Artykuł metodologiczny

Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych

23.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52543

⸱

26 lutego 2015

 ,  , 
1Centre for Neuroprosthesis, EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI, 2Blond McIndoe Research Laboratories, Institute of Inflammation & Repair, The University of Manchester, 3University Hospital of South Manchester

W tym artykule

Podsumowanie

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury zawierające neurony czuciowe obwodowego układu nerwowego. Po dysocjacji mogą być hodowane wspólnie z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) podobnymi do SC, stanowiąc cenny model do badania regeneracji i mielinizacji nerwów in vitro, naśladując środowisko in vivo w miejscu urazu.

Streszczenie

Neurony zwojów korzenia grzbietowego (DRG), znajdujące się w otworach międzykręgowych kręgosłupa, mogą być wykorzystane do stworzenia systemu in vitro ułatwiającego badania nad regeneracją i mielinizacją nerwów. Komórki glejowe obwodowego układu nerwowego, komórki Schwanna (SC), są kluczowymi czynnikami ułatwiającymi te procesy; Dlatego tak ważne jest, aby interakcje tych składników komórkowych były badane razem. Bezpośredni kontakt między neuronami DRG a komórkami glejowymi dostarcza dodatkowych bodźców wyczuwanych przez specyficzne receptory błonowe, co dodatkowo poprawia odpowiedź neuronalną. SC uwalniają czynniki wzrostu i białka w pożywce hodowlanej, które zwiększają przeżywalność neuronów oraz stymulują kiełkowanie i wydłużanie neurytów. Jednak SC wymagają długiego czasu proliferacji, aby mogły być wykorzystywane do zastosowań w inżynierii tkankowej i poświęcenia zdrowego nerwu na rzecz ich pozyskiwania. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) zróżnicowane w fenotyp SC są ważną alternatywą dla SC w celu stworzenia modelu kohodowli z neuronami DRG w celu zbadania regeneracji nerwów. Niniejsza praca przedstawia szczegółowy i powtarzalny protokół krok po kroku do pobierania zarówno neuronów DRG, jak i ASC od dorosłych szczurów; różnicowanie ASC w kierunku fenotypu SC; i łączy te dwa typy komórek w bezpośrednim systemie kohodowli w celu zbadania wzajemnych oddziaływań między neuronami a SC w obwodowym układzie nerwowym. Narzędzie to ma ogromny potencjał w optymalizacji konstruktów inżynierii tkankowej do naprawy nerwów obwodowych.

Wprowadzenie

Urazy nerwów obwodowych są powszechne z około 9 000 przypadków w Wielkiej Brytanii, które występują każdego rokuw populacji głównie młodej i pracującej1. Pomimo mikrochirurgicznych technik naprawy nerwów, normalne przywrócenie funkcji jest nieosiągalne, co skutkuje upośledzeniem czucia w dłoni, zmniejszeniem funkcji motorycznych oraz częstym bólem i nietolerancją zimna2. Takie urazy mają głęboki i trwały wpływ na pacjenta i jego zdolność do wykonywania czynności życia codziennego, przy czym mniej niż 60% osób wraca do pracy3.

Po urazie, fenotyp i morfologia neuronów i komórek Schwanna (SC) zmieniają się, aby stworzyć odpowiednie środowisko umożliwiające kiełkowanie aksonów. W przypadku przecięcia nerw jest podzielony na kikuty proksymalne i dystalne; kikut proksymalny jest punktem, z którego zachodzi proces regeneracji, podczas gdy kikut dystalny ulega zwyrodnieniu Wallera, po czym SC odrywa się od uszkodzonych aksonów, odróżnicowuje się i proliferuje. Ma to zasadnicze znaczenie dla usunięcia resztek mieliny i przygotowania dystalnego kikuta do regeneracji nerwów 4,5. Kiełkowanie aksonów jest wspomagane przez produkcję czynników neurotroficznych i chemokin uwalnianych przez SC w dystalnym kikutu i kierowanych przez blaszkę podstawną pozostawioną w wyniku zwyrodnienia Wallera6,7. SC ustawiają się wzdłuż regenerującego się aksonu, tworząc pasma Büngnera, które wspomagają wzrost aksonu w kierunku narządu docelowego, zmniejszając rozgałęzienia poza rurką wewnątrzrdzeniową. Po reinerwacji SC tworzą nową osłonkę mielinową owijającą zregenerowane aksony, ale funkcje czuciowe i motoryczne są przywracane tylko częściowo8.

