Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

badanie granulek wydzielniczych komórek tucznych; od biosyntezy do egzocytozy

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52505

⸱

26 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

W tym artykule

Podsumowanie

Celem obecnego protokołu było opracowanie metody, która pozwoli na funkcjonalne analizy genomiczne wydzielania komórek tucznych. Protokół opiera się na ilościowej ocenie uwalniania fluorescencyjnego genu reporterowego skotransfekowanego z genem będącym przedmiotem zainteresowania oraz analizach morfologii granulki wydzielniczej w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Komórki tuczne (MC) to komórki wydzielnicze układu odpornościowego, które realizują swoje fizjologiczne i patologiczne funkcje poprzez uwalnianie wstępnie uformowanych i nowo zsyntetyzowanych mediatorów alergicznych, zapalnych i immunoregulacyjnych. Mediatory MC wpływają na wiele tkanek i narządów, prowadząc do reakcji alergicznych i immunologicznych. Synteza, magazynowanie i uwalnianie mediatorów MC są ściśle regulowane. Wstępnie uformowane mediatory są upakowane w cytoplazmatyczne ziarnistości wydzielnicze (SG), które łączą się z błoną plazmatyczną i uwalniają swoją zawartość przez regulowaną egzocytozę. Przedstawiamy protokół oparty na koekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania z genem reporterowym, który jest ukierunkowany na SG i jest uwalniany w regulowany sposób wraz z endogennymi mediatorami SG. Protokół umożliwia czterowymiarowe analizy konfokalne MC SG o wysokiej rozdzielczości i monitorowanie ich osi czasu od biogenezy do wyzwolonej egzocytozy. W związku z tym wykorzystanie tego protokołu do badań przesiewowych genów będących przedmiotem zainteresowania pod kątem ich fenotypowego i funkcjonalnego wpływu pozwala na rozszyfrowanie mechanizmów molekularnych rządzących biogenezą i egzocytozą MC SG oraz zidentyfikowanie zaangażowanych regulatorów. W związku z tym należy uzyskać dalsze informacje na temat mechanizmów komórkowych, które odpowiadają za funkcję MC w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Komórki tuczne (MC) to komórki odpornościowe, które są najbardziej znane ze swojego udziału w reakcjach alergicznych i zapalnych, takich jak zapalenie stawów, astma, eozynofilowe zapalenie przełyku, przewlekłe zapalenie skóry i wstrząs anafilaktyczny 1,2, a także inne patologie, w tym choroba wieńcowa 3,5 i rak 3,4. Ponadto MC odgrywają ważną rolę w odporności wrodzonej i nabytej, zarówno w obronie gospodarza przed bakteriami i pasożytami, jak i poprzez tłumienie odpowiedzi immunologicznej, na przykład indukowanie tolerancji przeszczepu allogenicznego 5,6 .

MCs wywodzą się ze szpiku kostnego, rozwijając się z pluripotencjalnych komórek progenitorowych CD34+/CD117+ 7. Zaangażowane komórki progenitorowe MC szpiku kostnego są uwalniane do krwiobiegu i migrują do tkanek obwodowych, zlokalizowanych głównie w tkankach łącznych i powierzchniach nabłonka 8. Dojrzewanie i różnicowanie końcowe osiąga się ostatecznie pod wpływem cytokin w otaczającym środowisku 8,9 .

MCs mogą być aktywowane przez alergen (antygen, Ag), którego spotkanie spowodowało wytworzenie przeciwciał typu immunoglobulina E (IgE). Wiązanie takich IgE z receptorami FcεRI MC, a następnie sieciowanie IgE związanych z komórkami po ponownym narażeniu na ten sam Ag, powoduje agregację FcεRI i inicjację kaskady sygnalizacyjnej, która kończy się degranulacją komórki [przegląd w 10,11]. MC są również aktywowane, niezależnie od IgE, przez neuropeptydy 5,12, toksyny 13 , antygeny bakteryjne i wirusowe 14,15, szereg dodatnio naładowanych peptydów określanych zbiorczo jako podstawowe sekretagogi, komórki odpornościowe i cytokiny 5,13,12,16,17. MC są również aktywowane przez wiele uwolnionych przez siebie mediatorów, które dodatkowo wzmacniają odpowiedź zapalną.

