele produktów i/lub dimery starterów. Takie niskiej jakości amplikony prowadzą do (D) niepowodzenia w generowaniu biblioteki, co objawia się niskim stężeniem i niskim rozkładem wielkości.

Wyrównanie sekwencji DNA, przedstawiające porównanie z referencją i analizę głębokości odczytów w formie wykresu.
Rycina 5: Przykłady wyników sekwencjonowania z kontroli metylacji. (A) In silico konwertowana sekwencja referencyjna z zaznaczonymi na czerwono miejscami CpG. Zmapowane odczyty z kontroli 0% metylacji dla wybranego regionu wykazują obecność tyminy (zaznaczenie zielone) w miejscach CpG. (B) Zmapowane odczyty z kontroli 100% metylacji wykazują obecność cytozyny (zaznaczenie niebieskie) w miejscach CpG.

Wykres korelacji procentowej 5-mC, schemat, analiza metylacji, dopasowanie danych, badanie epigenetyczne.
Rysunek 6: Ilościowe oznaczenie metylacji w zakresie kontroli metylacji. Kontrole metylacji całego genomu zmieszane w stosunkach metylacji (n = 3/stosunek) od 0% do 100% zostały poddane analizie ilościowej za pomocą BSAS. Wykres wartości oczekiwanych w stosunku do wyznaczonych ilościowo wykazuje liniowość oznaczeń kontroli metylacji. We wszystkich kontrolach odnotowano wysoką precyzję ilościowego oznaczenia metylacji.

Analiza ekspresji i metylacji genu Rho; wykresy pudełkowe ekspresji i 5-mC w móżdżku i siatkówce.
Rycina 7: Przykład sparowanej analizy metylacji DNA i ekspresji genów w próbkach tkanek. (A) Względna ekspresja mRNA rodopsyny w tkance móżdżku i siatkówki myszy. (B) Średnia metylacja promotora rodopsyny ilościowo określona metodą BSAS w DNA móżdżku i siatkówki (***p <0.001, parametryczny test t). C) Poziomy metylacji specyficzne dla miejsc CpG w obrębie promotora rodopsyny (-244 do +6 względem miejsca startu transkrypcji [TSS]) w DNA móżdżku i siatkówki myszy.

Dyskusja

BSAS pozwala na ukierunkowaną, dokładną kwantyfikację metylacji DNA z wysoką przepustowością zarówno w liczbie próbek, jak i liczbie celów. Dodatkowo, ta generacja biblioteki wykorzystująca znakowanie za pośrednictwem transposomów wymaga mniejszej ilości wejściowego DNA, jest szybsza i zawiera mniej kroków niż tradycyjne techniki ścinania i późniejszej ligacji adaptera. Te ulepszenia w stosunku do istniejących metod pozwalają na precyzyjną analizę metylacji DNA na poziomie podstawowym dowolnego celu będącego przedmiotem zainteresowania. Co więcej, BSAS zapewnia nową metodę potwierdzania regionów będących przedmiotem zainteresowania (regiony metylacji różnicowej (DMR), wyspy CpG, regiony regulacyjne), które zostały zidentyfikowane przy użyciu podejść wodorosiarczynu całego genomu22 lub wychwytywania23 . Stosowanie ortogonalnych podejść potwierdzających i bardziej precyzyjnych ilościowo metod poprawia rygor analityczny badań epigenomicznych. Wysoka głębokość odczytu osiągnięta za pomocą BSAS pozwala na dokładne określenie ilościowe w wąskim przedziale ufności, co skutkuje precyzyjnym oznaczaniem ilościowym16. Dodatkowo, możliwość przeprowadzenia wielu próbek w jednym eksperymencie może zwiększyć wielkość próby w celu potwierdzenia metod całego genomu, co zwiększy moc statystyczną; Jest to słabość wielu obecnych badań epigenetycznych. Co ważne, BSAS zapewnia kwantyfikację metylacji CpG specyficzną dla zasady, co pozwala na generowanie testowalnych hipotez do badań epigenetycznych. Hipotezy, takie jak zwiększona metylacja w określonym elemencie odpowiedzi, spowodują zmniejszone wiązanie określonego czynnika transkrypcyjnego. BSAS, w połączeniu ze sparowanymi danymi dotyczącymi ekspresji mRNA, zapewnia metodę uzyskiwania zarówno regulacji epigenetycznej, jak i ekspresji mRNA w pojedynczym fragmencie tkanki lub populacji komórek. Sparowane pomiary regulacji i ekspresji również zwiększają rygor naukowy i wpływ ustaleń.

