Artykuł metodologiczny

Ocena barier gatunkowych pasażowalnej encefalopatii gąbczastej za pomocą testu konwersji białka prionowego in vitro

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52522

⸱

10 marca 2015

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Pomiar bariery dla międzygatunkowego przenoszenia chorób prionowych jest trudny i zazwyczaj wiąże się z wyzwaniami zwierzęcymi lub testami biochemicznymi. W tym miejscu przedstawiamy test konwersji białka prionowego in vitro z możliwością przewidywania barier gatunkowych.

Streszczenie

Badania mające na celu zrozumienie międzygatunkowej transmisji pasażowalnych encefalopatii gąbczastych (TSE, choroby prionowe) są wyzwaniem, ponieważ zazwyczaj opierają się na długich i kosztownych badaniach in vivo na zwierzętach. Opracowano szereg testów in vitro, aby pomóc w pomiarze barier gatunkowych prionów, zmniejszając w ten sposób wykorzystanie zwierząt i zapewniając szybsze wyniki niż w przypadku testów biologicznych na zwierzętach. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiego testu konwersji prionów in vitro, zwanego testem współczynnika efektywności konwersji (CER). W tym teście komórkowe białko prionowe (PrPC) z niezakażonego mózgu gospodarza jest denaturowane zarówno przy pH 7,4, jak i 3,5 w celu wytworzenia dwóch substratów. Gdy substrat o pH 7,4 jest inkubowany z czynnikiem TSE, ilość PrPC, która przekształca się w stan oporny na proteinazę K (PK), jest modulowana przez barierę gatunkową pierwotnego gospodarza na czynnik TSE. W przeciwieństwie do tego, PrPC w podłożu o pH 3,5 jest nieprawidłowo sfałdowany przez jakikolwiek czynnik TSE. Porównując ilość białka prionowego opornego na PK w dwóch substratach, można dokonać oceny bariery gatunkowej gospodarza. Pokazujemy, że test CER prawidłowo przewiduje znane bariery gatunkowe prionów myszy laboratoryjnych i, jako przykład, pokazujemy wstępne wyniki sugerujące, że ryś rudy (Lynx rufus) może być podatny na czynnik przewlekłej choroby wyniszczającej jelenia wirginijskiego (Odocoileus virginianus).

Wprowadzenie

Zakaźne encefalopatie gąbczaste (TSE, choroby prionowe) to grupa śmiertelnych chorób neurodegeneracyjnych z wydłużonymi okresami inkubacji, które dotykają różne zwierzęta i ludzi. Przypuszczalny czynnik etiologiczny TSE składa się z nieprawidłowo sfałdowanego izomeru białka prionowego gospodarza (PrP), który jest zdolny do samorozprzestrzeniania się przez sterowaną matrycą konwersję normalnej komórkowej formy PrP (PrPC) w zakaźną, związaną z chorobą formę (PrPTSE), która gromadzi się w tkankach ośrodkowego układu nerwowego zakażonego gospodarza1. Zakaźne priony ssaków na ogół przenoszą się z gospodarza na gospodarza w sposób specyficzny dla gatunku, co dało początek koncepcji "bariery gatunkowej TSE" ograniczającej przypadki przenoszenia międzygatunkowego2. Biologiczne uwarunkowania bariery gatunkowej prionów nie są dobrze poznane. Podobieństwo sekwencji aminokwasów między zakaźnym PrPTSE a gospodarzem PrPC może silnie wpływać na to, czy konwersja zachodzi3-5, ale pozostaje niewystarczające do wyjaśnienia wszystkich zdarzeń transmisji prionów obserwowanych in vivo6,7.

