Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca²⁺ za pośrednictwem IP₃ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca²⁺ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Streszczenie

Cytozolowe jony Ca²⁺ regulują liczne aspekty aktywności komórkowej w prawie wszystkich typach komórek, kontrolując procesy tak szerokie, jak transkrypcja genów, pobudliwość elektryczna i proliferacja komórek. Różnorodność i specyficzność sygnalizacji Ca^{2 +} wynika z mechanizmów, za pomocą których sygnały Ca^{2 +} są generowane do działania w różnych skalach czasowych i przestrzennych, począwszy od oscylacji i fal obejmujących całą komórkę i fal występujących w ciągu kilku minut, aż po lokalne przejściowe mikrodomeny Ca²⁺ (Ca²⁺ zaciągnięcia) trwające milisekundy. Ostatnie postępy w dziedzinie kamer CCD z pomnożonymi elektronami (EMCCD) pozwalają teraz na obrazowanie lokalnych sygnałów Ca²⁺ z rozdzielczością przestrzenną 128 x 128 pikseli z szybkością >500 klatek ^sec-1 (fps). Podejście to jest wysoce równoległe i umożliwia jednoczesne monitorowanie setek kanałów lub miejsc zaciągania się w jednym eksperymencie. Jednak ogromna ilość generowanych danych (ok. 1 Gb na min) sprawia, że identyfikacja wizualna i analiza lokalnych zdarzeń Ca²⁺ jest niewykonalna. Tutaj opisujemy i demonstrujemy procedury pozyskiwania, wykrywania i analizy lokalnych sygnałów Ca^{2 +} za pośrednictwem IP₃ w nienaruszonych komórkach ssaków obciążonych wskaźnikami Ca^{2 +} przy użyciu zarówno mikroskopii epi-fluorescencji (WF), jak i całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF). Ponadto opisujemy algorytm opracowany w środowisku oprogramowania open source Python, który automatyzuje identyfikację i analizę tych lokalnych sygnałów Ca²⁺. Algorytm lokalizuje miejsca uwolnienia Ca²⁺ z rozdzielczością subpikselową; umożliwia użytkownikowi przeglądanie danych; i wyprowadza sekwencje czasowe sygnałów współczynnika fluorescencji wraz z danymi amplitudowymi i kinetycznymi w tabeli zgodnej z programem Excel.

Wprowadzenie

Jony wapnia (^Ca2+) regulują różnorodne procesy biologiczne, w tym ekspresję genów, wydzielanie i długotrwałe zmiany plastyczności synaptycznej¹. Jednym ze sposobów, w jaki Ca²⁺ może działać w tak różnorodny sposób, są różne przestrzenne i czasowe wzorce sygnałów Ca²⁺, które komórka może generować. Na przykład globalne zwiększenie cytozolu [Ca²⁺] wywołuje skurcz w tkance mięśni gładkich², podczas gdy mniejsze, zlokalizowane przejściowe wzrosty (lokalne mikrodomeny Ca^{2 +}) stymulują ekspresję genów niezbędnych do uczenia się i zapamiętywania³.

Wolny cytozol [Ca²⁺] jest utrzymywany na poziomie ~100 nM w spoczynku, ale może szybko wzrosnąć do kilku mikromolowców po napływie Ca²⁺ do cytozolu przez przepuszczalne dla Ca²⁺ kanały jonowe znajdujące się w błonie komórkowej i przez uwolnienie Ca²⁺ z wewnątrzkomórkowych magazynów. Nasze laboratorium koncentruje się na receptorze 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP₃R), który tworzy kanał uwalniania Ca²⁺ zlokalizowany w błonie retikulum endoplazmatycznego (ER). Po związaniu zarówno IP₃, jak i Ca^{2 +} z cytozolowymi miejscami aktywującymi receptora, kanał IP₃R otwiera się, aby uwolnić Ca^{2 +} sekwestrowany w świetle ER. Uwalnianie Ca^{2 +} może pozostać ograniczone przestrzennie do małego klastra IP₃R w celu wytworzenia lokalnej mikrodomeny cytozolowej Ca²⁺ (Ca^{2 +} puff⁴) lub, w zależności od bliskości sąsiednich klastrów IP₃Rs, może rozprzestrzeniać się w komórce poprzez rekrutację wielu miejsc zaciągnięcia w procesie uwalniania Ca²⁺ indukowanego przez Ca²+ (CICR)^5,6.