MCs są wypełnione granulkami wydzielniczymi (SG), które zawierają mediatory immunoregulacyjne, w tym aminy wazoaktywne, takie jak histamina i serotonina (u gryzoni), proteoglikany, proteazy, takie jak chymaza i tryptaza, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego oraz kilka cytokin i chemokin 8,9. Mediatory te są "gotowe do pracy" i gdy MC zostaną aktywowane przez odpowiedni bodziec, mediatory te są uwalniane z komórek przez regulowaną egzocytozę (degranulację) w ciągu kilku sekund do minut 18,19. Po tym początkowym zdarzeniu następuje synteza de novo i uwolnienie szerokiego wachlarza biologicznie silnych substancji, w tym metabolitów kwasu arachidonowego, wielu cytokin i chemokin 20,21,22. Uwolnienie nowo zsyntetyzowanych produktów następuje niezależnie od wydania SG. Łącznie mediatory te inicjują wczesną i późną fazę reakcji zapalnych i alergicznych. Dlatego zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za aktywację i degranulację MC ma znaczenie zarówno teoretyczne, jak i kliniczne.

Trudność w genetycznym manipulowaniu pierwotnymi i hodowanymi MC utrudniła próby wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw degranulacji MC, które pozostały słabo rozwiązane. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy test reporterowy poprzez kotransfekcję linii komórek tucznych błony śluzowej, szczurzej białaczki zasadochłonnej (RBL)-2H3 (zwanej dalej RBL) lub MC pochodzących ze szpiku kostnego (BMMC) 30 z genem będącym przedmiotem zainteresowania i neuropeptydem Y (NPY) połączonym z monomerycznym RFP (mRFP), jako reporter SG.

NPY wcześniej wykazywał, że podsumowuje zachowanie endogennych markerów SG w innych systemach. Ponadto, ponieważ fluorescencja mRFP jest niewrażliwa na pH, ekspresja NPY-mRFP umożliwia wizualizację kwaśnych SG, a także ilościową ocenę egzocytozy za pomocą 96-dołkowych płytek i czytnika płytek fluorescencyjnych. Wykazaliśmy, że NPY-mRFP jest dostarczany do kwaśnych SG komórek RBL i BMMC i jest uwalniany z komórek w regulowany sposób wraz z endogennym ładunkiem SG (tj. β-heksosaminidazą i serotoniną) 30,32 . Protokół ten zapewnia metodologię opartą na obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości, która umożliwia badanie przesiewowe genów będących przedmiotem zainteresowania pod kątem ich fenotypowego i funkcjonalnego wpływu na charakterystykę SG i degranulację w komórkach RBL 32. W szczególności protokół ten umożliwia śledzenie MC SG w czasie rzeczywistym i ilościowe określenie ich powierzchni lub objętości, ich liczby, kinetyki składania, ich ruchu wzdłuż cytoszkieletu komórki i ich ostatecznej fuzji z błoną plazmatyczną w różnych warunkach. Na przykład uwrażliwienie komórek na IgE specyficzne dla DNP i wyzwalanie komórek za pomocą wielowartościowej Ag (DNP sprzężonej albuminy surowicy) pod różnymi zaburzeniami (tj. knockdown genów będących przedmiotem zainteresowania, nadmierna ekspresja wt lub zmutowanych genów lub manipulacje farmakologiczne) i w porównaniu z komórkami kontrolnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórek RBL

  1. Wymieszaj 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco o niskim poziomie glukozy z 56 ml płodowej surowicy bydlęcej (daje to 10% FBS), a następnie dodaj 5,5 ml streptomycyny penicyliny (daje to ~1% PEST).
  2. Przefiltruj media za pomocą butelkowych filtrów próżniowych o pojemności 500-1 000 ml z porami o wielkości porów 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.