Tak więc, charakterystyka barier gatunkowych TSE w dużej mierze opierała się na badaniach prowokacyjnych na zwierzętach: wystawianiu naiwnych zwierząt z danego gatunku na działanie prionów z innego gatunku i mierzeniu wynikowego czasu inkubacji do wystąpienia choroby i szybkości ataku jako wskaźników efektywności transmisji. Myszy wykazujące ekspresję PrPC z gatunków heterologicznych są również wykorzystywane do tego typu badań8. Koszty związane z produkcją myszy transgenicznych i długotrwałymi testami biologicznymi prionów, a także względy etyczne związane z wykorzystywaniem zwierząt, stanowią przeszkodę w eksperymentalnych badaniach barier dla gatunków TSE. Ocena bariery gatunkowej dla gatunku ludzkiego wobec TSE opiera się na myszach zmodyfikowanych do ekspresji ludzkiego PrPC. Myszy te wymagają długich okresów inkubacji, aby ulec ludzkim TSE lub modyfikacjom ludzkiej cząsteczki PrPC w celu szybkiego wystąpienia choroby9. Okresy inkubacji TSE u tych myszy mogą wykraczać poza normalną długość życia myszy, co utrudnia interpretację negatywnych wyników. Naczelne inne niż ludzie były również wykorzystywane jako wskaźniki zastępcze do badania barier gatunkowych dla ludzi, ale badania te są obarczone tymi samymi wyzwaniami, co inne rodzaje eksperymentów na zwierzętach, a naczelne inne niż ludzie mogą nie podsumowywać dokładnie choroby w miarę jej postępu w ludzkim gospodarzu.

Testy biologiczne na zwierzętach pozostają "złotym standardem" metody pomiaru podatności gatunku na TSE, ale przeszkody, koszty i etyka tych badań na żywych zwierzętach zmusiły do zbadania alternatyw. Opracowano szereg testów in vitro, opartych na ocenie konwersji PrPC gospodarza do stanu oporności na proteinazę K (PK) (PrPres) po wysiewie przez PrPTSE, które wykorzystano do zbadania barier gatunkowych TSE10-12. Przykłady testów in vitro obejmują testy konwersji bezkomórkowej, cykliczną amplifikację nieprawidłowego fałdowania białek (PMCA) oraz test współczynnika efektywności konwersji (CER)10-14. Chociaż żaden z tych testów nie uwzględnia czynników peryferyjnych związanych z barierami gatunkowymi po naturalnym zakażeniu, wszystkie mogą być przydatne do identyfikacji potencjalnie podatnych żywicieli na TSE.

Tutaj prezentujemy protokół testu CER, w którym dwa zdenaturowane substraty PrPC pochodzące z normalnych homogenatów mózgu są używane w reakcjach konwersji prionów na stanowisku laboratoryjnym (Rysunek 1)13. PrPC w podłożu zdenaturowanym przy pH 7,4 może zostaćprzekształcony w PrP res przezPrP TSE wysiewany do reakcji tylko przy braku bariery gatunkowej14. W przeciwieństwie do tego, denaturacja PrPC w drugim substracie przy pH 3,5 pozwala na jego przekształcenie w PrPres po inkubacji z PrPTSE z dowolnego gatunku i służy jako kontrola konwersji. Stosunek konwersji PrPC do PrPres w podłożu o pH 7,4 w stosunku do substratu o pH 3,5 stanowi miarę bariery gatunkowej. Odkryliśmy, że test CER przewiduje znane bariery gatunkowe myszy laboratoryjnych wobec różnych TSE i wykorzystaliśmy test w wysiłkach na rzecz przewidzenia bariery gatunkowej wielu gatunków ssaków, w tym owiec gruborogich, na przewlekłą chorobę wyniszczającą (CWD) i inne TSE14,15. Badacze zainteresowani narzędziem umożliwiającym szybkie badania przesiewowe barier gatunkowych TSE lub ocenę konwersji PrP C-to-PrPOZE uznają tę metodologię za przydatną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Praca na zwierzętach prowadzona w USGS National Wildlife Health Center została wykonana zgodnie z wytycznymi NIH Office of Laboratory Animal Welfare oraz zgodnie z protokołem instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania #EP080716. Tkanki pochodzące od zwierząt pozyskanych przez myśliwych były darami od Departamentu Zasobów Naturalnych Wisconsin lub Michigan.

