Artykuł metodologiczny

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

21.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52506

⸱

29 stycznia 2015

 , 
1Department of Physiology, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

Streszczenie

Zachowania odruchowe jelita są kontrolowane przez jelitowy układ nerwowy (ENS). ENS to integracyjna sieć neuronów i komórek glejowych w dwóch splotach zwojowych umieszczonych w ścianie jelita. Neurony jelitowe i glej jelitowy są jedynymi typami komórek w zwojach jelitowych. Aktywność neuronów jelitowych i gleju jest odpowiedzialna za koordynację funkcji jelit. Protokół ten opisuje metody obserwacji aktywności neuronów i gleju w nienaruszonym ENS poprzez obrazowanie wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia (Ca2+) za pomocą fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych. Nasza dyskusja techniczna koncentruje się na metodach obrazowaniaCa2+ w preparatach do pełnego montażu splotu mięśniowo-jelitowego z jelita gryzonia. Masowe ładowanie całych mocowań ENS ze wskaźnikiem Ca2+ o wysokim powinowactwie, takim jak Fluo-4, pozwala na pomiary odpowiedzi Ca2+ w pojedynczych neuronach lub komórkach glejowych. Reakcje te mogą być wywoływane wielokrotnie i niezawodnie, co pozwala na badania ilościowe z wykorzystaniem narzędzi farmakologicznych. Odpowiedzi Ca2+ w komórkach ENS są rejestrowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Pomiary fluorescencji uzyskane za pomocą obrazowania Ca2 + w preparatach do montażu całego oferują prosty sposób na scharakteryzowanie mechanizmów i potencjalnych konsekwencji funkcjonalnych odpowiedzi Ca2 + w neuronach jelitowych i komórkach glejowych.

Wprowadzenie

Jelitowy układ nerwowy (ENS) jest zorganizowany w dwa zwojowe sploty osadzone w ścianie przewodu pokarmowego 1. Te wewnątrzmięśniowe obwody nerwowe, splot mięśniowo-jelitowy (MP) i splot podśluzówkowy (SMP), składają się z neuronów i gleju jelitowego (ryc. 1) 2. MP i SMP regulują funkcje przewodu pokarmowego (GI), takie jak odpowiednio motoryka jelit oraz wchłanianie i wydzielanie nabłonka 3. Glej jelitowy znajduje się w bliskim sąsiedztwie neuronów w zwojach, ale populacje gleju jelitowego istnieją również w łączących się drogach włóknistych i pozazwojowych częściach ściany jelita 3,4. Pierwotnie uważano, że glej jelitowy zapewnia neuronom jedynie wsparcie odżywcze. Jednak ostatnie badania zdecydowanie sugerują, że interakcje neuron-glej są niezbędne dla funkcji ENS 5,6. Na przykład dane pokazują, że glej jelitowy "słucha" aktywności neuronalnej 7 i moduluje obwody neuronalne 6,8, chroni neurony jelitowe przed stresem oksydacyjnym 9 i jest zdolny do generowania nowych neuronów jelitowych w odpowiedzi na uraz 10,11. Protokół przedstawiony w niniejszym przeglądzie technicznym zapewnia prostą i solidną metodę badania złożonych interakcji między neuronami a glejem jelitowym przy użyciu wewnątrzkomórkowego obrazowania Ca2 + in situ.