Wprowadzenie fluorescencyjnych drobnocząsteczkowych barwników wskaźnikowych Ca²⁺ opracowanych przez Rogera Tsiena⁷, w połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania mikroskopowego, znacznie ułatwiło nam zrozumienie sygnalizacji Ca²⁺. Najnowsze postępy w dziedzinie kamer używanych w mikroskopii pozwalają obecnie na obrazowanie przejściowych lokalnych zdarzeń Ca²⁺, takich jak zaciągnięcia, z niespotykaną rozdzielczością przestrzenną i czasową. Obecnie dostępne kamery EMCCD umożliwiają obrazowanie z rozdzielczością 128 x 128 pikseli przy >500 klatkach ^sec-1 (kl./s), a nowa generacja kamer z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (CMOS) zapewnia wyższą rozdzielczość pikseli i jeszcze większą prędkość kosztem nieco wyższego poziomu szumów. W połączeniu z mikroskopią całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) możliwe jest teraz obrazowanie pojedynczych zdarzeń kanału Ca^{2+ 8,9}. Takie podejście pozwala na obrazowanie setek kanałów/zdarzeń jednocześnie, przy jednoczesnym generowaniu dużych zbiorów danych (ok. 1 GB na minutę), które uniemożliwiają ręczne przetwarzanie, identyfikację wizualną i analizę i nakładają nacisk na rozwój zautomatyzowanych algorytmów.

Tutaj prezentujemy procedury i protokoły obrazowania lokalnych sygnałów Ca²⁺ w nienaruszonych komórkach ssaków za pomocą fluorescencyjnych wskaźników Ca²⁺. Następnie demonstrujemy algorytm opracowany w środowisku open source Python, który automatyzuje identyfikację i analizę lokalnych zdarzeń Ca²⁺ obrazowanych zarówno za pomocą TIRF, jak i konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej (WF) o szerokim polu. Chociaż opisujemy te podejścia w kontekście sygnałów Ca^{2 +} generowanych przez IP₃, są one łatwo podatne na badanie lokalnych zmian w cytozolowym [Ca^{2 +}] pochodzących z różnych kanałów jonowych przepuszczalnych dla Ca^{2 +} znajdujących się w błonie powierzchniowej lub organellach wewnątrzkomórkowych^8-10.

Protokół

Przedstawiamy szczegółowe procedury obrazowania lokalnych zdarzeń Ca²⁺ w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y. Procedury te można dostosować do obrazowania wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca^{2 +} w wielu typach komórek^8-10.

1. Przygotowanie komórek

1. Hoduj komórki, które mają być zobrazowane, zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie internetowej dostawcy.
2. Na kilka dni przed obrazowaniem należy pobrać komórki wyhodowane w kolbie do hodowli tkankowej, używając 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA (2-3 min). Po oderwaniu dodaj równą objętość pożywki hodowlanej, aby dezaktywować trypsynę.
3. Przeprowadź liczenie komórek za pomocą hemocytometru i komórek nasiennych w naczyniach obrazowych ze szklanym dnem o gęstości 3-7 x 10⁴ komórek na szalkę. Wybierz komórki do eksperymentów obrazowych, gdy osiągną 60% konfluencji (2-3 dni).

2. Przygotowanie roztworów i odczynników

1. Przygotować buforowany roztwór soli HEPES zawierający Ca²⁺ (Ca²⁺-HBSS) składający się z (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES i 10 glukozy; pH = 7,4 w temperaturze pokojowej (RT) z NaOH. Przygotować Ca²⁺-HBSS bez dodatku glukozy i przechowywać w temperaturze 4 °C; Dodać glukozę do roztworu bezpośrednio przed użyciem.
2. Rozpuszczaj przepuszczalne przez błonę formy fluorescencyjnego wskaźnika Ca²⁺ Cal-520 (1 mM), ci-IP₃ (200 μM) i EGTA (100 mM) w dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającym 20% pluronu F-127. Odczynniki te należy rozmieścić w probówkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C, w osłonie przed wilgocią i światłem.