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Roztwory wymienione poniżej są wymagane do przygotowania substratu do testu CER w sekcji 2 poniżej. Przygotować każdy z tych roztworów z roztworów podstawowych o wyższym stężeniu; Zalecane stężenia dla roztworów podstawowych zostaną podane w nawiasach po każdej wymienionej nazwie chemicznej. Przygotować wszystkie roztwory świeżo po przygotowaniu podłoża i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

  1. Jako bufor do lizy należy przygotować następujący roztwór w 10 mM Tris, pH 7,5 (zalecany 1 M Tris, pH 7,5): 100 mM chlorek sodu (NaCl, 1 M roztwór podstawowy), 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 roztwór podstawowy), 0,5% NP-40 (10% roztwór podstawowy), 0,5% deoksycholan (DOC, 10% roztwór podstawowy).
  2. Jako bufor konwersyjny należy przygotować roztwór 0,05% dodecylosiarczanu sodu (SDS, 10% roztwór podstawowy) i 0,5% Triton X-100 (10% roztwór podstawowy) w 1 roztworze podstawowym buforowanym fosforanem (PBS, 10, pH 7,4 roztwór podstawowy).
  3. Dla roztworów chaotropowych przygotować dwa 3 M roztwory chlorowodorku guanidyny (GdnHCl, 8 M zapas) w 1x PBS (10x roztwór podstawowy). Doprowadzić pH jednego z roztworów do 3,5 ± 0,05 za pomocą stężonego kwasu solnego (HCl). Sprawdzić, czy pH drugiego roztworu pozostaje na poziomie pH 7,4 ± 0,05 i w razie potrzeby wyregulować za pomocą stężonego HCl lub wodorotlenku sodu (NaOH).