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury znajdujące się w otworze międzykręgowym kręgosłupa, zawierające czuciowe komórki neuronalne unerwiające narządy obwodowe. Po dysocjacji mogą być wykorzystane jako odpowiedni model in vitro do badań nad regeneracją nerwów 9-11, w tym do badań nad tworzeniem mieliny. W szczególności dorosłe neurony DRG naśladują charakterystykę in vivo tych komórek i stanowią potężne narzędzie do badania nowych strategii naprawy nerwów obwodowych w inżynierii tkankowej.

Współkultury reprezentują dynamiczny system, który symuluje in vitro wzajemne oddziaływanie dwóch (lub więcej) typów komórek w określonym środowisku in vivo. Jedną z zalet tych modeli kohodowli komórkowych jest elastyczność i wysoka kontrola, jaką można wywierać na środowisko zewnątrzkomórkowe. Neurony DRG były często używane w systemach kohodowlanych z SC w celu naśladowania rzeczywistych interakcji zachodzących między dwoma typami komórek w obwodowym układzie nerwowym10,12–14. Wykazano, że SC wydziela białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i czynniki wzrostu, które mogą znacznie poprawić zdolność neuronów DRG do przetrwania i kiełkowania neurytów15,16. Jednak SC wymagają długich okresów czasu do namnażania się i pomimo postępów w technice hodowli komórkowych nadal trudno jest wygenerować odpowiednią liczbę komórek do zastosowań w inżynierii tkankowej. Ponadto konieczne jest poświęcenie zdrowego nerwu w celu zebrania autologicznego SC. Dlatego różnica w pozyskiwaniu SC jest ważna zarówno dla inżynierii tkankowej, jak i badań in vitro regeneracji nerwów. Z tego punktu widzenia ASC można uznać za cenną alternatywę dla rozwoju konstruktu inżynierii tkankowej, który ma być stosowany do naprawy nerwów obwodowych17,18. Wcześniejsze prace wykazały zdolność tych komórek do różnicowania się w podobny do SC ASC, wykazujący ekspresję charakterystycznych markerów glejowych, takich jak S-100, p75 i kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP)19, a także białko mieliny zero (P0)20. Zaobserwowano również wydzielanie glejowych czynników wzrostu, takich jak neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF), czynnik wzrostu nerwów (NGF) i neurotroficzny czynnik pochodzenia glejowego (GDNF)21,22. Dlatego podobny do SC ASC może być stosowany jako promotor regeneracji nerwów obwodowych, jak wykazano zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo 23-26. Ponadto ASC może być pozyskiwany za pomocą minimalnie inwazyjnych procedur w większej liczbie w porównaniu z innymi typami komórek macierzystych; częstość występowania komórek macierzystych w tkance tłuszczowej jest od 100 do 1000 razy wyższa niż w szpiku kostnym27 i mają one wyższy współczynnik proliferacji w porównaniu z SC i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi szpiku kostnego.

Ta praca ma na celu dostarczenie szczegółowego protokołu do przeprowadzania wysoce efektywnych zbiorów odpowiednio zdysocjowanych neuronów DRG i ASC, przy czym te ostatnie są różnicowane w komórki podobne do SC. Wspólna hodowla tych dwóch typów komórek zapewni zatem bardzo praktyczny system, który może być wykorzystany w przyszłych badaniach nad zdolnością neuronów DRG do kiełkowania neurytów i mechanizmami tworzenia mieliny na różnych rusztowaniach w inżynierii tkanki nerwowej.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku.

1. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Przed rozpoczęciem pobierania tkanek i komórek sprawdź, czy wszystkie narzędzia są sterylne. W razie potrzeby przeprowadź autoklaw w autoklawie parę ostrych nożyczek chirurgicznych, bardzo cienkie kleszcze i cienkie standardowe kleszcze. Wysterylizuj również każdy substrat przed wysiewem komórek, stosując sterylizację UV, ekspozycję na etanol lub sterylizację parową, w zależności od potrzeb.
  2. Przygotowanie pożywek do pobierania i różnicowania komórek macierzystych
    1. Przygotować pożywkę do wzrostu komórek macierzystych, zawierającą minimalną ilość niezbędnego podłoża (α-MEM) uzupełnionego 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 200 mM L-glutaminy i 1 % penicyliny-streptomycyny (PS).
    2. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy forskoliny, rozpuszczając 10 mg forskoliny w 2,436 ml sterylnego dimetylosulfoksydu. Stosować w końcowym stężeniu 14 μM.
    3. Przygotować roztwór podstawowy kwasu retinowego o stężeniu 35 mg/ml, rozpuszczając 50 mg w 1,43 ml sterylnego sulffoxydu dimetylu. Stosować w końcowym stężeniu 350 ng/ml.
    4. Przygotować zapasy płytkowego czynnika wzrostu (PDGF) (100 μg/ml) przez rozpuszczenie 10 μg liofilizowanego proszku w 100 μl destylowanej sterylnej wody. Stosować w końcowym stężeniu 5 ng/ml.
    5. Przygotować podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) (100 μg/ml) rozpuszczając 50 μg liofilizowanego proszku w 500 μl destylowanej sterylnej wody. Stosować w końcowym stężeniu 10 ng/ml.
    6. Przygotować pożywkę do różnicowania komórek macierzystych, zawierającą pożywkę do wzrostu komórek macierzystych uzupełnioną 14 μM forskoliną, 126 ng/ml glejowego czynnika wzrostu-2 (GGF-2), płytkopochodnego czynnika wzrostu 5 ng/ml (PDGF) i 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
  3. Przygotowanie pożywek i roztworów podstawowych do zbierania i dysocjacji neuronów
    1. Przygotować pożywkę Bottensteina i Sato (BS)28, dodając 1 % PS i 1 % dodatku N2 do pożywki F12 Ham's. Oblicz końcową potrzebną objętość jako 500 μl na studzienkę (w przypadku korzystania z płytki 24-dołkowej).
    2. Przygotować wywar z kolagenazy dożylnej w pożywce F12 szynki o stężeniu 1,25 % wag./v. Przefiltrować roztwór i przechowywać w temperaturze -20 °C jako 200 μl podwielokrotności.
    3. Przygotować wywar z bydlęcej trypsyny trzustkowej w pożywce F12 szynki o stężeniu 2,5 % wag./v, wysterylizować pod wpływem filtru i przechowywać w temperaturze -20 °C jako 200 μl podwielokrotności.
    4. Przygotować roztwór podstawowy czynnika wzrostu nerwów (NGF) o stężeniu 5 μg/ml w sterylizowanym przez filtr roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 1 mg/ml wolnym od kwasów tłuszczowych w pożywce F12 i przechowywać w temperaturze -20 C jako 200 μl podwielokrotności. Nie filtrować NGF po rozpuszczeniu.
  4. W przypadku, gdy nie przeprowadzono modyfikacji powierzchni, pokryć szkiełka nakrywkowe/płytki poli-D-lizyną (0,1 mg/ml przez 15 minut w temperaturze pokojowej) i/lub lamininą (2-10 μg/cm2 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C) w celu wsparcia przyczepu neuronów i wzrostu neurytów, jeśli jest to właściwe.
  5. Zawsze przed użyciem należy rozgrzać media w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.