3. Ładowanie komórek za pomocą membrany Cal-520, ci-IP₃ i EGTA

1. Przygotować "bufor ładujący" przez rozcieńczenie roztworów podstawowych membranowych Cal-520 i ci-IP₃ do końcowego stężenia odpowiednio 5 μM i 1 μM w Ca²⁺-HBSS.
2. Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki, zastępując pożywkę trzykrotnym Ca²⁺-HBSS.
3. Usunąć Ca^{2 +} -HBSS i inkubować komórki w buforze ładującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
4. Usuń bufor ładujący i przepłucz komórki, zastępując pożywkę Ca^{2 +} -HBSS trzy razy.
   1. W razie potrzeby, na tym etapie, załaduj komórki EGTA/AM, rozcieńczając roztwór podstawowy do końcowego stężenia 5 μM w Ca²⁺-HBSS, a następnie inkubuj komórki przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po tej inkubacji przepłukać komórki trzykrotnie Ca^{2 +} -HBSS przed przejściem do kroku 3.5.
5. Inkubować komórki w Ca^{2 +} -HBSS przez 30 minut, aby umożliwić deestryfikację załadowanych odczynników.
6. Bezpośrednio przed obrazowaniem należy zastąpić Ca²⁺-HBSS "świeżym" Ca²⁺-HBSS w celu usunięcia barwnika, który mógł przedostać się do kąpieli podczas końcowej inkubacji.

4. Akwizycja obrazu Ca²⁺

1. Umieść małą kroplę olejku immersyjnego na obiektywie 100X APO TIRF (NA 1.49).
2. Zamontuj czaszę obrazowania na stoliku mikroskopu odwróconego i ustaw ostrość komórek za pomocą światła przechodzącego. Ważne jest, aby zabezpieczyć miskę obrazowania, aby zapobiec przesuwaniu się podczas nagrywania.
3. Oświetl komórki laserem o długości fali 488 nm w celu wzbudzenia Cal-520 i zebrania emitowanej fluorescencji (λ >510 nm) za pomocą szybkiej kamery EMCCD.
   UWAGA: Pakiet oprogramowania obsługującego mikroskop umożliwia użytkownikowi translację soczewki skupiającej, co pozwala na wprowadzenie wiązki laserowej na skrajną krawędź tylnej apertury obiektywu (w przypadku wzbudzenia TIRF) lub bardziej centralnie (w przypadku wzbudzenia "WF").
4. Korzystając z oprogramowania EMCCD, zmniejsz pole obrazowania z pełnych 512 x 512 pikseli, aby zebrać dane w niezbędnej rozdzielczości czasowej do uchwycenia lokalnych zdarzeń Ca²⁺.
   UWAGA: Na przykład akwizycja w trybie poczwórnego centrum o wymiarach 256 x 256 pikseli przyspiesza szybkość akwizycji do 66 kl./s. Możliwe jest również dalsze zwiększenie liczby klatek na sekundę w kamerze EMCCD do 500 kl./s za pomocą funkcji trybu izolowanego kadrowania.
5. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby automatycznie rejestrowało kilka sekund podstawowej aktywności, dostarczało błysk UV do komórek i kontynuowało nagrywanie przez kolejne 10-30 sek.
   UWAGA: Lampa błyskowa UV jest dostarczana za pomocą ksenonowego źródła światła łukowego wprowadzanego przez odbijające promieniowanie UV zwierciadło dichroiczne w tylnym porcie mikroskopu. Czas trwania i intensywność błysku UV jest dostosowywany empirycznie, aby wywołać pożądaną częstotliwość lokalnych zdarzeń Ca²⁺.
6. Zapisywanie plików jako stosów obrazów do analizy w trybie off-line.

5. Zautomatyzowana analiza obrazu Ca²⁺

UWAGA: Możliwe jest przeglądanie, przetwarzanie i analizowanie przechwyconych danych za pomocą wielu komercyjnych pakietów oprogramowania. Opracowaliśmy jednak algorytm, który szybko automatyzuje identyfikację i analizę lokalnych sygnałów Ca²⁺. Szczegółowy opis filtrów przestrzennych i czasowych stosowanych w tym algorytmie, generowania ΔF/F₀ oraz procedur identyfikacji/analizy można znaleźć w¹¹. Algorytm ten został opracowany do działania na platformie oprogramowania open source Python i można go uzyskać, wraz z przykładowymi danymi eksperymentalnymi i szczegółowymi instrukcjami użytkownika, wysyłając wiadomość e-mail do autora korespondencyjnego (ismith@uci.edu).

