Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Podsumowanie

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Streszczenie

Rola procesów epigenetycznych w kontroli ekspresji genów jest znana od wielu lat. Metylacja DNA na resztach cytozyny jest szczególnie interesująca w badaniach epigenetycznych, ponieważ wykazano, że jest ona zarówno długotrwałym, jak i dynamicznym regulatorem ekspresji genów. Wysiłki mające na celu zbadanie zmian epigenetycznych w zdrowiu i chorobie są utrudnione przez brak metod o wysokiej przepustowości i dokładności ilościowej. Wraz z pojawieniem się i popularyzacją technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), narzędzia te są obecnie stosowane w epigenomice jako dodatek do istniejących metodologii genomicznych i transkryptomicznych. Do badań epigenetycznych metylacji cytozyny, w których zidentyfikowano obszary zainteresowania, takie jak określone promotory genów lub wyspy CpG, i istnieje potrzeba zbadania znacznej liczby próbek z dużą dokładnością ilościową, opracowaliśmy metodę zwaną sekwencjonowaniem amplikonów wodorosiarczynowych (BSAS). Metoda ta łączy konwersję wodorosiarczynu z ukierunkowaną amplifikacją obszarów zainteresowania, budową biblioteki za pośrednictwem transposomów i laboratoryjnym NGS. BSAS oferuje szybką i wydajną metodę analizy do 10 kb docelowych regionów w maksymalnie 96 próbkach jednocześnie, która może być wykonywana przez większość grup badawczych posiadających podstawowe umiejętności w zakresie biologii molekularnej. Wyniki zapewniają bezwzględną ilościową ocenę metylacji cytozyny ze swoistością zasadową. BSAS można zastosować do dowolnego regionu genomu z dowolnego źródła DNA. Metoda ta jest przydatna do testowania hipotez w docelowych regionach zainteresowania, a także do potwierdzania regionów zidentyfikowanych w analizach metylacji całego genomu, takich jak sekwencjonowanie wodorosiarczynów całego genomu, sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji i sekwencjonowanie immunoprecypitacji metylowanego DNA.

Wprowadzenie

Minęło ponad pół wieku od pierwszego doniesienia o naturalnie występujących modyfikacjach DNA w postaci metylacji cytozyny¹. Metylacja cytozyny to zmodyfikowana zasada nukleotydowa cytozyny, w której^piąty węgiel na pierścieniu zasadowym ma grupę metylową (5-mC), najczęściej występującą w motywie dinukleotydowym CpG w genomach ssaków. Funkcjonalna obecność 5-mC w promotorach genów jest na ogół związana z represją transkrypcji, podczas gdy brak jest związany z aktywnością transkrypcyjną².

Ogromny postęp został osiągnięty w naszym zrozumieniu roli metylacji DNA w rozwoju³, transgeneracyjnym rozprzestrzenianiu profili epigenetycznych⁴, patogenezie raka^5,6 i wielu innych obszarach badawczych. Wiele z tych postępów nastąpiło w ciągu ostatnich kilku lat, gdy opracowano nowe metodologie profilowania metylacji DNA⁷. Wraz z pojawieniem się i popularyzacją technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) istnieje obecnie wiele metod profilowania metylacji DNA w całym genomie lub dużych regionach genomu⁸. Podejścia te otwierają możliwość badań odkrywczych, które określają ilościowo wzorce metylacji DNA i różnice w metylacji DNA. Oprócz tych podejść generujących hipotezy, istnieje znaczne zapotrzebowanie na metody ilościowego testowania metylacji DNA w oparciu o hipotezy.

Pirosekwencjonowanie, PCR specyficzny dla metylacji i bezpośrednie sekwencjonowanie Sangera DNA przekształconego w wodorosiarczyn były najczęściej stosowanymi metodami analizy docelowych regionów (tj. regionu promotorowego pojedynczego genu lub wyspy CpG)^9-12. Wszystkie te metody opierają się na konwersji wodorosiarczynów, chemicznej reakcji deaminacji, w której niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, podczas gdy metylowane cytozyny pozostają nienaruszone^13,14. Amplifikacja PCR DNA przekształconego w wodorosiarczyn powoduje zastąpienie uracylu tyminą¹⁵, co pozwala na odczytanie metylacji różnicowej jako różnicy zasad. Chociaż są one bardzo przydatne, ograniczenia tych metod obejmują niską dokładność ilościową, krótki czas odczytu i niską przepustowość próbki. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy metodę, którą nazwaliśmy sekwencjonowaniem amplikonów wodorosiarczynowych (BSAS)¹⁶. Celem tej metody jest możliwość analizy docelowych regionów genomowych będących przedmiotem zainteresowania w dużej liczbie próbek z dużą dokładnością ilościową.

BSAS wykorzystuje elementy istniejących metod (konwersja wodorosiarczynu i specyficzna dla regionu amplifikacja PCR) i łączy je z prostą konstrukcją biblioteki nowej generacji (za pośrednictwem transposomów)¹⁷ i laboratoryjnym NGS¹⁸ (Rysunek 1). Podejście to zapewnia bardziej ilościową i bardziej przepustową metodę badania metylacji cytozyny w dowolnym regionie zainteresowania. W tym miejscu szczegółowo przedstawiamy metodę i opisujemy podejścia do rozwiązywania problemów i sprawdzania jakości procesu BSAS.