2. Pozyskiwanie i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) do fenotypu SC

  1. Pozyskiwanie ASC z tłuszczu trzewnego i pachwinowego dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley
    1. Przed rozpoczęciem przygotuj probówkę z 10-15 ml zrównoważonego roztworu soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) uzupełnionego 1% v/v roztworu PS i przechowuj na lodzie do czasu zebrania tłuszczu.
    2. Zakończ szczura przez zwichnięcie szyjki macicy i ścięcie głowy. Ogol szczura i wykonaj nacięcie przez skórę brzucha, odsłaniając narządy wewnętrzne i unikając krwawienia. Usuń tłuszcz trzewny otaczający żołądek i jelita (zwykle charakteryzujący się tłustą żółtą konsystencją) oraz tłuszcz pachwinowy otaczający jądra od dorosłego samca szczura Sprague-Dawley. Przenieść tłuszcz z probówki zawierającej HBSS na lód.
    3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego (klasa II) drobno posiekać tłuszcz za pomocą nożyczek i sterylnej żyletki, aż do uzyskania drobnej konsystencji, a następnie przenieść go do probówki zawierającej 15 ml 0,2% wag./v roztworu kolagenazy typu I, świeżo przygotowanego i wysterylizowanego przez filtr w danym dniu.
    4. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i pozostawić tkankę tłuszczową do strawienia w obecności enzymu przez 30 min-1 godzinę w ciągłym mieszaniu. Uważnie monitoruj trawienie i zatrzymaj się, zanim tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana, poprawi to żywotność komórek i ich wydajność. Przefiltruj niezdysocjowaną tkankę przez sitko do komórek o wielkości 100 μm.
      UWAGA: Dobre trawienie tkankowe spowoduje uzyskanie jednorodnej konsystencji tłuszczu, widocznej gołym okiem przy delikatnym obracaniu tubki, nabierając beżowego wyglądu.
    5. Zneutralizować enzym przez dodanie 15 ml pożywki do wzrostu komórek macierzystych zawierającej płodową surowicę bydlęcą w temperaturze 37 °C i odwirować roztwór o stężeniu 160 g przez 10 minut w celu zebrania frakcji zrębu naczyniowego, w tym komórek macierzystych, na dnie probówki.
    6. Na tym etapie osad można ponownie zawiesić w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek w celu usunięcia zanieczyszczenia krwinek. Po ponownym zawieszeniu i pipetowaniu przez 1 minutę dodać 10 ml świeżej pożywki do wzrostu komórek macierzystych i odwirowywać przy 160 g przez 10 minut.
    7. Ostrożnie odessać supernatant z probówki, zwracając uwagę na osadzony na dnie osad komórek. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych, przenieść je do kolb o długości 75cm2 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 . Utrzymuj komórki na poziomie sub-konfluencji do przejścia 1-2, zmieniając podłoże co 3 dni.
  2. Różnicowanie ASC do fenotypu SC
    1. W miejscu pasażu 1-2 wyjąć pożywkę do hodowli komórek macierzystych z kolby o długości 75cm2 i zastąpić ją 10 ml świeżej pożywki zawierającej 1 mM β-merkaptoetanolu, świeżo przygotowanej i wysterylizowanej filtrem w danym dniu. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 przez 24 godziny. Na tym etapie ważne jest, aby komórki zostały wysiane w niskiej gęstości (30%) przed rozpoczęciem różnicowania.
    2. Dokładnie umyj komórki HBSS, odessaj i zastąp 10 ml pożywki zawierającej 350 ng/ml kwasu retinowego. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 przez 72 godziny. Staraj się zminimalizować ekspozycję pożywki komórkowej na światło.
    3. Po 3 dniach dokładnie umyć komórki HBSS, odessać i zastąpić 10 ml pożywki do różnicowania komórek macierzystych (patrz krok 1.2.6). Utrzymuj komórki na poziomie sub-konfluencji, zmieniając podłoże co 3 dni.
      UWAGA: Po 2 tygodniach inkubacji ASC różnicują się w ASC podobne do SC, wyrażając swój charakterystyczny fenotyp (jak wykazano przez Kinghama i wsp.5). Mogą być następnie używane aż do 10. przejścia bez zauważalnych zmian w zachowaniu29 .