1. Konwertuj pliki do zaimportowania do niestandardowego algorytmu na format pliku .tiff wielopłaszczyznowego.
2. Zlokalizuj folder zawierający algorytm analizy i kliknij dwukrotnie run.exe.
3. Wybierz plik .tiff, który ma zostać przeanalizowany.
4. Wybierz parametry analizy w otwartym oknie dialogowym. Zobacz rysunek 2A, aby zapoznać się z parametrami domyślnymi dla przykładowych danych.
5. Określ poziom czerni, który ma zostać odsunięty od stosu obrazów, przesuwając kursor do części pola widzenia, która nie zawiera komórki (patrz Rysunek 2B) lub ręcznie wprowadzając poziom czerni za pomocą monitu "Ustaw poziom czerni".
6. Obserwuj cztery okna na ekranie po analizie przez oprogramowanie (Rysunek 2C-F). C jest monochromatycznym obrazem spoczynkowej fluorescencji z analizowanych komórek. Białe kwadraty nałożone na ten obraz to lokalizacje zdarzeń, wyznaczone jako pozycje środka ciężkości dwuwymiarowych funkcji Gaussa dopasowanych do zdarzeń.
7. Kliknij każdą lokalizację wydarzenia lub naciśnij kursora, aby przełączać się między wydarzeniami. Po wykonaniu tej czynności odjęte tło, wygładzone Gaussowskie zmiany współczynnika fluorescencji (ΔF/F₀) w każdym z tych miejsc są aktualizowane w oknie D.
   UWAGA: Zdarzenia wyróżnione na czerwono są określane jako pochodzące z tej konkretnej witryny, a nie z "przebijania" aktywności zlokalizowanej w sąsiednich witrynach. Dolna niebieska ścieżka wskazuje, gdzie sygnał fluorescencji w wybranym miejscu przekroczył próg detekcji, natomiast linia identyfikuje zdarzenia pochodzące z tego konkretnego miejsca (odpowiadające zdarzeniom podświetlonym na czerwono).
8. Kliknij zdarzenie podświetlone na czerwono, aby zaktualizować okno E, w którym wyświetlana jest ewolucja czasowa zdarzenia, oraz okno F, w którym wyświetlany jest profil przestrzenny zdarzenia uśredniony w czasie jego przebiegu wraz z profilem przestrzennym dopasowanej funkcji Gaussa.
9. Ręcznie przejrzyj zdarzenia, które zostały zidentyfikowane, aby artefakty mogły zostać odrzucone z analizy. Usuń takie zdarzenia, klikając prawym przyciskiem myszy podświetlone na czerwono zdarzenia.
   UWAGA: W naszych rękach strumień Ca²⁺ przez pojedyncze kanały IP₃R wywołuje sygnały o ΔF/F₀ około 0,11, więc wszelkie wykryte "zdarzenia" znacznie mniejsze niż to prawdopodobnie będą fałszywie dodatnie.
10. Eksportuj dane, wybierając opcję "Zapisz w programie Excel" lub eksportuj dane dla każdej komórki, rysując wokół interesującej Cię komórki i wybierając opcję "Zapisz komórkę".
    UWAGA: Dane są zapisywane w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny stos obrazów.

Wyniki

Rycina 1A przedstawia obraz WF fluorescencji spoczynkowej Cal-520 w ludzkich komórkach neuroblastoma SH-SY5Y, które zostały również załadowane ci-IP₃. Poddanie tych komórek 100 ms błyskowi UV w celu fotoutzwolnienia i-IP₃ wywołało przejściowe puffsy Ca²⁺ w odrębnych miejscach (oznaczonych białymi okręgami na Rycynie 1A). Przebiegi fluorescencji mierzone w tych miejscach wykazały szybką fazę wzrostu wynikającą z przejściowego otwarcia receptorów IP₃

Dyskusja

Opisujemy tutaj protokoły obrazowania lokalnych zdarzeń Ca²⁺ w hodowanych komórkach ssaków przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca²⁺ . Ponadto opisujemy algorytm z intuicyjnym interfejsem użytkownika, który automatyzuje identyfikację i analizę pozyskanych danych. Opisana tutaj procedura wykorzystuje fluorescencyjny wskaźnik Ca^{2 +} Cal-520, ale wiele innych barwników wrażliwych na Ca^{2 +} , takich jak Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 i Oregon Green BAPTA-1 działa wystarczająco dobrze, ab...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266
Cal-520 / AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoksy)benzylo-myo-inozytol 1,4,5-trisfosforan-heksakis(propionoksymetyl) ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronowy F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
Talerze obrazowe 35 mm ze szklanym dnem	MatTek	P35G-1.5-14-C