2. Przygotuj pary substratów do testów CER

  1. Uzyskać zdrową, niezakażoną TSE tkankę mózgową od gatunków będących przedmiotem zainteresowania i przygotować homogenat o stężeniu 10% masy na objętość (w/v) w buforze do lizy, stosując jedną z następujących metod: dounce, bead-mill lub homogenizacja moździerzowa i tłuczka. Otrzymane homogenaty należy dalej udoskonalać, poddając je homogenizacji strzykawki i igły, używając igieł o rosnącej grubości, aż substrat będzie mógł być łatwo odessany i wydalony przez igłę strzykawkową 27 G.
    1. W przypadku substratów przygotowanych z gryzoni i innych małych ssaków należy homogenizować cały mózg (mózgi); w przypadku substratów przygotowanych z większych ssaków, należy użyć tkanki obsuwanej (pnia mózgu) do przygotowania homogenatów. Wybierając ilość homogenatu mózgu, należy przygotować nie więcej niż 50% pojemności wirówki używanej do wytrącania białek w kroku 2.6.
    2. Jeśli jakość nabytej tkanki mózgowej jest wątpliwa, przed przygotowaniem substratu należy ocenić poziom PrPC za pomocą SDS-PAGE16 i immunoblot17.
  2. Podziel homogenat mózgu na dwie równe objętości w oddzielnych oznakowanych plastikowych stożkowych rurkach. Dodać GdnHCl (3 M roztwory w 1 PBS) o pH 3,5 lub 7,4 do każdej probówki w stosunku objętościowym 1:1 do homogenatu mózgu.
  3. Sprawdź wartości pH obu roztworów. Dostosuj pH podłoża o pH 3,5 do pH ± 0,05 za pomocą stężonego HCl. Upewnij się, że pH drugiego podłoża pozostaje na poziomie pH 7,4 ± 0,05 i w razie potrzeby dostosuj pH za pomocą HCl lub NaOH w razie potrzeby. Unikaj przekroczenia wartości pH przez rozsądne dodanie kwasu lub zasady.
  4. Obracaj roztwory na mieszalniku typu end-over-end w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 godzin.
  5. Wytrącić białko przez dodanie czterech objętości metanolu do roztworów substratów w każdej stożkowej probówce, wirować do dobrego wymieszania i inkubować w temperaturze -20 °C przez 16-18 godzin.
  6. Próbki osadu odwirowywać w temperaturze 13 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować i odrzucić supernatanty i pozwolić na odparowanie metanolu z granulek. Użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby pomóc w wchłanianiu metanolu przylegającego do wnętrza tubki. Nie pozwól, aby granulki przeschły, a gdy metanol nie będzie już widoczny, przejdź do następnego kroku.
  7. Zawiesić granulki białka w buforze konwersyjnym. Użyć ilości buforu konwersyjnego równej ilości materiału wyjściowego homogenatu mózgu dozowanego do każdej probówki w kroku 2.2.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby buforem konwersyjnym używanym do ponownego zawieszania granulek białka zarówno z preparatów substratowych o pH 3,5, jak i 7,4 był roztwór zdefiniowany w kroku 1.2 powyżej (który zawiera niski poziom detergentów i fizjologiczne pH).
  8. Krótko sonikować roztwory substratów w sonikatorze cuphorn (10 sekund przy ~30% maksymalnej mocy), podwielokrotność na objętości 0,5 - 1,0 ml w znakowanych probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przeprowadzić kontrolę jakości immunoblot (krok 2.9) na podwielokrotności każdego substratu. Pozostałe podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia testu CER (sekcja 4).
  9. Przed użyciem należy przeprowadzić kontrolę jakości par substratów CER (rysunek 2). Kroki te zapewniają, że substraty CER zapewnią optymalne wyniki w badaniach konwersyjnych.
    1. Zapewnić porównywalne ilości PrPC w obu substratach. Porównaj poziomy PrP w 10-25 μl każdego substratu za pomocą SDS-PAGE16 i immunoblottingu17. Jeśli poziomy białka w substratach pH 7,4 i 3,5 mieszczą się w granicach ~10% od siebie, pary substratów są odpowiednie do wykorzystania w badaniach CER.
      UWAGA: Immunobloty PrP nie powinny wykazywać oznak rozległej degradacji PrPC. Immunoreaktywność PrP powinna wynosić głównie >20 kDa. Pasma mniejsze niż ta masa cząsteczkowa mogą być produktami degradacji. Wzory pasm powinny być w przybliżeniu równoważne między parami substratów.
    2. Ponieważ PrPC w obu substratach powinien być wrażliwy na PK, 10-25 μl każdego substratu należy poddać działaniu PK o końcowym stężeniu 100 μg/ml i wytrawić próbki z prędkością 1 000 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w wytrząsarce termicznej. Oceń pozostały sygnał PrP za pomocą SDS-PAGE16 i immunoblottingu17. Substraty z PrPres nie są odpowiednie do stosowania w badaniach CER.

3. Przygotuj nasiona czynnika TSE

  1. Uzyskać tkankę mózgową zakażoną TSE od gatunków będących przedmiotem zainteresowania i przygotować 10% (w/v) homogenat w 1x PBS pH 7,4, stosując metody wymienione w kroku 2.1 powyżej.
    UWAGA: Nasiona mogą być również wytwarzane z innych tkanek zakażonych TSE poza ośrodkowym układem nerwowym, jednak skuteczność konwersji substratów pochodzących z mózgu przez nasiona pochodzące z tkanek obwodowych zakażonych TSE nie została jeszcze eksperymentalnie oceniona w opublikowanej literaturze.
  2. Otrzymany homogenat (homogenaty) rozdzielić na objętości 100 - 300 μl w probówkach mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do przeprowadzenia testu CER.