Ca2+ jest wszechobecną cząsteczką sygnałową w pobudliwych komórkach i odgrywa istotną rolę w sygnalizacji synaptycznej w układzie nerwowym 12. Pobudzenie neuronów lub gleju jelitowego powoduje wzrost cytoplazmatycznego stężenia Ca2 + poprzez napływ przez kanały przepuszczalne Ca2 + lub uwalnianie Ca2 + z wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia. Obrazowanie stanów przejściowych Ca2+ w neuronach i gleju za pomocą barwników fluorescencyjnych jest uznaną i szeroko stosowaną techniką do badania funkcjonalnej organizacji i dynamiki ENS 13-17. Wykazano, że obrazowanie Ca2 + jest ważnym narzędziem w badaniu nienaruszonych segmentów tkanki przewodu pokarmowego w celu wyjaśnienia rozprzestrzeniania się pobudliwości przez sieci rozruszników ICC 18 i mięśnie gładkie jelit 19,20. Umożliwia naukowcom badanie szerokiego spektrum parametrów fizjologicznych i dostarcza informacji zarówno o ich rozmieszczeniu przestrzennym, jak i dynamice czasowej. Komórki mogą być skutecznie barwione w minimalnie inwazyjny sposób przy użyciu przepuszczalnych dla błony wskaźników fluorescencyjnych i zoptymalizowanych protokołów barwienia 21. Daje to możliwość monitorowania dużej liczby neuronów i gleju jelitowego w funkcjonalnie zachowanych preparatach 14-16,22, a także in vivo 23. Preparaty tkankowe typu całomocowanego są masowo obciążone barwnikiem wskaźnikowym Ca2 + o wysokim powinowactwie, takim jak Fluo-4, który zwiększa jego fluorescencję po związaniu z Ca2+. Zmiany fluorescencji są rejestrowane przez kamerę CCD i analizowane cyfrowo 6. Pojawienie sięCa2+ dało możliwość monitorowania interakcji neuronów i komórek glejowych, reakcji na różne bodźce oraz udziału tych typów komórek w procesach żołądkowo-jelitowych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie in situ Ca2+ dostarczyło ogromnego wglądu w mechanizmy sygnalizacji neuronów jelitowych i gleju i posiada kilka wyraźnych zalet w porównaniu z modelami hodowli komórkowych 6,24. Po pierwsze, preparaty in situ utrzymują natywne środowisko macierzy neuronów i gleju oraz pozostawiają nienaruszoną większość ich połączeń z tkanką docelową. Po drugie, genetyka i morfologia hodowanego gleju jelitowego są znacznie zmienione w porównaniu z in vivo 6,24. Po trzecie, wiele interakcji heterotypowych jest traconych w pierwotnej hodowli komórkowej, co ogranicza ocenę interakcji komórka-komórka. Chociaż hodowane komórki dobrze nadają się do badania podstawowych właściwości, ich przydatność do badania złożonych interakcji między glejem jelitowym a neuronami jest ograniczona. Badanie interakcji neuron-glej przy użyciu podejścia in situ jest bardziej istotne z fizjologicznego punktu widzenia, ponieważ szlaki synaptyczne pozostają nienaruszone 25. W porównaniu z metodami opartymi na hodowlach komórkowych, podejście in situ zapewnia lepsze warunki do systematycznego zrozumienia skomplikowanych interakcji między neuronami a glejem jelitowym. Co więcej, płaska organizacja splotu zwojowego w preparatach do pełnego montażu jest idealna do obrazowania fluorescencyjnego wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2 +, a technika ta zapewnia proste podejście do oceny aktywności neuronów glejowych w ENS.