Krytyczne kroki w ramach protokołu BSAS obejmują projektowanie starterów, optymalizację amplikonów i generowanie bibliotek/kontrolę jakości. Błąd systematyczny PCR jest wprowadzany, jeśli startery nie są prawidłowo zaprojektowane i amplifikują się z różną wydajnością8. Stosowanie wzorców metylacji, takich jak enzymatycznie generowane wzorce metylacji 100% i 0% cytozyny, może być wykorzystane do określenia stopnia, jeśli w ogóle, błędu kwantyfikacji metylacji i stanowi właściwą kontrolę metodologiczną przy ilościowym określaniu metylacji16. Podobnie należy zachować ostrożność podczas optymalizacji reakcji PCR w celu wytworzenia pojedynczego amplikonu wysokiej jakości. Jeśli amplikon nie jest obecny, zgodnie z sugerowanymi wytycznymi wyszczególnionymi w protokole, kroki optymalizacyjne obejmują zwiększenie liczby cykli PCR lub ilości wejściowej bsDNA. Jeśli istnieje wiele produktów PCR, w tym dimery starterów, kroki optymalizacji obejmują zmniejszenie ilości wejściowej bsDNA, zmniejszenie stężeń molowych startera PCR, zwiększenie temperatury wyżarzania lub zmniejszenie liczby cyklu PCR. Jedna lub kombinacja tych procedur optymalizacyjnych daje wyniki wystarczające do wygenerowania pojedynczego wzmacniacza wysokiej jakości. Alternatywnie, przeprojektowanie podkładów jest dobrym podejściem w przypadku zestawów podkładów, które nie dają ani jednego amplikonu. W tych regionach, w których przeprojektowanie nie jest odpowiednie lub możliwe, mogą działać zdegenerowane zestawy starterów, w tym zarówno cytozyna, jak i tymina w miejscach CpG w starterach do przodu oraz adenina i guanina w miejscach CpG w starterach odwrotnych. Jednak te zestawy starterów wymagają dalszej optymalizacji, aby upewnić się, że nie występuje błąd systematyczny PCR, co wykracza poza zakres tego protokołu. Wysokiej jakości biblioteki są niezwykle ważne dla osiągnięcia sukcesu. Upewnij się, że przeprowadzane są pomiary jakości w celu określenia rozmiaru, jakości i ilości bibliotek przed sekwencjonowaniem. Reakcje sekwencjonowania są podatne na niepowodzenia przy wprowadzaniu bibliotek o niskiej jakości. Błąd systematyczny w ilościowym oznaczaniu metylacji można złagodzić, upewniając się, że częstości metylacji są obecne zarówno w odczytach sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu. Ponadto wyniki jakości baz zgodnych z lokalizacjami CpG powinny wynosić ≥Q30, aby uzyskać wysoką pewność ilościową. Podczas gdy inni wykazywali wcześniej niewielkie lub żadne odchylenie w reakcjach znakowania DNA19 przekształconego w wodorosiarczyn, zapewnienie opisanych powyżej wskaźników pozwala na potwierdzenie kwantyfikacji metylacji o niskim odchyleniu.

