Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Podsumowanie

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Streszczenie

Szklany płaski system dwuwarstwowy lipidów był wykorzystywany w różnych dyscyplinach. Jednym z najbardziej użytecznych zastosowań tej techniki jest badanie tworzenia synaps immunologicznych, ze względu na zdolność płaskich dwuwarstw lipidowych wspieranych przez szkło do naśladowania powierzchni komórki docelowej podczas tworzenia poziomego interfejsu. Ostatnie postępy w obrazowaniu w superrozdzielczości pozwoliły naukowcom lepiej przyjrzeć się najdrobniejszym szczegółom struktury synaps. W tym badaniu jedna z tych zaawansowanych technik, stymulowane zubożenie emisji (STED), jest wykorzystywana do badania struktury synaps komórek NK (Natural Killer) na podpartej dwuwarstwie lipidowej. W niniejszym dokumencie znajduje się łatwy do naśladowania protokół szczegółowo opisujący: jak przygotować surowe syntetyczne fosfolipidy do użycia w syntezie dwuwarstw na podłożu szklanym; jak określić, jak gęsto białko o danym stężeniu zajmuje miejsca przyczepu dwuwarstwy; jak skonstruować podpartą dwuwarstwę lipidową zawierającą przeciwciała przeciwko receptorowi aktywującemu komórki NK CD16; i wreszcie, jak obrazować ludzkie komórki NK na tej dwuwarstwie za pomocą mikroskopii superrozdzielczej STED, z naciskiem na dystrybucję dodatnich granulek litycznych perforyny i nitkowatej aktyny w synapsach NK. W ten sposób, łącząc szklany płaski system dwuwarstwowy lipidów z techniką STEM, wykazujemy wykonalność i zastosowanie tej połączonej techniki, a także struktury wewnątrzkomórkowe w synapsie immunologicznej NK z super rozdzielczością.

Wprowadzenie

Synapsa immunologiczna (IS) leży w krytycznym punkcie aktywacji i funkcji komórki¹. Jest to podstawowe podłoże, za pomocą którego przeprowadzana jest prezentacja antygenu i odporność komórkowa. Najwcześniejsze badania mikroskopowe nad powstawaniem synaps wykorzystywały układ sprzężony komórka-komórka². Głównym ograniczeniem tego podejścia jest to, że większość koniugatów będzie oglądana niejako "z profilu", ograniczając w ten sposób pogląd obserwatora na samą strukturę synaptyczną. W 1999 roku laboratorium Dustina rozwiązało to ograniczenie, wykorzystując technikę dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym (SLB)³, która została wcześniej zapoczątkowana przez laboratorium McConnel^4,5. Podejście to pozwoliło na wyeliminowanie komórek prezentujących antygen (APC) na rzecz szklanej płaskiej powierzchni lipidowej, do której białka mogą być przyłączane i swobodnie poruszać się w dwóch wymiarach. Korzystając z tej metody, Dustin i jego koledzy byli w stanie zajrzeć bezpośrednio do synapsy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości i po raz pierwszy uzyskać "twarzą w twarz" strukturę IS.

Za pomocą systemu SLB, szczegółowość, z jaką można wizualizować IS, została ograniczona tylko przez ograniczenia obecnych technik obrazowania^6-8. Przy użyciu standardowych technik oświetleniowych minimalna rozdzielczość (tj. minimalna odległość między dwoma odrębnymi obiektami, w której można je rozróżnić) została < 200 nm na podstawie kryterium^{Rayleigha 9}. Ograniczenie to utrudnia obrazowanie bardzo drobnych struktur w skali molekularnej tworzących synapsę, a do czasu opracowania technik obrazowania superrozdzielczego^10-12 wizualizacja tych struktur ograniczała się do obrazowania nieruchomych komórek za pomocą mikroskopii elektronowej.

Wraz z niedawnym pojawieniem się różnych technik super-rozdzielczościowych, takich jak SIM (mikroskopia oświetlenia strukturalnego), PALM (mikroskopia lokalizacji aktywowanej fotoaktywem), STORM (stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej) i STED^10-12, badacze są teraz w stanie badać te struktury synaptyczne w niespotykanych dotąd szczegółach, co z kolei zapewnia coraz bardziej jasne zrozumienie IS. Zalety mikroskopii STED zostały opisane wcześniej¹³. Tutaj opisujemy obrazowanie w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii STED wyposażonej w nowo opracowany laser zubożający 660 nm. W porównaniu z konwencjonalnym laserem zubożającym 592 nm, laser 660 nm pozwala na szerszy wybór barwników fluorescencyjnych (patrz http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), zwłaszcza tych czerwonych fluoroforów.