Protokół

UWAGA: Następujące procedury z wykorzystaniem tkanek pochodzących od zwierząt laboratoryjnych są zgodne z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt 2013 i zostały wcześniej zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Stanowego Michigan.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Znieczulenie zwierzęcia badawczego w komorze zawierającej 2,5% izofluranu w tlenie lub poprzez umieszczenie 3-5 ml ciekłego izofluranu na materiale chłonnym na podłodze komory, upewniając się, że fizyczna bariera zapobiega bezpośredniemu kontaktowi zwierząt z izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając podnóżek.
    UWAGA: Głębokość znieczulenia jest uważana za odpowiednią, gdy nie ma odruchu wycofania kończyny tylnej. Po odpowiednim znieczuleniu należy poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy
  2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i oczyść skórę brzucha 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć skórę brzucha w linii środkowej i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać 6-centymetrowe nacięcie przyśrodkowe wzdłuż kresy białej, aby odsłonić wewnętrzne narządy trawienne.
  3. Użyj kleszczy, aby zlokalizować i odsłonić jelito kręte wewnątrz otrzewnej. Przetnij krezkę jelita krętego/okrężnicy nożyczkami i zacznij rozplątywać jelito.
  4. Gdy długość jelita zostanie odpowiednio rozplątana, przeciąć jelito dystalnie do żołądka i proksymalnie do jelita ślepego w celu przygotowania jelita krętego. W celu przygotowania jelita grubego należy przeciąć okrężnicę dystalnie do jelita ślepego i proksymalnie do odbytnicy.
  5. Szybko usunąć odcinek jelita i umieścić go w zlewce z pożywką DMEM/F12 uzupełnioną 3 μM chlorowodorkiem nikardypiny i 1 μM chlorowodorkiem skopolaminy (zwanymi dalej "pożywką") na lodzie. Dodatek tych inhibitorów ułatwia mikrodysekcję i późniejsze obrazowanie poprzez paraliż mięśni gładkich jelit.
  6. Wytnij interesujący Cię segment (np. jelito czcze, jelito kręte, dystalną lub proksymalną okrężnicę) na podstawie ustalonych markerów anatomicznych. Zazwyczaj wykorzystuje się tkankę z dystalnego odcinka jelita krętego lub dystalnej okrężnicy. Należy jednak użyć tej samej podstawowej procedury, aby wyizolować, załadować i zobrazować neurony mięśniowo-jelitowe i glej we wszystkich regionach jelitowych.
  7. Usuń mały segment (4-6 cm) pożądanego odcinka jelita i umieść na szalce Petriego pokrytej Sylgardem wypełnionej schłodzonym podłożem.
  8. Zabezpiecz proksymalne i dystalne końce odcinka jelitowego za pomocą szpilek przeciw owadom i otwórz rurkę jelitową, wykonując proste, wzdłużne cięcie wzdłuż granicy krezki.
  9. Przypnij tkankę płasko pod lekkim napięciem błoną śluzową do góry i ostrożnie wypreparuj warstwę błony śluzowej za pomocą cienkich kleszczyków (najlepiej sprawdzają się #5 i #5/45) i bardzo cienkich nożyczek sprężynowych.
    UWAGA: Usunięcie błony śluzowej może być dość traumatyczne dla ENS, jeśli nie zostanie wykonane prawidłowo. W przypadku preparatów wysokiej jakości należy pamiętać o ograniczeniu nagłego usuwania błony śluzowej przez złuszczanie lub skrobanie. Najlepszą praktyką jest uniesienie błony śluzowej i przecięcie pod spodem cienkimi nożyczkami.
  10. Pokrój tkankę na mniejsze preparaty (około 0,5cm2) i włóż do naczyń obrazowych (4 rogi z okrężną warstwą mięśni skierowaną do góry) umieszczonych na lodzie ze świeżą pożywką.
  11. Ostrożnie wypreparuj mięsień okrężny, rozsuwając go drobną pęsetą, aby odsłonić splot mięśniowo-jelitowy. Unikaj nadmiernego rozciągania.
  12. Umieść naczynie do obrazowania z powrotem na lodzie i zmień roztwór na świeże podłoże.
  13. Przygotuj 2 ml mieszanki enzymów na naczynie [Dżupa 1 j./ml (4,48 mg/8 ml), kolagenaza typu II 150 j./ml (5,45 mg/8 ml) w pożywce].
  14. Wyjmij naczynia z lodu i dodaj mieszankę enzymów z kroku 1.13.
  15. Inkubować naczynia w temperaturze pokojowej przez 15 minut z 5% CO2 / 95% powietrzem.
  16. Umyj preparaty chusteczek higienicznych pożywką 3 razy i ponownie przypnij rogi.

2. Ładowanie barwnika Fluo-4

UWAGA: Unikaj fotowybielania, pracując przy ograniczonym oświetleniu podczas pracy z barwnikami fluorescencyjnymi i tkankami wypełnionymi barwnikami wskaźnikowymi.