Protokół

1. Izolacja kwasu nukleinowego z tkanki

UWAGA: Koizolacja DNA i RNA z tej samej próbki tkanki daje możliwość pobrania DNA do analizy epigenetycznej i sparowanego RNA do analizy ekspresji genów. Podany tutaj przykład jest formą oczyszczania kolumnowego z tkanki doświadczalnej, ale można zastosować alternatywne podejścia dla różnych typów próbek lub inne metody izolacji. Podstawowym wymaganiem jest wysoce oczyszczony kwas nukleinowy bez zanieczyszczania białka lub rozpuszczalników organicznych.

1. Wybierz kawałek świeżo zamrożonej lub świeżej tkanki do mechanicznej homogenizacji i umieść na lodzie. Przechowywać lub przenieść tkankę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml z okrągłym dnem.
2. Dodaj jeden koralik ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm do każdej probówki zawierającej chusteczkę. Dodaj odpowiednią ilość buforu do lizy, w oparciu o sugestie producenta dotyczące liczby komórek lub masy tkanki.
3. Homogenizować tkankę za pomocą mechanicznej homogenizacji młyna perełkowego przy 30 Hz przez 30 sek.
   UWAGA: Częstotliwość i czas trwania homogenizacji mechanicznej zależy od typu tkanki. Bardziej miękkie tkanki ulegną całkowitej homogenizacji przy użyciu zalecanych ustawień, podczas gdy twardsze tkanki wymagają optymalizacji ustawień.
4. Przeprowadzić izolację DNA i RNA za pomocą krzemionkowych kolumn wirowych w temperaturze pokojowej zgodnie z protokołem producenta.
   1. Rozpuść RNA w 50 μl wody wolnej od RNaz i umieść na lodzie. Użyj RNA do analizy ekspresji mRNA za pomocą qPCR.
   2. Eluować DNA w 100 μl buforu TE. Powtórzyć elucję z kolumny DNA przy użyciu eluentu w celu zwiększenia stężenia DNA i wydajności. Użyj DNA do ukierunkowanej kwantyfikacji metylacji.
5. Ocenić jakość DNA i RNA za pomocą standardowego spektrofotometru pod kątem absorbancji przy 230 nm, 260 nm, 280 nm i 320 nm.
   UWAGA: Stosunek A260/A280 powinien wynosić ~1,8-2, aby uzyskać wysoką jakość DNA. Stosunek A260/A280 powinien wynosić ~2 dla wysokiej jakości RNA. Obecność nadmiernej absorpcji przy długości fali 230 nm wskazuje na zanieczyszczenia powstałe w wyniku procedury izolacji.
6. Dalsza kontrola jakości RNA za pomocą chipa do elektroforezy kapilarnej zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Wysokiej jakości RNA będzie miało numer integralności RNA (RIN) >8. Obecność dodatkowych pików w elektroferogramie oprócz pików rRNA wskazuje na zanieczyszczenie próbki.
7. Określ ilościowo DNA i RNA za pomocą testu fluorescencyjnego zgodnie z protokołem producenta.
   UWAGA: Użycie testu fluorometrycznego jest bardziej czułe i specyficzne do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych niż sama spektrofotometria.
8. Przechowywać wyizolowane DNA i RNA w temperaturze -80 °C.

2. Identyfikacja celu i projekt podkładu

1. Określ region genomowy będący przedmiotem zainteresowania, który ma być analizowany przez BSAS w oparciu o odpowiednią referencyjną sekwencję genomu. Promotory genów o zróżnicowanej ekspresji są częstymi celami ilościowego oznaczania metylacji.
2. Przygotuj genom referencyjny przekształcony in silico wodorosiarczynem w celu późniejszego wyrównania odczytów sekwencjonowania, zmieniając plik sekwencji .fasta w edytorze tekstu. W orientacji 5'-3' zastąp cytozynę inną niż CpG cytozyną tyminy (ryc. 2).
3. Zaprojektuj zestawy starterów do amplifikacji obszarów zainteresowania z DNA przekształconego w wodorosiarczyn.
   1. Wybierz i skopiuj nieprzekształcony obszar zainteresowania w orientacji 5'-3' do programu do projektowania startera PCR specyficznego dla wodorosiarczynu (Rysunek 3).
      UWAGA: Optymalna długość amplikonu bisulfit-PCR wynosi 250-400 pz na amplikon, ponieważ traktowanie wodorosiarczynem fragmentuje DNA i trudno jest amplifikować duże regiony >400 pz. Jeśli, na przykład, interesujący jest obszar o wielkości 1 kb, można zaprojektować wiele par starterów, aby pokryć ten obszar. Zaprojektuj amplikony tak, aby miały równą wielkość bp, aby ułatwić łączenie. Unikaj długości amplikonów <250 bp, ponieważ mogą one być niewystarczające do wygenerowania biblioteki. Optymalna długość gruntu dla BSAS wynosi > 20 pz na grunt.
   2. Wybierz zakres T_m 55-65 °C i maksymalną różnicę T_m między starterami do przodu i do tyłu 1-2 °C.
   3. Wybierz pary starterów, które najlepiej pokrywają obszar zainteresowania. Nie wybieraj starterów, które zawierają miejsca CpG lub bezpośrednio przylegają do miejsc CpG, ponieważ spowoduje to stronniczość w reakcjach PCR. Używaj standardowych starterów PCR, które można zamówić u dowolnej liczby dostawców akademickich lub komercyjnych.
   4. Rozpuść liofilizowane startery w wodzie wolnej od RNaz/DNaz w zapasie roboczym 100 μM.
4. Startery PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć 100 μM startera do 10 μM materiału roboczego do reakcji PCR.