Inne publikacje opisywały obrazowanie STED synaps komórek NK na szkiełkach pokrytych przeciwciałami^13,14. W tym przypadku system SLB jest połączony z mikroskopią STED o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania synapsy komórek NK. Technika ta ma tę przewagę nad szkiełkami powlekanymi przeciwciałami, że jest płynną mozaiką, w której osadzone białka powierzchniowe mogą swobodnie poruszać się po płaskiej dwuwymiarowej powierzchni (płaszczyzna x-y). To wierniej naśladuje organiczną i ruchomą powierzchnię komórki docelowej, a w konsekwencji lepiej podsumowuje tworzenie fizjologicznie istotnej synapsy immunologicznej.

Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikowi końcowemu szczegółowego opisu, jak obrazować synapsę immunologiczną komórek NK poprzez połączenie systemu SLB i super-rozdzielczej mikroskopii STED. Zapewni użytkownikowi końcowemu kroki niezbędne do: przygotowania liposomów, skonstruowania dwuwarstw osadzonych w białku, określenia gęstości białka na dwuwarstwach lipidowych oraz uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii STED. Techniki te nie ograniczają się do dziedziny immunologii i mogą być szeroko stosowane w różnych dyscyplinach.

Protokół

1. Przygotowanie liposomów

1. Obliczyć ilość zawiesinowych roztworów podstawowych 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-kapu biotynylu (Biotyna-PE) zawieszonych w chloroformie, w celu wytworzenia rozcieńczonych roztworów o pożądanym stężeniu końcowym. Aby uzyskać końcowe stężenia 400 μM DOPC i 80 μM fosfolipidów Biotyna-PE po 10 ml każdy, należy rozpocząć od umieszczenia 629 μl 10 mg/ml DOPC i 88 μl 10 mg/ml Biotin-PE w oddzielnych szklanych probówkach chromatograficznych.
   UWAGA: ważne jest, aby czyścić szklane strzykawki Hamilton i szklane probówki chromatograficzne roztworem czyszczącym (1 L 95% etanolu do 120 ml wody zawierającej 60 g wodorotlenku potasu, KOH), przenosząc zawieszony chloroform roztwór podstawowy DOPC i Biotyny-PE.
2. Wysuszyć chloroform strumieniem argonu w okapie chemicznym. Uszczelnić probówkę chromatograficzną parafilmem.
3. Poddaj nowo wysuszone liposomy działaniu wysokiej próżni w liofilizatorze O/N, aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu. W celu ukończenia tego samego dnia suszyć przez 60-90 minut.
4. Podczas pracy liofilizatora przygotuj trochę buforu do rozcieńczania. Do tego protokołu przygotuj 25 ml składające się z 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; i 2% (wagowo) detergentu n-oktylo-β-D-glukopiranozydu (OG). Najpierw wymieszaj ze sobą pierwsze dwa składniki, a następnie wypiernij tlen argonem przed dodaniem suchego proszku OG. Po przygotowaniu przefiltrować roztwór OG z membraną z octanu celulozy o grubości 0,2 mikrona i przechowywać w temperaturze 4°C.
5. Ponadto należy przygotować dwie zakręcane butelki zawierające 1 l buforu tris-soli fizjologicznej o tych samych stężeniach, ale bez OG. Umieść mieszadło magnetyczne oczyszczone wodą destylowaną na dnie każdego z nich. Przygotuj 6 dodatkowych litrów buforu Tris-sola. Usuń tlen ze wszystkich butelek z argonem i umieść je również w temperaturze 4°C.
6. Po liofilizacji rozpuść wysuszone lipidy w buforze tris-soli OG, aby uzyskać 4 mM roztwór każdego z nich. Postępując zgodnie z przykładowymi objętościami, dodać 2 ml do probówki DOPC i 0,2 ml do probówki Biotin-PE.
7. Wymieszaj ze sobą lipidy biotyny-PE z lipidami DOPC. Poprawia to ruchliwość SLB, ponieważ sprzężona biotyna może osłabiać płynność grup głów fosforanowych. Aby uzyskać końcowe stężenie 80 μM Biotin-PE, należy zmieszać 0,2 ml 4 mM Biotin-PE i 1 ml 4 mM DOPC. Następnie dodać 8,8 ml buforu Tris-soli OG.
8. Aby uzyskać końcowe stężenie 400 μM DOPC, wystarczy zmieszać 1 ml 4 mM DOPC z 9 ml Tris-soli OG.
9. Napełnij sonikator lodowatą wodą. Umieść szklaną rurkę zawierającą rozcieńczony fosfolipid w środku sonikatora za pomocą zacisku narzędziowego. Sonikować rozcieńczony fosfolipid przez 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny.
   UWAGA: Dodaj lód do łaźni wodnej sonikatora, aby utrzymać niską temperaturę, ponieważ sonikacja będzie generować ciepło.
10. Napełnij rurki argonem, aby wyprzeć tlen z powietrza nad cieczą i uszczelnij je parafilmem.