  1. Przygotować 4 μM roztwór ładujący Fluo-4.
    1. Dodać 1,5 ml pożywki i 1,2 μl 250 mM wywaru probenecydowego do 1,5 μl podwielokrotności 4 mM bulionu Fluo-4. 4 mM bulionu Fluo-4 przygotowuje się przez dodanie 11,4 μl pluronu F-127 (20% w DMSO; uzupełniony 0,25% kremafor-EL) do 50 μg Fluo-4, AM.
  2. Preparaty do inkubacji w roztworze ładującym Fluo-4 należy inkubować przez 45 minut w ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  3. Wyjąć z inkubatora i przemyć preparaty pożywką 3 razy.
  4. Zamianę pożywki na pożywki zawierające 200 μM probenecydu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C przed obrazowaniem.
    UWAGA: Probenecyd jest lekiem, który hamuje transportery oporności wielolekowej w neuronach. Dodanie tego leku hamuje zdolność neuronów do wytłaczania barwników i zwiększa znakowanie neuronów. Ładowanie masowe barwników wskaźnikowych Ca2+ przy braku probenecydu powoduje głównie obciążenie komórek glejowych. Dodatek probenecydu pozwala na wizualizację odpowiedzi neuronalnych i glejowych.
  5. Przygotuj zmodyfikowany bufor Krebsa.
    1. Sporządzić zmodyfikowany bufor Krebsa w taki sposób, aby końcowe stężenia (w mM) składników były następujące: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH2PO4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO3, 1 kwas pirogronowy i 8 glukozy (pH dostosowane do 7,4 z NaOH). Dodaj 3 μM nikardypiny i 1 μM skopolaminy, aby zahamować skurcze mięśni podczas obrazowania Ca2+ i rozwarstwiania całego mocowania.

3. Obrazowanie i analiza

UWAGA: Użyj przynajmniej podstawowego urządzenia do obrazowania z fluorescencyjnym źródłem światła, mikroskopem, wysokiej jakości kamerą CCD i odpowiednim oprogramowaniem do akwizycji. Różnicuj dodawanie innych składników w zależności od źródła światła i konkretnego zastosowania. Koło filtrowe i przesłona muszą być używane z tradycyjnym ksenonowym źródłem światła łukowego. Jednak źródła światła LED i systemy oświetleniowe nie wymagają tych komponentów.