3. Optymalizacja PCR specyficzna dla wodorosiarczynu

UWAGA: Do konwersji wodorosiarczynu genomowego DNA dostępnych jest wiele różnych komercyjnych zestawów do konwersji wodorosiarczynu. Wybierz zestaw lub protokół, który najlepiej pasuje do planowanego eksperymentu.

1. Użyj od 200 ng do 2 μg genomowego DNA. W przypadku eksperymentów optymalizacyjnych należy przeprowadzić wiele reakcji konwersji, aby uzyskać wystarczającą ilość DNA przekształconego w wodorosiarczyn dla wielu reakcji BS PCR.
2. Stosować małe (np. 10 μl) objętości elucji DNA przekształconego w wodorosiarczyn w celu utrzymania wysokich stężeń DNA.
   UWAGA: 1-2 μl DNA przekształconego w wodorosiarczyn jest wystarczające do optymalizacji reakcji PCR, jeśli 1 μg genomowego DNA użyto do wprowadzenia konwersji.
3. Amplifikacja DNA przekształconego w wodorosiarczyn za pomocą PCR specyficznego dla wodorosiarczynu. Reakcje BS-PCR wymagają użycia polimerazy Taq zdolnej do amplifikacji DNA przekształconego w wodorosiarczyn.
   1. Zmontuj następującą reakcję w celu optymalizacji docelowego amplifikacji pojedynczego amplikonu. W przypadku wielu próbek należy zebrać reakcje na 96-dołkowej płytce do PCR.
      25 μl 2x bufor reakcyjny
      0,5 μl dNTP Mix
      5 μl 10 μM Podkład wstępny (Final 1 μM)
      5 μl 10 μM Podkład odwrócony (Final 1 μM)
      2 μl matrycy wodorosiarczynu przekształconego w DNA
      0,4 μl (5 U/μl) polimerazy DNA
      12,1 μl wody wolnej od DNaz (Końcowa objętość reakcyjna: 50 μl)
   2. Uszczelnij płytkę PCR odpowiednim klejem lub folią zgrzewaną.
   3. Umieść reakcję w odpowiednim termocyklerze i zastosuj następujące warunki cykliczne z podgrzewaną pokrywą:
      1. Przeprowadzić wstępną denaturację w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
      2. denaturacja w temperaturze 95 °C przez 30 sek.
      3. Wyżarzanie przez 30 sekund przy określonym T_m używanych podkładów. Rozpocząć od temperatury wyżarzania kilka °C poniżej T_m startera w celu optymalizacji reakcji.
         UWAGA: Najlepsze temperatury wyżarzania można również określić za pomocą gradientowego termocyklera do testowania zakresu temperatur.
      4. Wykonać przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 sek. Wydłuż czas przedłużenia dla dłuższych amplikonów.
      5. Powtórz kroki 3.3.3.2-3.3.3.4 dla łącznie 35 cykli w celu wstępnej optymalizacji. Wyższe liczby cykli mogą być konieczne, ale generalnie należy ich unikać, aby zapobiec amplifikacjom klonalnym, które stworzą artefakty reakcji.
      6. Wykonać końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 minut.
      7. Reakcje utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   4. Wizualizacja amplikonów za pomocą elektroforezy PAGE. Alternatywnie można użyć chipa DNA do elektroforezy kapilarnej zgodnie z protokołem producenta.
      1. Wymieszaj 24 μl reakcji PCR z 6 μl 5-krotnego barwnika ładującego na lodzie i wiruj.
      2. Przygotować 1 l 1x buforu do biegania TBE, mieszając 200 ml 5x buforu do biegania TBE i 800 ml ddH₂O. Rozcieńczyć drabinkę DNA do końcowego stężenia 0,5 μg na studzienkę w ddH₂O i obciążając barwnik.
      3. Załaduj studzienki 30 μl reakcji PCR lub drabiną.
      4. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez ~45 min. Zatrzymaj przebieg żelu, gdy pierwszy czoło barwnika dotrze do końca żelu.
      5. Wybarwić żel 5 μg/ml bromku etydyny, mieszając 5 μl 10 mg/ml w 100 ml ddH₂O. Przykryj cały żel i pozostaw do inkubacji na ~ 5 min.
      6. Zobrazuj żel za pomocą lampy UV lub multimodalnego imagera o długości fali wzbudzenia 482 nm.
      7. W odniesieniu do drabinki należy zwymiarować amplikony PCR i określić specyficzność reakcji, szukając wielu prążków innych niż oczekiwany rozmiar amplikonu (ryc. 4A i C).
   5. Po określeniu optymalnych warunków dla BS-PCR należy przeprowadzić BS-PCR na próbkach eksperymentalnych.
      1. Oczyść amplikony z pozostałych starterów i innych składników reakcji. Wykonaj oczyszczanie kolumny krzemionkowej, kulkę SPRI lub czyszczenie i kwantyfikację na bazie żelu.
      2. Elute amplikony w 30 μl buforu TE.
      3. Określ ilościowo amplikony za pomocą testu fluorometrycznego przy użyciu protokołów producenta.
      4. Jeżeli w próbce znajduje się wiele amplikonów, należy je połączyć w równych ilościach wagowych na objętość i przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Przygotowanie biblioteki NGS i kontrola jakości biblioteki