2. Dializa liposomów

1. Wyciąć z rolki dwa odcinki rurki do dializy na sucho (odcięcie masy cząsteczkowej: 12-14 000, średnica: 6,4 mm) o odpowiedniej długości (w tym przykładzie 40 cm), po jednym na każde rozcieńczenie fosfolipidów.
2. Ponownie nawodnić odcinki rurek, pozwalając im zanurzyć się w 200 ml wody destylowanej w szklanej zlewce przez 2 minuty.
3. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 5 minut na wysokim poziomie lub przynajmniej do momentu, gdy woda się zagotuje.
4. Zawiąż węzeł na jednym końcu każdej rurki i spłucz wnętrze kilkoma mililitrami buforu Tris-saline-OG. Następnie skrupulatnie wyciśnij jak najwięcej tego buforu do mycia, aby zminimalizować ilość buforu pozostającego w środku.
5. W okapie z przepływem laminarnym dodaj rozcieńczone fosfolipidy do każdej probówki i zaciśnij otwarte końce małym zamknięciem rurki do dializy, tak aby wykluczyć całe powietrze. Całkowite wykluczenie powietrza będzie wymagało poświęcenia niewielkiej objętości próbki poprzez zaciśnięcie poniżej "linii wodnej".
6. Zanurzyć próbki w przygotowanych wcześniej butelkach z buforem tris-soli fizjologicznej bez OG. Wyprzeć tlen z butelki z argonem przed ponownym zamknięciem i umieścić do wymieszania O/N w temperaturze 4°.
7. Przenieść rurkę do nowej butelki buforu Tris-soli fizjologicznej bez OG co 12 godzin przez co najmniej 3 razy.
8. Na krótko przed usunięciem dializowanych lipidów należy przygotować kilka małych probówek, do których należy podzielić lipidy, wypełniając każdą z nich argonem w celu wyparcia tlenu.
9. Po upływie 36 godzin należy umieścić butelki do dializy w okapie z przepływem laminarnym i wyjąć z nich rurki do dializy. Miej pod ręką pieluchę ławkową lub zlewkę, aby zebrać mokry spływ.
10. Przeciąć rurkę do dializy powyżej zacisku, a następnie zdjąć klips i ostrożnie przenieść dializowany roztwór lipidowy za pomocą pipety do podwielokrotności 1 ml we wstępnie przygotowanych probówkach wypełnionych argonem na lodzie.
11. Podwielokrotność wodnego roztworu liposomu użyj strumienia argonu, aby ponownie wyprzeć tlen w każdej probówce.
12. Przechowuj liposomy w temperaturze 4°. Nie zamrażać.