  1. Umieścić komorę rejestracyjną pod mikroskopem i za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z wieloma podgrzewanymi zbiornikami strzykawkowymi ustalić ciągłą szybkość perfuzji 2–3 ml/min buforu Krebsa o temperaturze 37 °C. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza zarówno w przewodzie wejściowym, jak i ssawnym podłączonym do odwadniacza.
  2. Ustaw ostrość żądanego splotu w jasnym oświetleniu pola. Unikaj prześwietlania tkanki, co może prowadzić do wybielania zdjęć.
  3. Zbadaj obciążenie Fluo-4 w zwojach i wybierz zdrowe zwoje do obrazowania. Niezdrowe/uszkodzone zwoje będą wykazywać morfologię autofluorescencji lub punktową i nie powinny być używane do obrazowania.
  4. Po wybraniu ganglionu przekieruj ścieżkę światła do kamery i uzyskaj obraz na żywo za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu. Upewnij się, że ganglion jest ostry i ustaw szybkość akwizycji obrazu oraz czasy ekspozycji.
    UWAGA: Szybkość i czas pozyskiwania obrazów będą się różnić w zależności od zdarzeń, które badacze chcą rejestrować. W przypadku większości eksperymentów obrazy są tradycyjnie uzyskiwane przy 0,5-1 Hz dla komórek glejowych i do 2-10 Hz dla neuronów, ponieważ odpowiedzi glejowe Ca2 + nie są tak szybkie, jak stany przejściowe Ca2 + w neuronach.
  5. Rozpocznij eksperyment i ustal podstawową aktywność na 30 sekund.
  6. Zastosować wstępnie podgrzane leki, takie jak agoniści receptorów i antagoniści, za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z szybkością 2-3 ml/min. Po zastosowaniu agonistów/antagonistów należy powrócić do perfuzji normalnego buforu i odczekać okres płukania/rekonwalescencji wynoszący co najmniej 10 minut
    UWAGA: Czas stosowania leku będzie się różnić w zależności od indywidualnego związku i projektu eksperymentalnego. Ogólnie rzecz biorąc, 20-30 sekundowe zastosowanie agonisty jest wystarczające do aktywacji receptorów sprzężonych z białkiem G w neuronach i komórkach glejowych. Jednak kanały jonowe bramkowane ligandem (takie jak nikotynowe receptory acetylocholiny) wymagają czasu aplikacji nie dłuższego niż 5-10 sekund. Dalsze ekspozycje spowodują szybkie odczulanie kanałów jonowych bramkowanych ligandami. Antagoniści powinni być aplikowani przez około 3-15 minut, aby zapewnić całkowitą blokadę szlaków receptorowych. Jest to jednak duże uogólnienie i badacze powinni zawsze optymalizować każdy eksperymentalny lek w swoim konkretnym paradygmacie.
  7. Zatrzymaj nagrywanie i wyświetl film poklatkowy z eksperymentu. Starannie wybierz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.
  8. Użyj oprogramowania do normalizacji i porównania intensywności fluorescencji ROI z początkową bazową wartością fluorescencyjną. Zmiany znormalizowanej fluorescencji są wprost proporcjonalne do zmian [Ca2+].
    1. W celu poprawy dokładności oceny należy zastosować modyfikację opisanej wcześniej metody 26 przy użyciu ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, gdzie F1 jest fluorescencją w dowolnym punkcie, a F0 jest fluorescencją wyjściową. Modyfikacja ta pomaga w redukcji szumów spowodowanych zmianami fluorescencji w preparatach tkankowych, które wykazują ruch warstwy mięśniowej leżącej pod splotem mięśniowo-jelitowym.

Wyniki

Prawidłowe zastosowanie tej techniki pozwala badaczom na dokładny pomiar przejściowych zmian stężenia wewnątrzkomórkowego Ca2+ [Ca2+]i w neuronach i gleju jelitowym w preparatach tkankowych typu whole-mount. Reprezentatywny przykład odpowiedzi Ca2+ wywołanej agonistą w gleju w obrębie zwoju splotu mięszyjączkowego jelita grubego myszy pokazano w Video 1. Poniższe wyniki mają na celu zilustrowanie reprezentatywnych rezultatów uzyskanych za pomocą tej metody. Po pierwsze, Figure 2 przedstawia wyniki eksperymentu mierzącego zmiany [Ca2+]i w gleju jelitowym w odpowiedzi na stymulację ATP w preparatach podłużnego splotu mięszyjączkowego (LMMP) jelita grubego świnki morskiej. W szczególności rycina ta pokazuje metodę właściwej analizy opisanego powyżej protokołu eksperymentalnego, w tym obrys analizowanego zwoju mięszyjączkowego oraz gwiazdki oznaczające położenie neuronów jelitowych. Wyniki te ilustrują również optymalną dawkę ATP o stężeniu stu mikromoli na mobilizację [Ca2+]i w gleju mięszyjączkowym świnki morskiej. Odpowiedź ta może być wykorzystana do kalibracji stymulacji gleju jelitowego i normalizacji odpowiedzi na bodźce testowe. Następnie, Figure 3 wyjaśnia, jak prawidłowo wybierać obszary zainteresowania (ROI) otaczające komórki glejowe, zaznaczone żółtymi okręgami. Wyniki te pokazują również pożądane zmiany fluorescencji w warunkach podstawowych oraz w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne. Na koniec, Figure 4 demonstruje kwestie przestrzenne przy wyborze gleju i neuronów jelitowych do pomiaru odpowiedzi [Ca2+]i w preparatach whole-mount.