4. CER Test

UWAGA: Test CER polega na dodaniu stosunkowo niewielkiej ilości PrPTSE (dostarczonej w "nasionach") z jednego gatunku do względnego nadmiaru PrPC (dostarczonego w niezainfekowanym "substracie" mózgu) z innego gatunku, który został częściowo zdenaturowany przy pH 3,5 lub 7,4. Po wydłużonym okresie inkubacji z wytrząsaniem, oparta na matrycy konwersja PrPC przez PrPTSE w każdej reakcji jest oceniana na podstawie sygnału densytometrycznego PrPres pozostałego po trawieniu farmakokinetycznym i wykryciu immunoblotów. Porównanie poziomów PrPres w substratach wcześniej zdenaturowanych przy pH 3,5 i 7,4 stanowi miarę bariery gatunkowej. Eksperymentalny przegląd tej procedury testowej przedstawiono na rysunku 1.

  1. Powoli rozmrażaj niezakażone pary substratów CER (test wymaga równych objętości substratów uprzednio zdenaturowanych zarówno przy pH 3,5, jak i 7,4) oraz roztwory nasion zakażone TSE, umieszczając je na wierzchu warstwy lodu (około 1 godzina rozmrażania).
  2. Po całkowitym rozmrożeniu odessać, a następnie kilkakrotnie wydalić każdy roztwór substratu przez igłę strzykawki 27 G, aby go ponownie zhomogenizować. Krótko sonikować każdy roztwór nasion zainfekowany TSE przez 10 sekund z maksymalną mocą ~30%. Utrzymuj wszystkie roztwory na lodzie podczas przygotowywania reakcji konwersji.
  3. Oznaczyć 5 pojedynczych, cienkościennych probówek PCR o niskim poziomie wiązania dla każdego badanego czynnika TSE.
  4. Przygotować reakcje konwersji w tych probówkach, dodając 5 μl 10% roztworu nasion zakażonego TSE do 95 μl (a) substratu CER przygotowanego o pH 7,4 i (b) substratu CER przygotowanego o pH 3,5.
    1. Dla każdej próbki doświadczalnej należy przygotować równoległe reakcje w parach substratów CER uprzednio zdenaturowanych zarówno przy pH 3,5, jak i 7,4.
    2. Zoptymalizuj proporcje nasion czynnika chorobotwórczego TSE do niezakażonego substratu mózgu poprzez empiryczne określenie. Zastosowane proporcje nasion do substratów utrzymują całkowitą objętość reakcji 100 μl i obejmują 1:99 μl, 2:98 μl i 5:95 μl. Dla większości zastosowań stosunek objętości nasion do substratu wynosi 5:95 μl i jest on przedstawiony w niniejszym protokole.
  5. Przygotować trzy próbki kontrolne dla każdego badanego czynnika TSE w następujący sposób: a) dodać 5 μl 10% roztworu nasiennego zakażonego TSE do 95 μl buforu konwersyjnego jako kontrolę dla wprowadzenia PrPres; dodać 5 μl buforu konwersyjnego do 95 μl substratu przygotowanego przy b) pH 3,5 i c) pH 7,4 jako kontrolę dla niespecyficznych, Konwersja bez szablonu.
  6. Krótko wymieszaj każdą próbkę w zamkniętej probówce PCR, aby dobrze wymieszać nasiona i substrat. Następnie wykonaj chwilowy impuls w miniwirówce stołowej o niskiej prędkości, aby usunąć dowolną objętość mieszaniny reakcyjnej uwięzionej w pokrywie probówki do PCR.
  7. Załaduj próbki do indywidualnie oznakowanych probówek do PCR do laboratoryjnej wytrząsarki termicznej wyposażonej w probówki do PCR. Wytrząsać próbki z prędkością 1 000 obr./min w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  8. Po wstrząśnięciu dodać sarkozyl do końcowego stężenia 2% (w/v) i PK do końcowego stężenia 100 μg/ml. Próbki trawić przy 1 000 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w wytrząsarce.
    UWAGA: Dodanie sarkozylu do próbek po konwersji pomaga w trawieniu PrPC przez farmakokinetykę. Fałszywie dodatnie sygnały w próbkach niewysiewanych (krok 4.5) są praktycznie eliminowane przez dodanie sarkozylu.