3. Oznaczanie gęstości przeciwciał na dwuwarstwie lipidowej

1. Przygotować serię rozcieńczeń biotynylowanego, znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała o objętości 50 μl dla każdego rozcieńczenia, w następujących stężeniach: 0 nM (próba ślepa), 10 nM, 50 nM, 100 nM i 500 nM. (zwane dalej "serią próbek").
2. Dodaj 1 μl kulek krzemionkowych do 6 dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Pamiętaj, aby dobrze wstrząsnąć kulkami przed pipetowaniem, ponieważ mają tendencję do osiadania.
   UWAGA: Jeśli zamówiłeś suche kulki, a nie zawieszone, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi rozcieńczenia.
3. Do tych kulek dodaj 2 μl mieszanych fosfolipidów DOPC:Biotinyl w stosunku 1:1. Zrób to dla każdej studni.
4. Pulsuj płytką na wirowniku o średniej intensywności 3 razy przez 10 sekund każdy, aby zachęcić do interakcji z kulkami i fosfolipidami.
5. Do każdego dołka dodać 150 μl 5% kazeiny. Dobrze wymieszaj, pipetując trzy razy w górę i w dół.
6. Pozwól płytce inkubować w roztworze kazeiny przez 10 minut, a następnie zmyj. Aby umyć, napełnij każdą studzienkę do całkowitej objętości 250 μl buforowaną solą fizjologiczną HEPES (HBS) z 1% albuminą surowicy ludzkiej (HSA). Wirować przy 1.000 x g przez 2 min. Odpipetować i wyrzucić górne 200 μl supernatantu, a następnie powtórzyć dwukrotnie, w sumie trzy cykle płukania.
7. Dodać 50 μl streptawidyny w stężeniu 333 ng/ml. Ponownie pulsuj płytkę 3x 10 sekund i pozostaw ją na wytrząsarce na 15 minut. Przemyj 3 razy, jak w kroku 6, aby usunąć niezwiązaną streptawidynę.
8. Dodać 50 μl znakowanego fluorescencyjnie biotynylowanego przeciwciała z poprzednio przygotowanej serii rozcieńczeń (patrz krok 3.1) do każdej studzienki i wymienić płytkę na wytrząsarce na 20-30 minut. Przemyć 3x jak w kroku 6 w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.
9. Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 100 μl HBS/1% HSA, a następnie przenieś do probówki FACS. Powtórz to dwukrotnie, aby zapewnić skuteczne usunięcie wszystkich kulek ze studzienki, w sumie 300 μl, i zrób to dla każdej studzienki.
10. Przynieś powstałe rurki do cytometru przepływowego. Nadszedł czas, aby je przeczytać.
11. Dodać 1 kroplę z butelki oznaczonej "B" z zestawu kulek do kalibracji intensywności fluorescencji (FIC) (zwanego dalej "serią standardową") do probówki FACS i rozcieńczyć 300 μl HBS/1% HSA.
12. Przeczytaj tę tubę, ale nie zapisuj jeszcze danych. Na razie po prostu upewnij się, że puste koraliki są prawidłowo wyzerowane. Wykonaj histogram przedstawiający fluorescencję koralików mierzoną w odpowiednim kanale, a następnie przesuń napięcie lasera wzbudzającego w dół, aż pik znajdzie się po lewej stronie histogramu.
13. Wyjmij probówkę i dodaj po 1 kropli każdej z pozostałych 4 probówek z serii (oznaczonych od 1 do 4) do tej samej probówki. Teraz ponownie umieść rurkę w maszynie i zapisz wynikowe dane, które powinny pojawić się jako 5 odrębnych pików.
14. Odczytaj każdą pojedynczą probówkę z serii próbek.
15. Korzystając z oprogramowania do analizy FACS, narysuj bramkę obejmującą całą szerokość każdego piku na histogramie serii standardowej w połowie punktu maksymalnego. To jedna brama na każdy szczyt. Zrób to samo dla każdej próbki. Zwróć uwagę na MFI (średnią intensywność fluorescencji) dla każdej bramki.
16. Za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych wprowadź zmierzone wartości MIF w odpowiednim miejscu. Wprowadź również wartości MESF (cząsteczki równoważnego rozpuszczalnego fluorochromu) (średnia liczba cząsteczek fluorescencyjnych pokrywających każdy koralik) dla każdej butelki z serii standardowej. Informacje te można znaleźć, postępując zgodnie ze wskazówkami na plastikowym słoiku, w którym dostarczono tubki.
17. Użycie arkusza kalkulacyjnego spowoduje wykreślenie MIF w stosunku do wartości MESF, tworząc liniową korelację między liczbą fluoroforów a zmierzoną intensywnością.
18. Użyj modułu "białka i etykiety" w spektrofotometrze mikroobjętościowym, aby określić stosunek barwnika do białka w znakowanym przeciwciałie.
19. Wprowadzić skuteczność znakowania białka próbki, średnią średnicę kulek pokrytych lipidami oraz wartość MFI dla każdego wpisu. Arkusz kalkulacyjny automatycznie użyje formuły z wykresu liniowego wygenerowanego w kroku 3.16 do obliczenia wartości MESF dla każdego rozcieńczenia białka i gęstości wysiewu białka próbki przy każdym stężeniu.

4. Izolowanie i hodowla ludzkich komórek NK

1. Podwielokrotność 15 ml krwi obwodowej lub kożuchy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć tę krew PBS zawierającą 1% FBS w stosunku 1:1.
2. Delikatnie dodać 13 ml Ficollu na dno probówki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
3. Wirować tę probówkę przez 20 minut przy 1 200 x g z akceleratorem i odłamaniem lub przy najniższych ustawieniach.
4. Po odwirowaniu należy użyć pipety serologicznej, aby zebrać pływającą, mętną białą warstwę środkową komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), które powinny się usiąść, oraz przecięcie między przezroczystą żółtą górną warstwą a bardziej mętną bladą dolną warstwą, z których obie znajdują się powyżej najniższej warstwy czerwonych krwinek (RBC). UWAGA: Nie należy zbierać żadnych erytrocytów podczas zbierania PBMC.
5. Umieścić zebrane PBMC w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i rozcieńczyć do pełnej objętości PBS zawierającym 1% FBS. Ponownie odwirować, tym razem z hamulcem i maksymalnie włączonym pedałem przyspieszenia, przez 5 minut przy 300 x g.
6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS zawierającym 1% FBS.
7. Policz komórki, ponownie wirując z tymi samymi ustawieniami, co w kroku 4.6.
8. Ponownie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce R10 o gęstości 10 milionów komórek/ml.
9. Weź 30 milionów komórek w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml i odizoluj komórki NK za pomocą zestawu do separacji magnetycznej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po izolacji policz komórki jeszcze raz i ponownie zawieś o gęstości 500 000 komórek/ml w kompletnym pożywce R10 (88% RPMI; 10% FBS; 1% HEPES; 1% pirogronian sodu) uzupełnionym IL-2 (100 U/ml). Hodowla w temperaturze 37° w inkubatorze CO₂ i wymiana pożywki 2-3 razy w tygodniu.