2. Hodowla komórek RBL

  1. Hodować komórki RBL w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C na płytkach lub kolbach. Komórki RBL, które rosną na 10 cm płytkach, należy uzupełnić 10 ml pożywki i utworzyć zlewającą się monowarstwę ~107 komórek/płytkę.
  2. Gdy warstwa komórkowa zbliża się do konfluencji, ponownie pokryj kulturę o mniejszej gęstości.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki/kolby za pomocą sterylnej pipety Pasteura podłączonej do próżni.
    2. Przepłukać monowarstwę komórek wstępnie podgrzaną (37 °C) 0,25% trypsyną/EDTA, która pokrywa całą monowarstwę (objętość zależy od wielkości płytki hodowlanej/kolby; 2 ml na płytkę 10 cm). Spowoduje to odłączenie komórek.
    3. Alternatywnie, przepłukać monowarstwę komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), usunąć PBS i dodać wstępnie podgrzaną (37 °C) trypsynę/EDTA. Ten krok powoduje szybsze odłączenie komórek.
    4. Umieścić płytkę/kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C (nie dłużej niż 10 minut).
    5. Sprawdź komórki pod mikroskopem optycznym, aby sprawdzić, czy się odłączyły. Jeśli komórki nie oderwały się po 10 minutach, delikatnie postukaj w płytkę/kolbę.
    6. Dodać pożywkę do płytki hodowlanej/kolby, aby zawiesić komórki (objętość pożywki powinna być co najmniej 2-krotnie większa niż objętość roztworu trypsyny).
    7. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 3 minuty w temperaturze 200 g w temperaturze 25 °C.
    8. Ponownie zawiesić komórki w pożywce. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 i wysiać w nowym naczyniu hodowlanym. Inkubuj komórki przez 48-72 godziny, aż osiągną około 90% zbieżności.
    9. Powtarzać tę samą procedurę (sekcja 2.2.1-2.2.8) przez okres do 3 miesięcy (30 pasaży).

3. Przygotowanie mediów transfekcyjnych.

  1. Przygotować 100 mM roztwór K-Pipes o pH 7, 1 mM roztwór octanu Ca2+ i 100 mM roztwór octanu Mg2+.
  2. Rozcieńczyć 100 mM roztwór K-Pipes o pH 7 do 20 mM za pomocą pożywki DMEM, dodać 1 mM roztwór octanu Ca2+ do końcowego stężenia 10 μM i 100 mM roztwór octanu Mg2+ do końcowego stężenia 2 mM.
  3. Zważyć glutaminian potasu i dodać do roztworu do końcowego stężenia 128 mM, dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Pozostałe roztwory (tj. rurki K, octan Ca2+, octan Mg2+) należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Transfekcja komórek RBL

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki/kolby za pomocą sterylnej pipety Pasteura podłączonej do próżni.
  2. Przepłucz monowarstwę komórek wstępnie podgrzaną (37 °C) trypsyną/EDTA, która powinna pokryć całą monowarstwę. Umieścić płytkę/kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C (nie dłużej niż 10 minut). Sprawdź, czy komórki się odczepiły za pomocą mikroskopu optycznego.
  3. Dodać pożywkę do płytki hodowlanej/kolby, aby zawiesić komórki (objętość pożywki powinna być co najmniej 2-krotnie większa niż objętość roztworu trypsyny).
  4. Policz numer komórki za pomocą hemocytometru.
  5. Osad 1,5 ×10 7 komórek przez odwirowanie przez 3 minuty w temperaturze 200 x g w temperaturze 25 °C. Odrzucić supernatanty i dodać 280 μl pożywki transfekcyjnej. Przenieść mieszaninę reakcyjną do kuwety o średnicy 4 mm.
  6. Dodać 20 μg plazmidu NPY-mRFP i 30 μg pustego plazmidu kontrolnego lub badanego plazmidu. Ostateczna objętość mieszaniny reakcyjnej powinna wynosić 300 μl.
  7. Natychmiast umieścić na lodzie na 10 minut. Wytrzyj kuwetę z resztek wody i przystąp do elektroporacji przy napięciu 300 V przez 9 ms.
  8. W celu pomiaru egzocytozy należy natychmiast ponownie umieścić komórki w 24-dołkowych szalkach do hodowli tkankowych zawierających 300 μl pożywki. Dodać 8 μl mieszaniny reakcyjnej (4 × 105 komórek) do każdego dołka. Dodaj 4 × 105 nietransfekowanych komórek do dodatkowych studzienek w celu kontroli. Przygotuj wystarczającą liczbę studzienek, aby mieć co najmniej zduplikowane studzienki dla każdego zabiegu dla każdej transfekcji.
  9. W przypadku mikroskopii poklatkowej należy natychmiast ponownie pokryć komórki w 8-dołkowym systemie borokrzemianowego szkła nakrywkowego zawierającym 80 μl pożywki. Dodać 1,5 μl mieszaniny reakcyjnej (7,5 ×10 4 komórek) do każdej komory. (Staraj się unikać używania komór na krawędzi szkła nakrywkowego, komory na środku szkła nakrywkowego są łatwiejsze do zobrazowania).
    UWAGA: Co ważne, nie wszystkie komórki reagują na wyzwalacz i czasami mikroskopia poklatkowa jest zniesiona z powodu utraty ostrości i dryfu 8-dołkowego systemu borokrzemianowego szkła ochronnego. Dlatego należy przygotować co najmniej 8 komór dla każdego zabiegu dla każdej transfekcji.
  10. W celu uwrażliwienia komórek na aktywację za pośrednictwem FcεRI, dodaj 1 μg/ml mysich monoklonalnych IgE specyficznych dla DNP do pożywki (inkubuj komórki z IgE przez co najmniej 2 godziny).
  11. Po 18-24 godzinach użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić, że komórki wyrażają plazmidy. Długości fal wzbudzenia i emisji fluorescencji mRFP wynoszą: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-mRFP powinien pojawić się w strukturach pęcherzykowych, które odpowiadają SGs. Jeśli drugi gen będący przedmiotem zainteresowania zostanie połączony ze znacznikiem fluorescencyjnym, użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić koekspresję obu plazmidów w tych samych komórkach. Na przykład, jeśli badany gen jest połączony z GFP, długości fal wzbudzenia i emisji fluorescencji GFP wynoszą: λEx 488, λEm 507 nm. Białko znakowane GFP powinno pojawić się w tych samych komórkach, które wyrażają NPY-mRFP.
  12. W przypadku pomiarów egzocytozy przejdź do kroku 5, a w przypadku mikroskopii poklatkowej przejdź do kroku 6.