BSAS obecnie mierzy metylację w miejscach CpG, jednak przyszłe rozszerzenia tej metody pozwolą na sparowane pomiary CpG 5-hmC z dodaniem etapów eksperymentalnych rozróżniających 5-mC i 5-hmC, takich jak wprowadzenie perrutenianu potasu przed konwersją wodorosiarczynu24. Zwiększy to wpływ narzędzia BSAS, umożliwiając sparowaną metylację, zarówno 5-mC, jak i 5-hmC, oraz dane dotyczące ekspresji w celu określenia regulacyjnych ról ekspresji genów metylacji DNA. Przygotowanie amplikonów PCR za pośrednictwem biblioteki za pośrednictwem transposomów powoduje zmniejszenie głębokości sekwencjonowania na końcach amplifikowanych regionów. W związku z tym regiony o dużym zainteresowaniu powinny być zaprojektowane tak, aby znajdowały się w środku amplikonów. Jednakże, ponieważ BSAS generuje sekwencjonowanie o głębokości odczytu >1,000 X, dokładność ilościowa pomiarów 5 mC w pobliżu końców amplifikowanych obszarów pozostaje wysoka.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Colleen Van Kirk za próbki siatkówki i móżdżku myszy oraz Peterowi Gregory'emu za wygenerowanie rysunku. Autorzy dziękują również dr Allison Gillaspy i Laboratorium Biologii Molekularnej i Cytometrii za dostęp do MiSeq. Praca ta była wspierana przez granty NIH DA029405, EY021716 i AG026607 oraz Fundację Donalda W. Reynoldsa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agilent 2100 BioanlyzerAgilentG29393AA
Zestaw Agilent RNA 6000 NanoAgilent5067-1511
Agilent Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Typhoon 9200Amersham/GE Healthcare Nauki przyrodnicze
Agencourt AMPure XP - Oczyszczanie PCRBeckman CoulterA638805 ml
PowerPac Basic Power SupplyBio Rad164-5050
twin.tech płytka PCR 96 Eppendorf951020362z półspódniczką
Eppendorf0030127838
Folia termozgrzewalnaEppendorf0030127854
Heat SealerEppendorf5390000.024
0,1-10 μ lKońcówki Eppendorf0030073.002
2-200 μ l KońcówkiEppendorf0030073.045
50-1,000 μ lKońcówki Eppendorf0030073.100
MixMate Eppendorf5353000.014
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlEppendorf0030121.023
Wirówka 5424Eppendorf5424000.010
Probówka do mikrowirówek 2,0 mlEppendorf022363352
Zestaw do przygotowania próbek DNA Nextera XTIlluminaFC-131-102424 rxn
Nextera XT Index KitIlluminaFC-131-100124 indeksy
MiSeq Desktop SequencerIllumina
MiSeq Zestaw odczynników v2IlluminaMS-102-2002300 cykli
KAPA SYBR FAST Uniwersalny zestaw qPCRKAPA BiosystemsKK4824
Zestaw do oznaczania dsDNA Quant-iT PicoGreenTechnologiesP7589
Zestaw do oznaczania RNA RiboGreen Quant-iTLife TechnologiesR11490
96-dołkowy system do PCR ProFlexLife Technologies4484075
Novex 6% żel DNA TBELife TechnologiesEC6261BOX10-dołkowy
system buforowy Novex TBE Running BufferLife TechnologiesLC66755x (1 l)
Novex Hi-Density TBE SampleBuffer TechnologiesLC66785x (10 ml)
1 Kb Plus Technologie żywotności drabinki DNA10787-018
Xcell SureLock Mini-CellLife TechnologiesEI0001
UltraPure 10 mg/ml Technologie życia bromku etydyny15585-011
7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymLife Technologies4329001384-dołkowy blok
DynaMag-96 Side SkirtedLife Technologies12027
SpectroMax M2 wielomodowy Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularne/VWR89429-532
AllPrep DNA/RNA Mini zestawQiagen80204
Koraliki ze stali nierdzewnejQiagen699895 mm
CLC Genomics WorkbenchQiagenOprogramowanie do rurociągu metylacji
QIAQuick PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen2810450 rxn
TissueLyser IIRetsch/Qiagen85300
Woda bez nukleazSigmaW4502
TRIS chlorowodorekSigmaPHG0002-100G
Tween-20SigmaP9416-50ML
NanoDrop 2000Thermo Scientific
384-dołkowa płyta z pełną spódnicą, standardThermo ScientificAB-1384
Absolutna pieczęć qPCRThermo ScientificAB-1170
EZ DNA Zestaw do metylacji-błyskawicyZymo ResearchD503050 rxn
ZymoTaq Polimeraza DNAZymo ResearchE200150 rxn
folia termozgrzewalna Life

Bibliografia

  1. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
  2. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
  3. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
  4. Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
  5. Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
  6. Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
  7. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
  8. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
  9. Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
  10. Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
  11. Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
  12. Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
  13. Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
  14. Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
  15. Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
  16. Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33(2013).
  17. Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
  18. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341(2012).
  19. Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
  20. Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
  21. Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39(2011).
  22. Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
  23. Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72(2013).
  24. Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie amplikonów po konwersji siarczynowejilościowe oznaczanie metylacji CpGamplifikacja celowanakonstrukcja bibliotekiprzygotowanie biblioteki NGSdopasowanie odczytówwyznaczanie wariantów
Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.