UWAGA: Przygotowanie biblioteki BSAS NGS wykorzystuje uproszczony protokół za pośrednictwem transposomów z podwójnym indeksowaniem (zobacz Listę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wyboru zestawu do przygotowania biblioteki). Metoda ta zapewnia niezwykle szybką i wysokoprzepustową drogę do budowy biblioteki, która została zweryfikowana i wykazuje niewielkie lub żadne odchylenie w zastosowaniach sekwencjonowania wodorosiarczynu^16,19. Podwójne indeksowanie pozwala na wyższe multipleksowanie próbek niż indeksowanie pojedyncze. Inne style przygotowania biblioteki mogą być możliwe, ale nie zostały przetestowane.

1. Przygotuj biblioteki NGS z amplikonów BS PCR na 96-dołkowej płytce PCR. Rozcieńczyć amplikony do 0,2 ng/μl, aby uzyskać końcową masę wejściową 1 ng lub 5 μl rozcieńczenia 0,2 ng/μl. Wykonaj czyszczenie wygenerowanych bibliotek za pomocą koralików SPRI. Użyj koralików SPRI o pojemności 50-90 μl do izolowania bibliotek za pomocą tego protokołu. Objętość kulek SPRI zależy od docelowej wielkości biblioteki i liczby cykli pożądanych reakcji sekwencjonowania.
   UWAGA: Użyj wytrząsarki do mikropłytek lub wirówki do ponownego zawieszenia kulek.
   1. Usunąć biblioteki z kulek i przenieść na nową płytkę 96-dołkową i zamknąć folią termozgrzewalną do przechowywania w temperaturze -20 °C.
2. Określ rozmiar i koncentrację bibliotek (Rysunek 4B i D).
   1. Uruchom biblioteki na chipie do wymiarowania DNA do elektroforezy kapilarnej zgodnie z protokołami producenta.
      1. Użyj testu DNA elektroforezy kapilarnej o wysokiej czułości, aby określić średnią wielkość wykrytych pików biblioteki i oszacować molowość zgodnie z protokołami producenta.
   2. Określ ilościowo biblioteki metodą qPCR, używając starterów zaprojektowanych względem sekwencji adaptera w wygenerowanych bibliotekach i użyj standardów o znanym stężeniu.
      1. Przeprowadzaj reakcje qPCR na instrumencie w czasie rzeczywistym, korzystając z bezwzględnych ustawień ilościowych zgodnie z protokołami producenta.
      2. Użyj rozmiaru bibliotek i kwantyfikacji molowej z qPCR, aby obliczyć stężenia molowe bibliotek.
3. Rozcieńczyć biblioteki do 4 nM za pomocą 10 mM Tris-Cl z 0,1% Tween-20 przy pH 8,5. Przechowuj biblioteki w 96-dołkowej płytce PCR zamkniętej folią termozgrzewalną w temperaturze -20 °C.

5. Biblioteki sekwencjonowania za pomocą sekwencera laboratoryjnego

1. Rozmrozić i przygotować odczynniki zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Rozmrozić biblioteki 4 nM na lodzie.
3. Przygotować 1 ml 0,2 N NaOH w 1,5 ml probówce do mikrowirówki.
4. Pula 4 nM bibliotek w równych ilościach, jeśli ma być używanych wiele bibliotek
.
5. Rozcieńczyć i zdenaturować połączone biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta do pożądanego końcowego stężenia molowego.
   1. Przechowuj rozcieńczoną i denaturowaną bibliotekę na lodzie, aż będzie gotowa do załadowania do wkładu z odczynnikiem.
6. Wygeneruj przykładowy arkusz zawierający nazwy próbek i odpowiadające im informacje o indeksie, a następnie określ, aby generować tylko pliki .fastq.
   1. Załaduj arkusz próbki do odpowiedniego folderu arkuszy próbek w sekwencerze.
7. Dodać łącznie 600 μl rozcieńczonej i zdenaturowanej biblioteki do wkładu z odczynnikiem w odpowiednim dołku.
8. Uruchom reakcje sekwencjonowania do zakończenia.

6. Analiza ilościowa metylacji

UWAGA: Dostępnych jest wiele programów do analizy danych NGS, zarówno komercyjnych, jak i open source. Szczegółowe informacje na temat uruchomionych programów można znaleźć przy każdym konkretnym pakiecie. Na każdym kroku znajdują się ogólne instrukcje wraz z konkretnymi poleceniami dla tego pakietu oprogramowania. (Patrz Lista materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat oprogramowania używanego w tym protokole).