3. Zbiór i dysocjacja neuronów zwojów korzenia grzbietowego (DRG)

  1. Zakończ szczura przez zwichnięcie szyjki macicy i ścięcie głowy. Ogol szczura i unieś skórę, aby odsłonić kręgosłup. Za pomocą ostrych nożyczek wytnij kręgosłup, zwracając szczególną uwagę na ograniczone narządy i naczynia krwionośne. Przenieść kręgosłup do komory bezpieczeństwa biologicznego (klasa II) za pomocą szalki Petriego i usunąć każdą część grzbietową.
  2. Podziel kręgosłup na pół wzdłuż osi podłużnej za pomocą sterylnych i ostrych nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić tkankę pępowinową. W tym momencie pomocne jest przecięcie kręgosłupa na dwa mniejsze segmenty poniżej poziomu klatki piersiowej, aby ułatwić obsługę podczas pobierania neuronów DRG. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie usuń całą tkankę pępowinową, uważając, aby nie ciągnąć i nie usuwać korzeni DRG. W ten sposób DRG i korzenie zostaną odsłonięte w kanałach kręgowych, nadal zamkniętych w kolumnie. Obserwuj DRG jako białe włókna wychodzące bezpośrednio z kanałów.
  3. Wyciągnij cały korzeń DRG (nie tylko DRG) z kanałów kręgowych za pomocą bardzo cienkich kleszczy, wchodząc głęboko w kanały kręgowe i zwracając uwagę, aby nie uszkodzić korzeni zwojów. Przenieść DRG na małą szalkę Petriego (60 mm2) zawierającą 3-4 ml pożywki F12 z szynką uzupełnioną o 1% PS. Jeśli używasz różnych zwierząt, użyj oddzielnych naczyń.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym oczyść DRG z nadmiaru korzeni nerwowych otaczających zwoje za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela, aby zmniejszyć zanieczyszczenie komórek glejowych. Przenieść DRG na małą szalkę Petriego (35mm2) z 1,8 ml świeżej pożywki F12.
  5. Dodać 200 μl 1,25 % wag./v roztworu podstawowego kolagenazy typu IV (końcowe stężenie 0,125%) i inkubować DRG w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 przez 1 godzinę. Ostrożnie odessać pożywkę szklaną pipetą, zwracając uwagę, aby nie zassać ani nie uszkodzić DRG. Dodać świeżą pożywkę F12 uzupełnioną enzymem kolagenazy typu IV o s.w./v i inkubować przez 1 godzinę, jak opisano wcześniej.
  6. Zassać pożywkę i delikatnie umyć DRG pożywką F12. Następnie dodać 1,8 ml pożywki F12 i 200 μl trypsyny (końcowe stężenie 0,25 % wag./v) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 przez 30 min.
  7. Usunąć trypsynę i dodać 1 ml pożywki F12 uzupełnionej 500 μl FBS w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej. Zassać pożywkę i delikatnie przemyć DRG pożywką F12 trzy razy, aby usunąć ślady surowicy.
  8. Dodać 2 ml świeżej pożywki F12 i ostrożnie przenieść DRG wraz z pożywką do probówki o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety. Delikatnie rozdziel neurony DRG, pipetując w górę i w dół (około 8-10 razy) za pomocą szklanej pipety (alternatywnie można użyć plastikowych końcówek).
  9. Pozwól, aby osadzanie się osadu na dnie probówki i zbierz podłoże w nowej probówce. Dodać 2 ml świeżej pożywki F12 do probówki zawierającej osad i powtórzyć dysocjację mechaniczną za pomocą szklanej pipety. Powtarzaj ten krok, aż zawiesina stanie się jednorodna (około 3-4 razy) i zbierz cały zdysocjowany DRG w nowej probówce. Metoda ta zmniejsza stres wynikający z dysocjacji mechanicznej i poprawia żywotność neuronów.
  10. Przefiltruj powstałą homogenizowaną zawiesinę do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sitka do komórek 100 μm, aby usunąć niezdysocjowane neurony i inne zanieczyszczenia. Na tym etapie wygodne może być najpierw przefiltrowanie zawiesiny komórek do probówki o pojemności 50 ml, a następnie przeniesienie roztworu do mniejszej probówki za pomocą szklanej pipety. Odwirować zawiesinę o stężeniu 110 g przez 5 minut.
  11. Przygotować 15 % albuminę surowicy bydlęcej (BSA), dodając 500 μl 30 % roztworu BSA do 500 μl pożywki F12. Powoli pipetować roztwór w dół ścianki probówki o pojemności 15 ml, aby uzyskać stopniowy ślad białka. Na tym etapie pomocne jest trzymanie rurki pod kątem 45° i powolne zwalnianie BSA, używając cyfr na rurze falcon jako odniesienia dla formującego się "toru".
  12. Odessać supernatant z kroku 3.10, pozostawiając 500 μl na dnie probówki i ponownie zawiesić osad komórek w tym samym podłożu. Powoli pipetować zawiesinę wzdłuż śladu białkowego przygotowanego wcześniej w kroku 3.11 (użyć liczb na probówce jako odniesienia) i wirować przy 500 g przez 5 minut.
  13. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml zmodyfikowanej pożywki BS (lub pożywki mieszanej do kokultury ASC/DRG podobnej do SC, jak opisano poniżej w kroku 4.5.
    UWAGA: Objętość do ponownego zawieszenia neuronów DRG może być zwiększona do rzeczywistej wymaganej objętości, w zależności od pożądanego końcowego stężenia komórek i liczby próbek do wysiania. Jedno zwierzę dostarczy wystarczającą ilość komórek do eksperymentu na 24-dołkowej płytce.
  14. Inkubować wysiane próbki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny, aby umożliwić przyłączenie komórek, a na koniec dodać świeżą pożywkę BS uzupełnioną 50 ng/ml czynnika wzrostu nerwów (NGF).