5. Montaż dwuwarstwy lipidowej na podłożu płaskim na podłożu szklanym

1. Przygotować 100 ml roztworu piranii, mieszając 30% nadtlenku wodoru z kwasem siarkowym w stosunku 1:3 w zlewce.
   UWAGA: Zawsze wykonuj pracę ze szkodliwymi środkami, takimi jak kwas siarkowy, w odpowiednio przeznaczonym do tego dygestoriach chemicznych.
2. W tym roztworze zanurz 2 prostokątne szkiełka nakrywkowe #1,5 w roztworze piranii na 20-30 minut.
   UWAGA: Konieczne jest oczyszczenie szkiełek nakrywkowych roztworem piranii.
3. Podczas czyszczenia szkiełek nakrywkowych należy pobrać 1 tubkę wcześniej przygotowanych 400 μM lipidów DOPC i 1 tubkę wcześniej przygotowanych 80 μM lipidów Biotyna-PE. Transportuj je na lodzie do zbiornika argonu.
4. Wyprzeć tlen w nowej probówce mikrowirówki z argonem, a następnie dodać DOPC i Biotin-PE w stosunku 1:1. Właściwa objętość będzie się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych, ale powinna wynosić co najmniej 2 μl każda. Ponownie wyprzeć tlen w probówce z mieszaniną za pomocą argonu, a także poszczególnych probówek z odczynnikami, przed powrotem tych ostatnich do lodówki.
5. Po zakończeniu czyszczenia dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu na kilka minut.
6. Pobrać 1,5 μl mieszaniny liposomów przygotowanej w kroku 5.4 i podać ją w jednej kropli do jednej z komór pasa ruchu na szkiełku komorowym. Użycie 2 kropli na linię jest typowe, ale nie jest konieczne.
7. Szybko i sprawnie umieść suche szkiełko nakrywkowe na kropelkach. Upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone od siebie, aby nie łączyły się po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego. Ponadto upewnij się, że krople pozostają okrągłe i dobrze zdefiniowane, nie dotykając krawędzi ścianek komory. Mocno dociśnij pomiędzy każdym pasem ruchu i wokół niego, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
8. Zaznacz pozycje kropli za pomocą markera
9. Przepuść 100 μl 5% wodnej kazeiny przez komorę, aby zablokować dwuwarstwę. Spróbuj upewnić się, że w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków.
10. Wstrzyknąć 100 μl streptawidyny w stężeniu 333 ng/ml do każdego toru. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć, przepuszczając 3 ml HBS/1% HSA przez każdą ścieżkę, aby usunąć nadmiar streptawidyny.
11. Dodać 100 μl biotynylowanego, znakowanego fluorescencyjnie anty-CD16, takiego jak Alexa Fluor 568, o stężeniu białka wcześniej określonym jako najbardziej skuteczne w sekcji 3. Inkubować w ciemności przez 20-30 minut. Umyć ponownie, przepuszczając 3 ml HBS/1% HSA przez każdą linię.
12. Przepuść 100 μl D-biotyny o stężeniu 25 nM przez komorę w celu związania nadmiaru streptawidyny, a tym samym wyeliminowania ryzyka niespecyficznego wiązania streptawidyny z komórkami.
13. Policz komórki NK i ponownie zawiesić w stężeniu 500 000/ml w HBS/1% HSA.
14. Podczas wirowania komórek wypłucz D-biotynę z komory za pomocą kolejnych 3 ml HBS/1% HSA na pas
.
15. Sprawdź ruchliwość ligandów na SLB poprzez odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) na całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) lub mikroskopii konfokalnej przed dodaniem komórek NK.
16. Gdy komórki zakończą wirowanie i zostaną ponownie zawieszone w pożądanym stężeniu, dodaj 100 μl do każdego pasa.
17. Umieść komorę w inkubatorze o temperaturze 37° 5% CO₂ na 30-60 minut.
18. Po tym okresie inkubacji utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut. Przemyć, przepuszczając 3 ml PBS przez każdą ścieżkę, aby usunąć paraformaldehyd.
19. Dodać 400 μl buforu blokującego (5% normalnej surowicy osła i 0,2% Tritron X-100 w PBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
20. Barwnik F-aktyny i perforyny przez dodanie 200 μl rozcieńczonej fluorescencyjnie znakowanej falloidyny (1 jednostka / ml znakowanej falloidyny) i znakowanej fluorescencyjnie mAb anty-perforyny (500 ng / ml antyperforyny mAb). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
21. Zmyć, uruchamiając 3 ml PBS. Komora jest gotowa do wykonania badań obrazowych.