1. Importuj pliki .fastq.gz do odpowiedniego potoku analizy sekwencjonowania, zachowując wyniki jakości (Qscores) do użycia w przycinaniu odczytu. (W tym przykładzie programu wybierz "Importuj" i wybierz metodę sekwencjonowania używaną do generowania odczytów. Wybierz .fastq.gz odczytane pliki do zaimportowania i zachowaj Qscores z plików .fastq dla aplikacji do przycinania odczytu, usuwając zaznaczenie opcji "Odrzuć wyniki jakości" w "Opcjach ogólnych". Wybierz lokalizację importowanych odczytów i wybierz opcję "Zakończ".)
   1. Przycinanie i zachowywanie odczytów przy użyciu następujących ustawień w potoku analizy danych NGS. (Dla tego programu wybierz "Sekwencje przycinania" w sekcji "NGS Core Tools" i wybierz odczyty do przycięcia.)
      1. Zachowaj tylko odczyty zawierające wyniki ≥ Q30. (Dla tego programu wybierz opcję "Przycinaj przy użyciu wyników jakości" i ustaw limit na 0,001).
      2. Zachowaj tylko odczyty zawierające ≤ 1 niejednoznaczny nukleotyd. (Dla tego programu wybierz 'Przytnij niejednoznaczne nukleotydy' i ustaw 'maksymalną liczbę niejednoznaczności' na 1. Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać przycięte odczyty, i wybierz opcję "Zakończ".)
   2. Przycięta mapa odczytuje odniesienie do genu przekształconego w wodorosiarczyn in silico z 2.2. (W przypadku przykładowego oprogramowania wybierz opcję "Mapa odczytuje odniesienie" w sekcji "Podstawowe narzędzia NGS". Wybierz przycięte odczyty do zmapowania i wybierz "dalej". Wybierz przekonwertowaną sekwencję odwołań i wybierz opcję "bez maskowania" w sekcji "maskowanie odwołań". Wybierz "Dalej".)
      1. Przypisz maksymalną karę za niezgodności, wstawienia i usunięcia. Ustaw parametry tak, aby 100% długości odczytu było wymagane do mapowania z 90% tożsamością sekwencji. Na przykład oprogramowanie przypisz wynik 3 za niezgodności, wstawienia i usunięcia. Przypisz wynik 1 dla minimalnego ułamka długości odczytu zamapowanego na odwołanie i przypisz wynik 0,9 dla minimalnego ułamka tożsamości między zamapowanym odczytem a odwołaniem.
      2. Odrzuć lub zignoruj niespecyficzne odczyty mapowane na odwołanie. Te odczyty mogą być równie dobrze mapowane na wiele regionów. Na przykład oprogramowanie wybierz "Ignoruj" w sekcji "Obsługa meczów niespecyficznych" i wybierz "Dalej".
      3. W celu wyrównania wygeneruj każdą próbkę jako niezależny plik. Na przykład oprogramowanie wybierz opcję "Utwórz autonomiczne mapowania odczytu" w sekcji "Opcje wyjściowe" i "Zapisz" w sekcji "Obsługa wyników". Wybierz lokalizację, aby zapisać odczytane mapowanie i wybierz opcję "Zakończ".
   3. Uruchom przepływ pracy wywoływania wariantu na zamapowanych odczytach. W przypadku przykładowego oprogramowania wybierz opcję "Probabilistic Variant Detection" w sekcji "Resequencing Analysis", wybierz mapowanie odczytu, które ma być analizowane, i wybierz "Dalej". Wybierz "Ignoruj nieokreślone dopasowania" w sekcji "Filtry odczytu" i wybierz "Dalej".
      1. Upewnij się, że sekwencja znajduje się na głębokości ≥ 1000 razy, ustawiając "minimalne pokrycie" w polu "Istotność" na 1,000.
      2. Upewnij się, że wywołanie wariantu jest obecne zarówno w odczytach do przodu, jak i do tyłu. Na przykład oprogramowanie wybierz opcję "Wymagaj obecności zarówno na stanowisku dziobowym, jak i tylnym" w sekcji "Filtry wariantów" i wybierz opcję "Dalej".
      3. Eksportuj wyrównane, wariantowe dane o nazwie jako tabelę z adnotacjami. Na przykład oprogramowanie wybierz opcję "Utwórz tabelę z adnotacjami" w sekcji "Opcje wyjściowe" i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik tabeli wariantów. Wybierz opcję "Zakończ".
2. Oblicz wartość procentową 5 mC, korzystając z częstości wariantów w oznaczonych adnotacjach witrynach CpG w regionie zainteresowania z pliku tabeli wariantów. Częstość cytozyny przy referencyjnym C w CG wynosi procent 5 mC.
   UWAGA: W przypadku korzystania z algorytmów wywoływania wariantów dla silnie zmetylowanych CpG, zastąp cytozyny CpG tyminami. To zidentyfikuje zmapowaną cytozynę jako warianty, co spowoduje częstość cytozyny na poziomie CpG.
3. Określ sprawność konwersji wodorosiarczynu (bsc), najpierw obliczając procent C niewystępujących w miejscach CpG w odniesieniu (C). Pomnóż procent C innych niż CpG przez liczbę całkowitych zmapowanych T (T_mp) i podziel przez całkowitą liczbę C zmapowanych w referencyjnych T (C_mpT). 100 minus obliczona częstotliwość to sprawność konwersji wodorosiarczynu (bsc) tej biblioteki (równanie 1).

Równanie 1. Wydajność konwersji wodorosiarczynu.
UWAGA: Podczas gdy genomy ssaków zawierają bardzo małe ilości metylacji cytozyny innej niż CpG (z wyjątkiem potencjalnie komórek macierzystych²⁰), genomy roślinne zawierają znaczną ilość. W celu określenia wydajności konwersji wodorosiarczynu w tych genomach referencyjnych, odpowiednią drogą jest sekwencjonowanie części genomu mitochondrialnego lub genomu chloroplastów lub znanych niemetylowanych genów obecnych w genomach roślinnych²¹ i obliczenie wydajności konwersji, jak opisano powyżej. Sprawność konwersji wodorosiarczynu powinna wynosić ≥98% w większości przypadków, przy czym nieprzekształcone C mogą powstać w wyniku metylacji bez CpG.