Schemat szlaków neuronalnych z zwojami, komórkami glejowymi i neuronami; warstwy splotu mięśnieniowego i podśluzówkowego.
Rycina 1. Organizacja ENS. ENS zawiera dwa główne sploty zwojowe. Splot mięśnieniowy znajduje się pomiędzy podłużnymi a okrężnymi warstwami mięśni. Splot podśluzówkowy zlokalizowany jest pomiędzy błoną śluzową a okrężną warstwą mięśni. ENS składa się wyłącznie z neuronów i gleju jelitowego. Zwoje są połączone wiązkami włókien nerwowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna sieci neuronalnych wykazująca odpowiedź na ATP; dołączono wykres zmiany intensywności.
Rysunek 2. Glej enteryczny w splotowym splotcie mięszykowym jelita grubego świnki morskiej reaguje na ATP in situ. (A) Fluorescencja Fluo-4 w zwoju mięszykowym (obrysowanym przerywaną linią) w warunkach spoczynkowych. Strzałki wskazują grube międzzwojowe pęczki włókien. (B) Po stymulacji 100 μmol/L ATP komórki glejowe, ale nie neurony, szybko zwiększają fluorescencję Fluo-4, co wskazuje na wzrost [Ca2+]i. Zauważmy, że reagujące komórki są małe i otaczają znacznie większe neurony (ciemne przestrzenie oznaczone gwiazdkami). (C) Glej enteryczny reaguje na ATP w sposób zależny od dawki, przy czym 1 mmol/L wywołuje odpowiedzi maksymalne 24. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna i wykres przedstawiający indukowaną przez ATP odpowiedź komórkową, analiza za pomocą czytnika mikropłytek.
Rycina 3. Mysie komórki S-100-GFP+ w splotowym splocie mięśniowym jelita grubego reagują na ATP in situ. (A) Glejowe komórki S-100-GFP+ (zielone) w mysim zwoju splotowym jelita grubego (obrysowanym przerywaną linią). Sześć obszarów zainteresowania (ROI) otaczających komórki glejowe w obrębie zwojów przedstawiono jako żółte okręgi. Strzałki wskazują grube wiązki włókien prowadzące do zwoju. Gwiazdki oznaczają położenie 2 neuronów jelitowych. (B) Ten sam zwój wykazujący fluorescencję Rhod-2 w warunkach bazowych. (C) Po stymulacji 100 μmol/L ATP komórki glejowe reagują zwiększeniem [Ca2+]i, co objawia się wzrostem fluorescencji Rhod-2. (D) Krzywe przebiegu odpowiadające każdemu ROI przedstawionemu na rys. A–C. (E) Uśredniona odpowiedź (średnia ± SEM) z 6 ROI przedstawionych na rys. D 24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aktywność neuronalna w czasie; obrazowanie fluorescencyjne, interakcja neuron-glej, wykresy odpowiedzi wapniowej.
Rysunek 4. In situ obrazowanie komunikacji między neuronami a glejem jelitowym. (A) Reprezentatywne obrazy (pseudokolorowe) z eksperymentu obrazowania Ca2+, w którym preparat całego splotu mięsieniowego poddano działaniu BzATP (100 μM, 30 s), będącego agonistą neuronalnego receptora P2X7. Zauważalny jest wzrost fluorescencji Fluo4 w neuronie (A’) przed otaczającymi go komórkami glejowymi jelit (A”). (B) Analiza zmiany fluorescencji w czasie w gleju (kolor niebieski) i neuronach (kolor czerwony) po zastosowaniu neuronalnego agonisty BzATP. (C) Odpowiedzi neuronalne i glejowe na BzATP w zwykłym buforze (linie ciągłe) oraz w buforze o niskiej zawartości Ca2+ i Mg2+ (linie przerywane) w celu potencjacji neuronalnych receptorów P2X7 13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo 1. Odpowiedź Ca2+ wywołana agonistą w gleju jelitowym in situ. Ten film przedstawia zwoj myentericzną z dystalnej części okrężnicy myszy, załadowaną wskaźnikiem Ca2+ Fluo-4. Agonista komórek glejowych, ADP, jest dodawany do kąpieli w wskazanym momencie. ADP wywołuje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ w gleju jelitowym, co obserwuje się jako przejściowy wzrost fluorescencji Fluo-4. Aby obejrzeć ten film, kliknij tutaj.