6. Obrazowanie synapsy NK na dwuwarstwie lipidowej za pomocą STED

1. Włącz wszystkie niezbędne moduły sprzętowe.
2. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu. Włącz zarówno skanowanie rezonansowe, jak i moduły SED. Po dokonaniu tych wyborów poczekaj około 3-5 minut, aż oprogramowanie się zainicjuje.
3. Kliknij zakładkę "Konfiguracja" u góry ekranu.
4. Wybierz "Konfiguracja lasera", a następnie włącz białe światło i lasery STED 592 nm.
5. Wybierz obiektyw 100x i wyrównaj wiązkę lasera wzbudzenia z laserem zubożającym 592 nm.
6. Wybierz moduł "Laser Config", wyłącz laser zubożający 592 i włącz laser zubożający 660 nm.
7. Umieść szkiełko na stoliku, nad obiektywem. Ustaw ostrość komórek związanych na wyznaczonym obszarze dwuwarstwowym za pomocą lampy światła białego i okularów.
8. Wróć do zakładki "Akwizycja", bezpośrednio po prawej stronie zakładki "Konfiguracja".
9. Kliknij zakładkę "Przełącz na światło białe", a następnie włącz ten moduł i przeciągnij linię lasera wzbudzenia na odpowiednią długość fali.
10. Wybierz żądany detektor z listy dostępnych, a następnie ustaw zakres wykrywania tak, aby obejmował odpowiedni zakres długości fal.
    UWAGA: NIGDY nie umieszczaj zakresu wykrywania bezpośrednio pod wiązką wzbudzenia.
11. Kliknij przycisk "Sekwencjonalny" na pasku narzędzi po lewej stronie, aby wyświetlić okno dialogowe Skanowanie sekwencyjne u dołu lewego paska narzędzi. Dzięki temu użytkownik może dodać wiele sekwencji, z których każda ma inną wiązkę wzbudzenia dla innego koloru. Kliknij "Między klatkami", a następnie ustaw częstotliwość wzbudzenia, detektor i zakres wykrywania dla każdego dodatkowego koloru, jak w krokach 6.9 i 6.10.
12. Po zoptymalizowaniu wszystkich ustawień naciśnij "Start", aby rozpocząć proces pozyskiwania.
13. Zastosuj bezpłatne oprogramowanie do dekonwolucji (Huygens) przy użyciu ustawienia przeznaczonego do dekonwolucji SED, jak opisano wcześniej¹³.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje wynik zagęszczenia przeciwciał na dwuwarstwie lipidowej. Zasada polega na użyciu standardowych kulek do wyznaczenia standardowej krzywej MESF w porównaniu z MFI za pomocą cytometrii przepływowej (A). MFI serii próbek przeliczono na MESF przy użyciu krzywej standardowej. Gęstość przeciwciał na dwuwarstwie lipidowej jest liniowo skorelowana ze stężeniem przeciwciał (B). Rycina 2 przedstawia trójkolorowy obraz STED synapsy NK na dwuwarstwie lipidowej płaskiej ze szkłem. Przeciwciało anty-CD16 na dwuwarstwie lipidowej gromadzi się, wywołując tworzenie F-aktyny oraz polaryzację i przenikanie perforyny przez siatkę F-aktyny w panelu ogniskowym synapsy immunologicznej w komórkach NK. Korzystając z tego połączonego podejścia, można czysto obserwować mikroklastry znakowanego fluorescencyjnie anty-CD16 w SLB, co bezpośrednio odzwierciedla grupowanie CD16 na komórce NK. W porównaniu z konwencjonalnym obrazem konfokalnym, struktura centralnej gromady CD16 jest łatwiej dostrzegalna na obrazie STED ze względu na zubożoną fluorescencję otoczenia. Ponadto ultrastruktura cytoszkieletu aktynowego jest widoczna ze znacznie lepszą rozdzielczością. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami^16,17, perforynowo-dodatnie granulki lityczne są widoczne umieszczone nad obszarami o niskiej gęstości F-aktyny na obrazie STED, co jest kluczowym szczegółem, który jest w większości tracony w obrazie konfokalnym.

Rysunek 1. Gęstość przeciwciała 3G8 na dwuwarstwie lipidowej.(A) Korelacja liniowa między MESF i MIF dla serii standardowych. (B) Liniowa korelacja między gęstością białka a stężeniem w serii rozcieńczeń białek próbki, pokazująca liczbę znakowanych fluorescencyjnie monomerów białkowych na jednostkę powierzchni w funkcji rosnącego stężenia na kulkach krzemionkowych pokrytych lipidami.