Wyniki

BSAS odczytuje prawidłowo wyrównane do przekształconej sekwencji referencyjnej, co będzie przypominać rysunek 5. Dinukleotydy CpG można wyraźnie zidentyfikować, a stany metylacji można oszacować, obserwując wywołania bazowe w miejscach CpG w zmapowanych odczytach. Na przykład w przypadku kontroli metylacji metylacja 0% spowoduje, że wszystkie odczyty zostaną zmapowane na miejsca CpG zawierające T (rysunek 5A). 100% kontrola metylacji spowoduje, że wszystkie odczyty zostaną zmapowane na miejsca CpG zawierające C (rysunek 5B).

Ilościowe określenie częstości cytozyny (C/C+T) w miejscach CpG daje częstotliwość metylacji w oryginalnej próbce. Reprezentatywna krzywa standardowa wygenerowana z kontroli metylacji całego genomu (n = 3/stosunek metylacji) pokazuje liniowość kwantyfikacji metylacji, a także precyzję kwantyfikacji przy każdym stosunku metylacji (ryc. 6). Jako przykład tej metody w sumie, RNA i DNA zostały jednocześnie wyizolowane z móżdżku i siatkówki myszy (n=4/grupa). Ekspresję rodopsyny, selektywnie wyrażaną w tkance siatkówki, mierzono za pomocą qPCR. Ekspresję wykryto tylko w siatkówce (ryc. 7A). Za pomocą BSAS określono ilościowo poziomy metylacji CpG w regionie promotora rodopsyny. Skumulowane poziomy metylacji w całym regionie promotora wynosiły >80% w móżdżku w porównaniu do <15% w siatkówce (p < 0,001, parametryczny test t) (Figura 7B). Kwantyfikacja metylacji BSAS czerpie korzyści z kwantyfikacji metylacji specyficznej dla miejsca, a poziomy metylacji można porównywać na podstawie specyficznej dla CpG w dowolnym regionie genomu. Poziomy metylacji CpG w promotorze rodopsyny były znacznie wyższe w próbkach móżdżku w porównaniu z próbkami siatkówki (p <0,001, parametryczny test t w każdym miejscu CpG) (Figura 7C).

Rysunek 1: Schemat metody BSAS. W tej metodzie genomowe DNA jest przekształcane w wodorosiarczyn w celu modyfikacji cytozyn niemetylacyjnych do uracyli. Następnie podczas PCR te urycyle są zamieniane na tyminy. Amplifikacja PCR jest skierowana na obszary zainteresowania i znacznie wzbogaca tylko te sekwencje. Powstałe w ten sposób amplikony PCR są przekształcane w biblioteki z podwójnym indeksem w prostym procesie tagowania. Następnie biblioteki są sekwencjonowane na stołowym sekwenatorze nowej generacji, a odczyty sekwencjonowania są mapowane do sekwencji referencyjnej przekształconej in silico, a procentowa metylacja cytozyny jest określana w sposób specyficzny dla zasady.

Rysunek 2: Konwersja in silico wodorosiarczynu w obszarze zainteresowania. Każdy obszar zainteresowania z dowolnego odniesienia genomowego może być wybrany do konwersji wodorosiarczynu in silico. Cytozyny inne niż CpG są zastępowane tyminą w sekwencji referencyjnej. Cytozyny CpG pozostają cytozynami w odniesieniem przekształconym w wodorosiarczyn.

Rysunek 3: Umieszczanie podkładu. Startery PCR z wodorosiarczynem są zaprojektowane w stosunku do sekwencji referencyjnej przekształconej in silico wodorosiarczynu. Startery powinny być zaprojektowane tak, aby nie nakładały się na dinukleotydy CG lub były zaprojektowane w sąsiedztwie dinukleotydów CG.

Rysunek 4: Przykłady amplikonów PCR i bibliotek sekwencjonowania o wysokiej i niskiej jakości. Reprezentatywne ślady elektroferogramu i żel pokazują (A) idealny amplikon do generowania bibliotek za pośrednictwem transposomów za pomocą pojedynczego produktu o wysokim stężeniu. (B) Biblioteka wygenerowana z tego amplikonu wykazuje wysokie stężenie i równomierny rozkład wielkości. (C) Złej jakości amplikony PCR mogą mieć mały rozmiar, stężenie i zawierać wiele produktów i/lub dimerów starterów. Te słabej jakości amplikony doprowadzą do (D) nieudanego generowania biblioteki o niskiej koncentracji i niskiej dystrybucji rozmiarów.

Rysunek 5: Przykłady wyników sekwencjonowania z kontroli metylacji. (A) Sekwencjonowanie referencyjne z konwersją in silico z miejscami CpG zaznaczonymi na czerwono. 0% kontroli metylacji odwzorowane odczyty do wybranego regionu, pokazujące mapowanie tymin (podświetlenie chciwości) w miejscach CpG. (B) 100% odczyty zmapowane kontrolą metylacji pokazują mapowanie cytozyny (niebieskie podświetlenie) w miejscach CpG.