Dyskusja

Metodologie opisane w tym manuskrypcie zapewniają spójne podejście do skutecznego badania neuronów i gleju jelitowego w ENS. Chociaż obrazowanie neuronów i gleju jelitowego w hodowli dostarczyło wielu informacji na temat funkcji poszczególnych komórek, badanie tych komórek w ich natywnym, wielokomórkowym środowisku ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patofizjologii. Mikroskopia fluorescencyjna jest kluczową techniką oceny wielokierunkowych oddziaływań komórek w ENS. Ładowanie komórek ENS selektywnymi markerami fluorescencyjnymi i akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości pozwala na ilościowe obserwacje aktywności komórkowej w ENS. Obrazowanie żywych próbek tkanek ENS jest wykonywane stosunkowo szybko i generuje duże ilości pogłębionych danych funkcjonalnych i przestrzennych. Preparaty na mięśnie myszki i sploty podśluzówkowe stosowane w tych eksperymentach pozwalają na manipulacje molekularne i genetyczne. ObrazowanieCa2+ w preparatach typu whole-mount stanowi użyteczne narzędzie do oceny interakcji neuron-glej.

W zaawansowanych paradygmatach eksperymentalnych można połączyć kilka sond w celu uzyskania informacji o różnych zdarzeniach w komórkach. Mikroskopia fluorescencyjna może rejestrować obrazy ze zwiększonym kontrastem określonych cząsteczek, jeśli zastosuje się odpowiednią etykietę fluorescencyjną. Fluo-4 został wybrany, ponieważ posiada duży zakres dynamiki. Wystarczający czas inkubacji ma kluczowe znaczenie w przypadku stosowania barwników AM w ENS. Aby osiągnąć najlepsze wyniki, może być konieczne dostosowanie stężenia barwnika i metody ładowania. Idealne preparaty powinny być obciążone wystarczającą ilością barwnika, aby uwidocznić zmiany we fluorescencji, ale nie na tyle, aby barwnik chelatował jony docelowe i zakłócał sygnalizację wewnątrzkomórkową. Ekspozycja na światło fluorescencyjne powinna być ograniczona, aby zapobiec fototoksyczności w komórkach i fotowybielaniu barwników.

Badacze muszą być ostrożni z kilkoma etapami tego eksperymentu, zwłaszcza z przygotowaniem roztworu i tkanki. Szczególną ostrożność należy zachować podczas przetwarzania i preparowania tkanki ENS w celu utrzymania funkcji komórkowych. Przewód pokarmowy składa się z kilku warstw i odmian tkanek, co stanowi wyzwanie dla jakości sekcji i obrazowania w tych preparatach typu whole mount 27. Ponadto łączące się szlaki światłowodowe MP są szersze, a zwoje są większe niż w SMP 2. Gęstość neuronów splotu mięśniowo-jelitowego jest wyższa w porównaniu ze splotem podśluzówkowym 28. Powolne i nieprecyzyjne sekcje będą miały szkodliwy wpływ na jakość preparatów splotu, a tym samym na ogólny sukces eksperymentów. Dlatego czyste/nieuszkodzone narzędzia, praktyka i zręczność manualna mają kluczowe znaczenie dla tej procedury.