5. Pomiar egzocytozy NPY-mRFP

  1. Przygotowanie bufora Tyrode:
    1. Przygotować roztwór 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl i 8 mM NaH2PO4 w DDW. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten krok służy do przygotowania bufora 20x Tyrode.
    2. Przygotować roztwór 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA, 5,6 mM glukozy i 1 do 20 rozcieńczenia Tyrode 20x w DDW i dobrze wymieszać. Ten krok służy do przygotowania 1x bufora Tyrode.
    3. Podzielić się 1x buforem Tyrode i przechowywać w temperaturze -20 °C. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 24-dołkowej i przemyć 3 razy buforem Tyrode. Przygotuj niestymulowane komórki, dodając 200 μl buforu tyrolskiego do studzienek kontrolnych.
  3. Przygotować 10 μl/basenik 20X stężonego odczynnika aktywującego [(np. 1 000 ng/ml DNP-BSA lub DNP-HSA (Ag), 200 μM Ca2+jonofor (np. A23187) oraz kombinację 20 μM Ca2+ jonoforu i 1 000 nM 12-O-tetradekanoiloforbol-13-octanu (TPA)]. Jeżeli odczynniki są przechowywane w DMSO, rozcieńczyć je do 20-krotnego stężenia w buforze Tyrode zawierającym 1% DMSO. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Ostrożnie usunąć supernatanty z każdej studzienki na płytkę 96-dołkową, umieścić na lodzie i unikać światła. (Supernatanty zawierają chimeryczny peptyd NPY-mRFP, który został uwolniony z komórek).
  5. Dodać 200 μl buforu Tyrode zawierającego 0,5% Triton X-100 do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut (Ten etap jest ważny dla przygotowania lizatów komórkowych zawierających pozostałą część NPY-mRFP, która nie została uwolniona z komórek). Zebrać lizaty komórkowe i przenieść na płytkę 96-dołkową, umieścić na lodzie i unikać światła.
  6. Zmierzyć fluorescencję supernatantów komórkowych i lizatów komórkowych za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, przy użyciu filtra wzbudzenia o szerokości pasma 590, 20 nm i filtra emisyjnego o szerokości pasma 635, 35 nm.
  7. Obliczać procent wydanych NPY-mRFP:
    UWAGA: Czytnik fluorescencji mierzy dowolne jednostki fluorescencji (AFU). Wartości AFU zależą od maszyny i jej czułości oraz wydajności transfekcji.
    1. Ustaw autofluorescencję nietransfekowanych komórek RBL jako pustą. Podzielić AFU każdego supernatantu na całkowitą fluorescencję (AFU supernatantów + AFU odpowiedniego lizatu) i pomnożyć przez 100.