Rysunek 6: Kwantyfikacja metylacji w różnych kontrolach metylacji. Kontrole metylacji całego genomu zmieszane przy proporcjach metylacji (n = 3/stosunek) od 0% do 100% określono ilościowo za pomocą BSAS. Wykreślenie wartości ilościowej oczekiwanej w porównaniu z wartością ilościową pokazuje liniowość ilościowej kontroli metylacji. We wszystkich kontrolach stwierdzono wysoką precyzję ilościowego oznaczania metylacji.

Rycina 7: Przykład metylacji sparowanego DNA i analizy ekspresji genów z próbek tkanek. (A) Względna ekspresja mRNA rodopsyny z tkanki móżdżku i siatkówki myszy. (B) Średnia metylacja promotora rodopsyny określona ilościowo za pomocą BSAS między DNA móżdżku i siatkówki (***p <0,001, parametryczny test t). C) Poziomy metylacji CpG specyficzne dla miejsca w promotorze rodopsyny (-244 do +6, w stosunku do miejsca rozpoczęcia transkrypcji [TSS]) w DNA móżdżku i siatkówki myszy.

Dyskusja

BSAS pozwala na ukierunkowaną, dokładną kwantyfikację metylacji DNA z wysoką przepustowością zarówno w liczbie próbek, jak i liczbie celów. Dodatkowo, ta generacja biblioteki wykorzystująca znakowanie za pośrednictwem transposomów wymaga mniejszej ilości wejściowego DNA, jest szybsza i zawiera mniej kroków niż tradycyjne techniki ścinania i późniejszej ligacji adaptera. Te ulepszenia w stosunku do istniejących metod pozwalają na precyzyjną analizę metylacji DNA na poziomie podstawowym dowolnego celu będącego przedmiotem zainteresowania. Co więcej, BSAS zapewnia nową metodę potwierdzania regionów będących przedmiotem zainteresowania (regiony metylacji różnicowej (DMR), wyspy CpG, regiony regulacyjne), które zostały zidentyfikowane przy użyciu podejść wodorosiarczynu całego genomu²² lub wychwytywania²³ . Stosowanie ortogonalnych podejść potwierdzających i bardziej precyzyjnych ilościowo metod poprawia rygor analityczny badań epigenomicznych. Wysoka głębokość odczytu osiągnięta za pomocą BSAS pozwala na dokładne określenie ilościowe w wąskim przedziale ufności, co skutkuje precyzyjnym oznaczaniem ilościowym¹⁶. Dodatkowo, możliwość przeprowadzenia wielu próbek w jednym eksperymencie może zwiększyć wielkość próby w celu potwierdzenia metod całego genomu, co zwiększy moc statystyczną; Jest to słabość wielu obecnych badań epigenetycznych. Co ważne, BSAS zapewnia kwantyfikację metylacji CpG specyficzną dla zasady, co pozwala na generowanie testowalnych hipotez do badań epigenetycznych. Hipotezy, takie jak zwiększona metylacja w określonym elemencie odpowiedzi, spowodują zmniejszone wiązanie określonego czynnika transkrypcyjnego. BSAS, w połączeniu ze sparowanymi danymi dotyczącymi ekspresji mRNA, zapewnia metodę uzyskiwania zarówno regulacji epigenetycznej, jak i ekspresji mRNA w pojedynczym fragmencie tkanki lub populacji komórek. Sparowane pomiary regulacji i ekspresji również zwiększają rygor naukowy i wpływ ustaleń.

Krytyczne kroki w ramach protokołu BSAS obejmują projektowanie starterów, optymalizację amplikonów i generowanie bibliotek/kontrolę jakości. Błąd systematyczny PCR jest wprowadzany, jeśli startery nie są prawidłowo zaprojektowane i amplifikują się z różną wydajnością⁸. Stosowanie wzorców metylacji, takich jak enzymatycznie generowane wzorce metylacji 100% i 0% cytozyny, może być wykorzystane do określenia stopnia, jeśli w ogóle, błędu kwantyfikacji metylacji i stanowi właściwą kontrolę metodologiczną przy ilościowym określaniu metylacji¹⁶. Podobnie należy zachować ostrożność podczas optymalizacji reakcji PCR w celu wytworzenia pojedynczego amplikonu wysokiej jakości. Jeśli amplikon nie jest obecny, zgodnie z sugerowanymi wytycznymi wyszczególnionymi w protokole, kroki optymalizacyjne obejmują zwiększenie liczby cykli PCR lub ilości wejściowej bsDNA. Jeśli istnieje wiele produktów PCR, w tym dimery starterów, kroki optymalizacji obejmują zmniejszenie ilości wejściowej bsDNA, zmniejszenie stężeń molowych startera PCR, zwiększenie temperatury wyżarzania lub zmniejszenie liczby cyklu PCR. Jedna lub kombinacja tych procedur optymalizacyjnych daje wyniki wystarczające do wygenerowania pojedynczego wzmacniacza wysokiej jakości. Alternatywnie, przeprojektowanie podkładów jest dobrym podejściem w przypadku zestawów podkładów, które nie dają ani jednego amplikonu. W tych regionach, w których przeprojektowanie nie jest odpowiednie lub możliwe, mogą działać zdegenerowane zestawy starterów, w tym zarówno cytozyna, jak i tymina w miejscach CpG w starterach do przodu oraz adenina i guanina w miejscach CpG w starterach odwrotnych. Jednak te zestawy starterów wymagają dalszej optymalizacji, aby upewnić się, że nie występuje błąd systematyczny PCR, co wykracza poza zakres tego protokołu. Wysokiej jakości biblioteki są niezwykle ważne dla osiągnięcia sukcesu. Upewnij się, że przeprowadzane są pomiary jakości w celu określenia rozmiaru, jakości i ilości bibliotek przed sekwencjonowaniem. Reakcje sekwencjonowania są podatne na niepowodzenia przy wprowadzaniu bibliotek o niskiej jakości. Błąd systematyczny w ilościowym oznaczaniu metylacji można złagodzić, upewniając się, że częstości metylacji są obecne zarówno w odczytach sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu. Ponadto wyniki jakości baz zgodnych z lokalizacjami CpG powinny wynosić ≥Q30, aby uzyskać wysoką pewność ilościową. Podczas gdy inni wykazywali wcześniej niewielkie lub żadne odchylenie w reakcjach znakowania DNA¹⁹ przekształconego w wodorosiarczyn, zapewnienie opisanych powyżej wskaźników pozwala na potwierdzenie kwantyfikacji metylacji o niskim odchyleniu.