W przypadku preparatów tkanek typu full-mount należy zwrócić szczególną uwagę na rysowanie obszarów zainteresowania (ROI), aby prawidłowo ocenić kinetykę i stopień obserwowanej zmiany intensywności fluorescencji pożądanego typu komórki. Ponieważ zwoje znajdują się na kurczliwej warstwie mięśniowej, artefakty ruchowe spowodowane ruchliwością jelit są głównym problemem podczas obrazowania in situ . Tak więc tłumienie tych zaburzeń ruchowych poprzez ponowne pinowanie preparatów tkankowych po inkubacji z enzymami i dodanie hamowania farmakologicznego (nikardypina/skopolamina) do umożliwia wyraźne i wiarygodne pozyskiwanie obrazu. Oprócz farmakologii i mechanicznych podejść do zapobiegania ruchom tkanek, ostatnie badania ilustrują zastosowanie zaawansowanych metodologii oprogramowania i charakterystyki odpowiedzi typu komórki w celu skorygowania ruchu tkanki resztkowej w zapisach i poprawy dokładności analizy 29. Pomijając te przeszkody techniczne, metoda ta zapewnia fizjologicznie istotne warunki do oceny morfologicznych i ilościowych cech neuronów i gleju jelitowego w ENS.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) (dla B. Gulbransena), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) oraz fundusze start-up z Michigan State University (B. Gulbransen).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podgrzewacz strzykawkowy BubbleStop AutoMate Scientific10-4-35-G
CaCl2SigmaC3306
Kolagenaza, Typ II, proszekGibco17101-015
DyspazaSigma-Aldrich42613-33-2
Narzędzia preparacyjneRoboz 
DMSOSigma-AldrichD5879
Mikroskop stałostolikowyOlympus BX51WI
Fluo-4 AM barwnikInvitrogenF-14201
GlukozaSigmaG8270
Szpilki do owadówNarzędzia do nauki Drobneszpilki Minutien Oprogramowanie
do obrazowania żywych komórek iQAndorAndor iQ3
KClSigmaP3911
MgCl2SigmaM9272
NaClSigmaS9888
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaS6014
Neo kamera sCMOSAndorNeo 5.5 sCMOS
NicardipineSigmaN7510
KomoraperfuzyjnaNiestandardowa
pompa perystaltycznaAparat HarvardModel 720
Pluronic F-127 InvitrogenP3000MP
Probenecydowesondy molekularneP36400
SkopolaminaSigmaS1013 
Sutter Lambda DG-4SutterDG-4
Sylgard Regulator temperatury Dow Corning184
WarnerInstrumentsTC-344C

Bibliografia

  1. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  2. Furness, J. B. The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections. Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  3. Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).
  4. Nasser, Y., et al. Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).
  5. Glial cells in the gut. Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).
  6. Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. J. Physiol. 590, 335-350 (2012).
  7. Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon. J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).
  8. McClain, J. L., et al. Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
  9. Chandrasekharan, B., et al. Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress. Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55, 630-637 (2006).
  12. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  13. Gulbransen, B. D., et al. Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis. Nat Med. 18, 600-604 (2012).
  14. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon. J Physiol. 588, 399-421 (2010).
  15. Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).
  16. Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation. J Physiol. 526, 375-385 (2000).
  17. Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system. Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).
  18. Hennig, G. W., et al. Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum. Neurogastro Motil. 14, 575(2001).
  19. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes. Nature. 399, 62-66 (1999).
  20. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine. Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).
  21. Jessen, K. R., et al. Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia. Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).
  22. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).
  23. Gomes, P., et al. ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice. Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).
  24. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system. Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).
  25. Ren, J., Bertrand, P. P. Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons. Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).
  26. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).
  27. Dongcheng, Z., et al. Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy. Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).
  28. Gershon, M. D. Behind an enteric neuron there may lie a glial cell. J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).
  29. Boesmans, W., et al. Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie wapniapreparat całego organufluorescencyjny barwnik wskaźnikowymikroskopia fluorescencyjnasploty mięśnioweładowanie Fluo-4stymulacja farmakologicznaakwizycja obrazuaktywność komórek glejowych
In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.