Rycina 2. Obrazowanie STED synapsy NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej. Pierwotne komórki NK stymulowano na SLB zawierającym biotynylowane fluorescencyjnie znakowane anty-CD16 (czerwone), utrwalone, przepuszczalne, a następnie wybarwione falloidyną (niebieski) i anty-F-aktyną (zielony). Pojedyncza komórka została najpierw zobrazowana w normalnym ustawieniu konfokalnym, a następnie w ustawieniu STED. Obrazy konfokalne i STED zostały zdekonwolucyjne za pomocą oprogramowania Huygens. Pasek skali,1 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nowością obecnego badania jest to, że łączy ono technikę SLB z STED w celu zbadania synaps komórek NK. Wcześniejsze badania obrazowały dwuwarstwę lipidową za pomocą TIRF w celu zbadania tworzenia synaps komórek T⁸ i transportu cząsteczek sygnałowych na błonie komórkowej⁶. Inni opisali obrazowanie STED synaps komórek NK przy użyciu szkiełek pokrytych przeciwciałami^13,14. Opisana tutaj metoda hybrydowa dodatkowo rozwija te wysiłki, obrazując synapsę komórki NK ze zwiększoną przejrzystością zapewnianą przez obrazowanie w superrozdzielczości na powierzchni dwuwarstwy lipidowej, co lepiej modeluje dynamiczną powierzchnię APC.

Chociaż SLB są sztucznymi błonami pozbawionymi cytoszkieletu, tratw lipidowych i innych ligandów, które posiadają rzeczywiste komórki docelowe lub APC, technika ta może podsumować ważne cechy, takie jak ruchliwość i orientacja ligandów. Dzięki temu system SLB może służyć jako podejście redukcjonistyczne w analizie udziału poszczególnych receptorów i ligandów w tworzeniu IS i dynamice IS. Najważniejszą cechą SLB jest to, że naukowcy mogą łączyć tę technikę z podejściami do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takimi jak mikroskopia konfokalna i mikroskopia TIRF. Wprowadzenie mikroskopii STED jeszcze bardziej zwiększa tę przewagę, dostarczając bezprecedensowego wglądu w badania nad SI i ich kliniczne zastosowania.

Jednym z potencjalnych zarzutów wobec tego systemu jest to, że SLB nie naśladuje odpowiednio złożonej powierzchni APC, co prowadzi do potencjalnie niefizjologicznych cech anatomicznych w powstałych synapsach. Chociaż prawdą jest, że ograniczony repertuar cząsteczek powierzchniowych na SLB nie oddaje w pełni niejednorodnie zaludnionej powierzchni APC, ograniczenie to może być również korzystne, ponieważ pozwala badaczom określić wpływ indywidualnych interakcji receptorów i ligandów na tworzenie synaps.

W tym procesie składa się kilka kluczowych kroków. Jednym z najważniejszych jest zapobieganie utlenianiu liposomów poprzez ciągłe stosowanie argonu do wypierania tlenu w rurce i roztworze, tak jak w krokach 1.10, 2.6 i 2.11. Utlenianie lipidów spowoduje zmniejszenie ruchliwości lipidów, utrudniając w ten sposób zdolność białek powierzchniowych do swobodnego poruszania się i uczestniczenia w strukturyzacji synaptycznej. Podobnie, ważne jest również usunięcie całego chloroformu z liposomu poprzez liofilizację (krok 1.2). Przy określaniu gęstości białek w dwuwarstwie lipidowej ważne jest, aby najpierw zdyspersjonować kulki krzemowe w jednorodnej zawiesinie wolnej od klastrów. W razie potrzeby można zastosować sonikację koralików. Podczas montażu SLB niezbędne są wczesne etapy (5.1-5.8), w których szkiełka nakrywkowe są czyszczone, umieszczane są krople i mocowane szkiełko nakrywkowe. Błąd w którymkolwiek z nich może wymagać rozpoczęcia eksperymentu od nowa (od początku sekcji 5). Z tego powodu dobrą praktyką jest czyszczenie większej liczby szkiełek nakrywkowych, niż będzie to potrzebne, aby zaoszczędzić czas w przypadku nieszczęśliwego wypadku.

Brak klastrowania jest najczęstszym problemem podczas pracy z tym systemem. Jeśli podczas wizualizacji komórek w ostatnim kroku nie uda się znaleźć żadnych synaps fluorescencyjnych, można podjąć kilka kroków. Kolejne barwienie dla pokrewnego receptora powierzchniowego komórki można dodać do komory, aby sprawdzić, czy komórka nie utworzyła synapsy z dwuwarstwą, podczas gdy komórki mogą przylegać niespecyficznie do szklanego szkiełka nakrywkowego lub powierzchni dwuwarstwowej, białka powierzchniowe zaangażowane synaptycznie powinny pojawiać się jako odrębne klastry na płaszczyźnie granicy komórka-dwuwarstwa, podczas gdy niezaangażowane białka powierzchniowe powinny pojawiać się jako rozproszone barwienie na obwodzie komórki. Jeśli ta metoda nie powiedzie się, należy sprawdzić ich komórki za pomocą cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że konkretny marker, który ma nadzieję zbadać, jest wyrażony w odpowiedniej obfitości na powierzchni komórki. Wiadomo, że niektóre białka powierzchniowe są regulowane w dół przez długi czas w hodowli in vivo .