BSAS obecnie mierzy metylację w miejscach CpG, jednak przyszłe rozszerzenia tej metody pozwolą na sparowane pomiary CpG 5-hmC z dodaniem etapów eksperymentalnych rozróżniających 5-mC i 5-hmC, takich jak wprowadzenie perrutenianu potasu przed konwersją wodorosiarczynu²⁴. Zwiększy to wpływ narzędzia BSAS, umożliwiając sparowaną metylację, zarówno 5-mC, jak i 5-hmC, oraz dane dotyczące ekspresji w celu określenia regulacyjnych ról ekspresji genów metylacji DNA. Przygotowanie amplikonów PCR za pośrednictwem biblioteki za pośrednictwem transposomów powoduje zmniejszenie głębokości sekwencjonowania na końcach amplifikowanych regionów. W związku z tym regiony o dużym zainteresowaniu powinny być zaprojektowane tak, aby znajdowały się w środku amplikonów. Jednakże, ponieważ BSAS generuje sekwencjonowanie o głębokości odczytu >1,000 X, dokładność ilościowa pomiarów 5 mC w pobliżu końców amplifikowanych obszarów pozostaje wysoka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agilent 2100 Bioanlyzer	Agilent	G29393AA
Zestaw Agilent RNA 6000 Nano	Agilent	5067-1511
Agilent Zestaw DNA o wysokiej czułości	Agilent	5067-4626
Typhoon 9200	Amersham/GE Healthcare Nauki przyrodnicze
Agencourt AMPure XP - Oczyszczanie PCR	Beckman Coulter	A63880	5 ml
PowerPac Basic Power Supply	Bio Rad	164-5050
twin.tech płytka PCR 96	Eppendorf	951020362	z półspódniczką
	Eppendorf	0030127838
Folia termozgrzewalna	Eppendorf	0030127854
Heat Sealer	Eppendorf	5390000.024
0,1-10 μ l	Końcówki Eppendorf	0030073.002
2-200 μ l Końcówki	Eppendorf	0030073.045
50-1,000 μ l	Końcówki Eppendorf	0030073.100
MixMate	Eppendorf	5353000.014
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Eppendorf	0030121.023
Wirówka 5424	Eppendorf	5424000.010
Probówka do mikrowirówek 2,0 ml	Eppendorf	022363352
Zestaw do przygotowania próbek DNA Nextera XT	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	24 indeksy
MiSeq Desktop Sequencer	Illumina
MiSeq Zestaw odczynników v2	Illumina	MS-102-2002	300 cykli
KAPA SYBR FAST Uniwersalny zestaw qPCR	KAPA Biosystems	KK4824
Zestaw do oznaczania dsDNA Quant-iT PicoGreen	Technologies	P7589
Zestaw do oznaczania RNA RiboGreen Quant-iT	Life Technologies	R11490
96-dołkowy system do PCR ProFlex	Life Technologies	4484075
Novex 6% żel DNA TBE	Life Technologies	EC6261BOX	10-dołkowy
system buforowy Novex TBE Running Buffer	Life Technologies	LC6675	5x (1 l)
Novex Hi-Density TBE Sample	Buffer Technologies	LC6678	5x (10 ml)
1 Kb Plus Technologie żywotności drabinki DNA		10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
UltraPure 10 mg/ml Technologie życia bromku etydyny		15585-011
7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym	Life Technologies	4329001	384-dołkowy blok
DynaMag-96 Side Skirted	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 wielomodowy Czytnik mikropłytek	Urządzenia molekularne/VWR	89429-532
AllPrep DNA/RNA Mini zestaw	Qiagen	80204
Koraliki ze stali nierdzewnej	Qiagen	69989	5 mm
CLC Genomics Workbench	Qiagen		Oprogramowanie do rurociągu metylacji
QIAQuick PCR Zestaw do oczyszczania	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
Woda bez nukleaz	Sigma	W4502
TRIS chlorowodorek	Sigma	PHG0002-100G
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
384-dołkowa płyta z pełną spódnicą, standard	Thermo Scientific	AB-1384
Absolutna pieczęć qPCR	Thermo Scientific	AB-1170
EZ DNA Zestaw do metylacji-błyskawicy	Zymo Research	D5030	50 rxn
ZymoTaq Polimeraza DNA	Zymo Research	E2001	50 rxn