6. Mikroskopia poklatkowa egzocytozy

  1. Nasiona 7,5 × 104 transfekowanych komórek/komory w systemie szkła borokrzemianowego z 8 dołkami. Po 18-24 godzinach wyjmij pożywkę hodowlaną z komór i przemyj 3 razy buforem Tyrode
  2. Do każdej komory dodać 72 μl buforu Tyrode. Rozcieńczyć odczynniki aktywujące w buforze Tyrode do stężenia 10x.
  3. Użyj konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w podgrzewaną komorę (37 °C) i kontroler CO2 (4,8%) oraz obiektyw 40X lub 63X. Włącz systemy mikroskopowe: lampę rtęciową, komputer i lasery. Przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że podgrzewana komora ma odpowiednią temperaturę.
  4. Umieść komorę w podgrzewanej komorze i upewnij się, że komora jest prawidłowo i stabilnie zainstalowana.
  5. Włącz światło fluorescencyjne zgodnie z odpowiednim fluoroforem i wizualizuj transfekowane komórki. Wyłącz fluorescencję, gdy komórka będąca przedmiotem zainteresowania znajdzie się w terenie, aby zminimalizować bielenie i cytotoksyczność. Ważne jest, aby to pole zawierało około 2-3 transfekowanych komórek. Transfekowane komórki powinny być dobrze rozłożone, ale nie stykać się ze sobą.
  6. Dostosuj moc lasera (w zależności od mikroskopu), aby zminimalizować szum i przesycenie, a także toksyczność, a także ustaw wzmocnienie i przesunięcie, aby zmodyfikować stosunek sygnału do szumu. Skanuj szybko, aby zminimalizować czas ekspozycji lasera (średnio 2).
  7. Dostosuj rozmiar otworu do maksimum, co umożliwia zmniejszenie mocy lasera i utrzymanie ostrości obrazów przez długi czas. W razie potrzeby ustaw parametry stosu Z, aby zrekonstruować obraz w trzech wymiarach, dostosuj rozmiar otworka do 1 jednostki przewiewnej (AU), która daje najlepszy stosunek sygnału do szumu i uzyskaj kolejne skanowanie dwuwymiarowych konfokalnych warstw optycznych w osiach z warstwami optycznymi ≤0,7 μm.
  8. Ustaw interwał między każdą akwizycją na 15-30 sekund, a czas trwania całkowitej akwizycji na 15 minut i rozpocznij pobieranie obrazów. Po 5 minutach od akwizycji wstrzymaj szereg czasowy. Dodaj 8 μl spustu 10x i natychmiast kontynuuj akwizycję.
  9. Zapisz zdjęcia, wykonaj dekonwolucję za pomocą oprogramowania do dekonwolucji i zrekonstruuj stosy do trójwymiarowych obrazów i do filmu za pomocą oprogramowania Imaris.

7. Analizy obrazów

  1. Zaimportuj dane z dekonwolucyjnych obrazów szeregów czasowych, które zostały uzyskane przez konfokalny mikroskop fluorescencyjny, do oprogramowania Imaris. To oprogramowanie odczytuje ponad 40 plików mikroskopowych. Jeśli oprogramowanie nie może odczytać plików; Konwertuj pliki na pliki TIF i importuj.
  2. Aby dodać punkty czasowe na końcu otwartego zestawu danych, naciśnij edytuj -> Dodaj punkty czasowe i zaimportuj nowy zestaw danych.
  3. Utwórz powierzchnię kanału mRFP za pomocą opcji kreatora powierzchni. Wybierz algorytm domyślny. Wybierz kanał NPY-mRFP. Zaznacz opcję wygładzania, aby zredukować szum. Aby uniknąć utraty drobnych szczegółów, zmniejsz poziom szczegółowości obszaru do 0,05 μm.
  4. Ustaw próg intensywności. Zostanie wyświetlona nowa szara powierzchnia. Przejdź do "Ustawień" i zmień styl z "Punkt środkowy" na "Powierzchnia".
  5. Przejdź do zakładki statystyka we właściwościach wybranego obiektu, wybierz zakładkę szczegóły i konkretną wartość taką jak intensywność fluorescencji, objętość itp.
  6. Przejrzyj dane i upewnij się, że wartości są zgodne z obrazami. Na przykład, dwie lub więcej sąsiednich granulek może być mierzonych jako jedna większa granulka. Aby określić ilościowo średnią wielkość granulek, podziel rozmiar połączonych granulek na rzeczywistą liczbę granulek.
  7. Eksportuj żądane zestawy danych do plików Excel i analizuj dane.
Z