Podczas gdy ten protokół szczegółowo opisuje, jak wizualizować tworzenie synaps komórek NK, system SLB może być używany do badania tworzenia synaps w dowolnym immunocytach, jakie można sobie wyobrazić po prostu przez podstawienie pierwszorzędowego liganda w kroku 5.11. Można również dodać wiele ligandów jednocześnie. Nie trzeba również stosować układu streptawidyna-biotyna do przylegania białek powierzchniowych w obrębie dwuwarstwy. Interakcje nikiel-NTA:histydyna są również żywotne. Jednak ze względu na wysoką siłę i specyfikę interakcji streptawidyna-biotyna, nasze laboratorium preferuje ten system. Można również zmieniać stężenie komórek dodawanych do dwuwarstwy od gęstości zalecanej w kroku 5.13, a także czas trwania kolejnego okresu inkubacji, aby obserwować synapsy na różnych etapach dojrzewania. Można to zrobić nawet na żywo, choć to oczywiście wyklucza możliwość wizualizacji struktur wewnątrzkomórkowych (chyba że są one już oznaczone stopionym znacznikiem fluorescencyjnym; nasze laboratorium używa kilku takich zmienionych linii komórkowych). Ze względu na wysoki stopień dostosowania możliwy w tym protokole, można użyć podstawowej techniki SLB, wraz z obrazowaniem STED, aby odpowiedzieć na niezwykle różnorodny zakres pytań z zakresu immunologii, biologii komórki i biochemii, w tym podstawowej dynamiki lipidów¹⁵, tworzenia synaps¹⁶, sygnalizacji wewnątrzkomórkowej¹⁷ i przerzutów komórek nowotworowych¹⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina	Avanti	850375C	Preparat liposomowy
18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sól sodowa)Avanti		870273C	Przygotowanie liposomów
Gaz argonowy, sprężony	gaz powietrzny	UN1006	Preparat liposomowy
Liofilizator	Labconco	Freezone 7740020	Preparat liposomowy
Rurki liofilizacyjne	Labconco	7540200	Przygotowanie liposomów
Kolumny chromatograficzne	Santa Cruz	sc-205558	Preparat liposomowy
1 M Tris pH 8,0	Ambion	AM9856	Preparat liposomowy
5 M NaCl	Ambion	AM9759	Preparat liposomowy
Oktylo-β-D-glukopiranozyd	Sigma-Aldrich	O1008	Przygotowanie liposomów
Rurka do dializy	Spectrum Labs	132676	Preparat liposomowy
96-dołkowa płytka z polistyrenu w kształcie litery V (niepoddana obróbce)	Oznaczanie gęstości przeciwciał	Corning	3896
Niefunkcjonalizowane kulki krzemionkowe	Bangs Laboratories	Probówki FACS do oznaczania gęstości przeciwciał	SS06N
	Fisher Scientific	14-959-2A	Oznaczanie gęstości przeciwciał
Koraliki QuantumTM MESF	Bangs Laboratories	Oznaczanie zmiennej	gęstości przeciwciał
Kazeina	Sigma-Aldrich	C0875	Preparat dwuwarstwowy lipidowy
HEPES buforowany sól fizjologiczna + 1% HSA	Domowy		preparat dwuwarstwowy lipidowy
Streptawidyna	Technologie życiowe	434301	Preparat dwuwarstwowy lipidów
Białko biotynylowane znakowane fluorescencyjnie	Domowy		dwuwarstwowy preparat lipidowy
ibidi Sticky-Slide VI 0,4	ibidi	80608	Preparat dwuwarstwowy lipidowy
25x75 mm szklane szkiełko nakrywkowe	ibidi	10812	Dwuwarstwowy preparat lipidowy
Nadtlenek wodoru (30%)	Fisher Scientific	BP2633	Preparat dwuwarstwowy lipidowy
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	258105	Preparat dwuwarstwowy lipidowy
D-Biotyna	Invitrogen	B20656	Preparat dwuwarstwowy lipidów
Papier do soczewek	VWR	54826-001	Do obrazowania
Olejek immersyjny typu F Leica		11 513 859	Do obrazowania
Mikroskop Leica TCS STED	Leica		Do obrazowania