  9. Dodaj bufor próbki SDS-PAGE, podgrzewaj próbki do 95°C przez 5 minut i rozpuść pozostałePrP res w każdej próbce za pomocą SDS-PAGE16, a następnie immunoblotting17,
    UWAGA: Po dodaniu bufora próbki i podgrzaniu, próbki mogą być natychmiast przetworzone lub próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C przed immunoblottingiem. Wszystkie przedstawione tutaj dane zostały wygenerowane przy użyciu żelu i systemów transferowych Novex NuPAGE. Poszczególne próbki z testu CER poddano działaniu buforu próbki i środka redukującego zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki były następnie podgrzewane w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a 30 μl każdej próbki załadowano do 12% prefabrykatów bis-tris.
  10. Oblicz współczynnik efektywności konwersji (CER) jako miarę bariery gatunkowej. Zmierzyć poziomy PrPres za pomocą densytometrii17 i podzielić całkowitą gęstość próbki o pH 7,4 przez gęstość próbki o pH 3,5. Pomnóż przez 100, aby uzyskać wartość procentową.
  11. Zestawienie danych z niezależnych powtórzeń doświadczalnych w celu wygenerowania średniej CER ± odchylenia standardowego dla gatunku z danym czynnikiem chorobotwórczym TSE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skuteczne zastosowanie testu CER w dużej mierze zależy od jakości par substratów wykorzystywanych w reakcjach konwersji. Z tego powodu po przeprowadzeniu procedur przygotowania par substratów do testu CER należy wykonać immunoblotting kontroli jakości (Rycina 2). Oba substraty należy poddać analizie w ilości 10-25 μl metodą immunoblottingu. PrPC powinien być łatwo wykrywalny w każdym substracie, a poziomy PrPC muszą być w obu przypadkach zbliżone. Immunoreaktywność będzie widoczna g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W celu pomyślnego zakończenia tego protokołu należy zwrócić uwagę na poziomy PrPC w niezakażonej tkance mózgowej użytej do przygotowania substratu (krok 2.1.2) oraz stosunek nasion do substratów w reakcjach konwersji (krok 4.4.2). Z naszego doświadczenia wynika, że mózgi można pobrać do wykorzystania jako substrat CER po znacznym okresie pośmiertnym, o ile PrPC jest obecny przez immunoblotting (ryc. 4). W rzeczywistości zaobserwowano pewną autolizę w mózgach rysi rudych wykorzystywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Johnowi Olsenowi (Departament Zasobów Naturalnych Wisconsin), Tomowi Cooleyowi, Danielowi O'Brienowi i Steve'owi Schmittowi (Departament Zasobów Naturalnych Michigan) oraz Dr. Danielowi Walshowi (USGS National Wildlife Health Center) za pomoc w pozyskiwaniu tkanek. Dziękujemy również Laboratorium Higieny Stanu Wisconsin za usługi badań diagnostycznych oraz dr Tonie Rocke i jej personelowi (USGS National Wildlife Health Center) za korzystanie ze sprzętu. Jakiekolwiek użycie nazw handlowych, produktów lub firm służy wyłącznie celom opisowym i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12% żele Bis-Tris SDS-PAGELife TechnologiesNP0342
0,5 mm Koraliki z tlenku cyrkonuNext AdvanceZROB05Skuteczne są również inne odmiany kulek
Przeciwciałaróżni dostawcyWybierz odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe do wykrywania immunoblot PrPres z gatunków będących przedmiotem zainteresowania
HomogenizatorkulkowyDalej AdvanceBBY24M
WirówkaBeckman Coulter369434Wysoka prędkość z regulacją temperatury