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ze względu na niską wydajność transfekcji MC, manipulacje genetyczne prawdopodobnie nie wpłyną na odczyty średniej sekrecji mierzonej przez endogenne mediatory SG. Niemniej jednak, dzięki ustanowieniu pełnej koekspresji genu reporterowego NPY-mRFP i kotransfekowanego plazmidu w tych samych komórkach, monitorowanie NPY-mRFP pozwala na śledzenie wyłącznie populacji komórek wykazujących ekspresję badanego genu. Zatem zaletą tego testu w porównaniu z metodami konwencjonalnymi jest możliwość selektywnego monitorowania komórek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy innowacyjną strategię, która łączy kwantyfikację egzocytozy MCs i kwantyfikację czterech (x, y, z, t) wymiarów za pomocą poklatkowego trójwymiarowego obrazowania SG w żywych komórkach przy użyciu genu reporterowego dla egzocytozy. Technika ta umożliwia badania przesiewowe rodzin białek pod kątem ich wpływu na funkcję MC, takie jak monitorowanie SG już od momentu ich wyjścia z Golgiego, poprzez dojrzewanie, nabywanie kompetencji egzocytozy i degranulację. Połączenie pomiarów egzocytozy z charakterystykami morfom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. U. Ashery za dar NPY-mRFP cDNA. Dziękujemy doktorom M. J. Kofronowi, L. Mittlemanowi, M. Shaharbani i Y. Zilbersteinowi za nieocenioną pomoc w mikroskopii i analizach obrazu. Dziękujemy również dr Josephowi Orly'emu za krytyczną lekturę tego manuskryptu. Praca ta została wsparta grantem z Izraelskiej Fundacji Naukowej, założonej przez Izraelską Akademię Nauk (1139/12 do RS-E.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMSigma-AldrichD6046-500MLCiepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem
Surowica bydlęcapłodu GE opieka zdrowotna Nauki przyrodniczeSH30071.01
Penicylina-StreptomycynaTechnologie
Membrana z octanu celulozy, wielkość porów 0,22  μ mSigma-AldrichCLS430769-1EA
Naczynia hodowlane poddane kulturze tkankowej CorningSigma-AldrichCLS430167
Trypsina/EDTA Roztwór (TE)Technologie życiaR001100Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
RURY sól dipotasowaSigma-Aldrich108321-27-3 
Octan wapnia (hydratSigma-Aldrich114460-21-8
Octan magnezu (tetrahydratSigma-AldrichM5661 
Kwas L-glutaminowy jednowodny sól potasowa (glutaminian potasu)Sigma-AldrichG1501
mm kuwety do elektroporacjiprojekty ogniwEP-104
GENE PULSER Z KONTROLEREM IMPULSÓW I CAPACITANCEBio rad
Komorowe szkło nakrywkoweThermo scientific155411
24-dołkowe, płaskie dnoPłytki Sigma-AldrichCLS3524
Corning 96 dołkowe CzytnikSigma-AldrichCLS3367 lub CLS390
96-dołkowy - Infinite 200Tecan
Jonofor wapniowy A23187Sigma-AldrichC7522Unikać bezpośredniej ekspozycji na światło
Octan 12-O-tetradekanylo-13 (TPA)CalbiochemP3766
anty-DNP monoklonalny IgESigma-AldrichD8406 
DNP-BSA/ DNP-HASSigma-AldrichA6661Unikać bezpośredniej ekspozycji na światło
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787
Konfokalny mikroskop
Zeiss LSM 510
LeicaSP5
Nikon A1 odwrócony
Imaris oprogramowanieBITLANE
Microsoft exel lub Prism lub inne oprogramowanie
Inne odczynniki:
Chlorek magnezuMERK5833
Chlorek soduMERK6404
Chlorek wapnia MERK2382
Albumina surowicy bydlęcej Sigma-AldrichA4503
GlukozaBDH Laboratories284515V
Fosforan monosodu MERK5345
Sterylna woda
życiowe) ) 4 fluorescencyjny fluorescencyjny: analityczne

Bibliografia

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214(2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134(2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biogeneza ziarnistek wydzielniczychregulowana egzocytozamikroskopia konfokalnafluorescencyjny gen reporterowykoekspresja genówanaliza morfometrycznapomiar intensywności fluorescencjistymulacja jonoforem wapniowymmutant Rab5
badanie granulek wydzielniczych komórek tucznych; od biosyntezy do egzocytozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.