Rurki stożkowedowolnej marki
Aplikator z bawełnianą końcówkąUlineS-18991
Dźwiękonik CuphornHeat Systems-UltrasonicsW-380Heat Systems-Ultrasonics, Inc. to teraz Qsonica, LLC
Densytometria oprogramowanieUVPVision Works LS Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazówInne programy, takie jak NIH ImageJ, również będą działać
Homogenizator DounceKimble Chase885300
Mieszalnik end-over-endLabnet InternationalH5600
Kwas etylenodiaminotetraoctowyBoston BioproductsP-770Niebezpieczna substancja chemiczna: działanie drażniące
na oczyChlorowodorek guanidyny, 8 MThermo Fisher Scientific24115Niebezpieczna substancja chemiczna: ostra toksyczność, podrażnienie skóry, podrażnienie oczu
Blok grzewczyFisher Scientific11-718
Kwas solnySigma-Aldrich435570Niebezpieczna substancja chemiczna: mocny kwas
Bufor próbki dodecylosiarczanu litu, 4xLife TechnologiesNP0008Niebezpieczna substancja chemiczna: skóra i podrażnienie dróg oddechowych, poważne uszkodzenie oczu, łatwopalny
stały metanolFisher ScientificA454-4Niebezpieczna substancja chemiczna: ostra toksyczność, łatwopalna ciecz
Probówki do mikrowirówekdowolnej marki
Mini-wirówkaLabnet InternationalC1301
N-lauroilo-sarkozyna (sarkozyl)Sigma-Aldrich L-5125Niebezpieczna substancja chemiczna: ostra toksyczność, podrażnienie skóry, uszkodzenie oczu
Nonidet P-40AmrescoM158Niebezpieczna substancja chemiczna: podrażnienie skóry, uszkodzenie oczu
System żelowy SDS-PAGESystemelektroforezy Life Technologies NuPAGEsystemy SDS-PAGE również będą działać
Probówki do PCR (o niskim stopniu wiązania)AxygenPCR-02-L-C
HomogenizatortłuczkowyFisher Scientific03-392-106
pH-metrSentronSI600
Membrana z polifluorku winyluMilliporeIPVH00010
Proteinaza KPromegaV3021Niebezpieczna substancja chemiczna: podrażnienie skóry i oczu, uczulenie na drogi oddechowe, toksyczność narządowa
Środek redukujący do próbek SDS-PAGE, 10xLife TechnologiesNP0009
Chlorek soduFisher Scientific7647-14-5
Deoksycholan soduSigma-Aldrich D6750Niebezpieczna substancja chemiczna: ostra toksyczność
Dodecylosiarczan soduThermo Fisher Scientific28364Niebezpieczna substancja chemiczna: ostra toksyczność, podrażnienie skóry, uszkodzenie oczu, łatwopalne ciało stałe
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881Niebezpieczna substancja chemiczna; mocna podstawa
StrzykawkaBD BiosciencesróżneUżyj strzykawki o rozmiarze odpowiednim do objętości podłoża, które ma być homogenizowane
Igły strzykawkoweBD Biosciencesróżne
Wytrząsarka termiczna (wytrząsarka do probówek PCR)Hangzhou Wszystkie instrumenty ShengMS-100
Tris baseBio Basic77-86-1Niebezpieczna substancja chemiczna: podrażnienie skóry, oczu, dróg oddechowych
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Niebezpieczna substancja chemiczna: ostra toksyczność, podrażnienie oczu
VortexerFisher Naukowy12-812
Inne

Bibliografia

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722(2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32(2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157(2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753(2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623(2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena bariery gatunkowejtest in vitrowsp czynnik wydajno ci konwersjioporno na proteinaz Kimmunoblotting SDS PAGEhomogenat tkanki m zgowejinkubacja czynnika TSEdenaturacja PrP Cprotok testu CER

Powiązane artykuły