4. Bezpośrednia współkultura neuronów ASC i DRG podobnych do SC

  1. Utrzymuj ASC podobny do SC w kulturze na poziomach sub-konfluencji, jak opisano w kroku 2.2.3. Dwadzieścia cztery godziny przed pobraniem DRG odessać pożywkę różnicującą komórki macierzyste i umyć komórki HBSS. Odsysać i inkubować w 3 ml trypsyny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 min.
  2. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy wszystkie komórki odłączyły się od kolby. Delikatnie postukać w kolbę, aby ułatwić odłączenie. Dodać 7 ml pożywki, aby zatrzymać reakcję trypsyny, zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 110 g przez 5 minut.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki różnicującej komórki macierzyste. Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę komórek zgodnie z wymaganym końcowym stężeniem. Idealnie, wysianie 20 000 ASC/cm2 podobnego do SC zagwarantowałoby zlewającą się warstwę komórek.
  4. Wysiać podobny do SC ASC na podłożu i inkubować w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 przez 24 godziny, aby umożliwić przyłączenie komórek.
  5. Po 24 godzinach inkubacji odessać pożywkę i dodać neurony DRG na komórki, jak opisano w krokach 3.14 i 3.15. Zmienić pożywkę na pożywkę mieszaną zawierającą 50 % pożywki różnicującej komórki macierzyste i 50 % pożywki BS. Ponadto zmniejszenie stężenia FBS do 1-2,5 % w końcowym mieszanym podłożu pomaga uniknąć proliferacji zanieczyszczających komórek satelitarnych pochodzących z dysocjacji DRG.
  6. Próbki z kokulturą należy inkubować w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 i utrzymywać w kulturze przez wymagany czas do przyszłych badań.

Wyniki

Kultury dysocjowanych neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) stanowią odpowiedni model in vitro do badania regeneracji nerwów. Jednakże nieprzetworzone podłoża nie zapewniają właściwego środowiska do przylegania neuronów DRG i wydłużania neurytów. ASC o fenotypie podobnym do komórek Schwanna (SC-like ASC) są zdolne do produkcji czynników wzrostu i chemokin19, które po uwolnieniu do pożywki hodowlanej mogą poprawić zdolność neuronów DRG do wypuszczania neurytów. Obecność SC-like ASC w systemie hodowlanym może zatem odgrywać istotną rolę w regulacji funkcji DRG.

Niniejszy protokół (Rycina 1) przedstawia procedurę bezpośredniej kokultury ASC o fenotypie podobnym do komórek Schwanna (SC-like ASC) i neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG), podczas której komórki neuronalne wchodzą w bezpośredni kontakt z wcześniej wysianymi SC-like ASC. Główną trudnością związaną z tą procedurą jest wysoka zmienność liczby neuronów DRG pozyskiwanych od różnych zwierząt. Z tego powodu wyniki mogą być czasem trudne do porównania, dlatego podczas procedury wysiewu należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby w każdym eksperymencie uzyskać porównywalną gęstość komórek. Protokół został zoptymalizowany w celu zminimalizowania liczby komórek satelitarnych pozostających po dysocjacji neuronów DRG przy użyciu gradientu BSA (krok 3.11). Dodatkowo, do pożywki BS można dodać cytarabinę (ARA-C), aby dodatkowo zredukować populację komórek satelitarnych, zgodnie z opisem Kinghama et al.11. Jednakże czas trwania tej obróbki musi być starannie zrównoważony z żywotnością neuronów DRG i SC-like ASC, która również jest wpływana przez obecność suplementu ARA-C w pożywce hodowlanej. W związku z tym bardzo trudno jest uzyskać system całkowicie wolny od komórek satelitarnych.

Rycina 2 przedstawia znaczenie ASC o fenotypie przypominającym komórki Schwanna (SC-like ASC) dla wypustkowania neurytów neuronów DRG w modelu kokultury z wykorzystaniem niezmodyfikowanych i zmodyfikowanych chemicznie folii z polikaprolaktonu (PCL) jako podłoży. Neurony DRG hodowano przez 3 dni w obecności lub przy braku SC-like ASC, stosując mieszany roztwór zawierający 50% medium BS i 50% medium do różnicowania komórek macierzystych, zgodnie z opisem w kroku 4.5. Po tym okresie komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie i barwiono przeciwciałami przeciwko β-tubulinie III (neurony DRG) oraz S100 (SC-like ASC), aby zbadać morfologię komórek oraz zdolność neuronów DRG do tworzenia wypustek neurytowych. Na niezmodyfikowanych powierzchniach w przypadku braku SC-like ASC nie zaobserwowano neurytów (Rycina 2A), podczas gdy w systemie kokultury wyraźnie poprawiono tworzenie neurytów (Rycina 2C). Średnia liczba neurytów na ciało komórkowe znacząco wzrosła z 0 do 3 w obecności komórek macierzystych. Potwierdzenie tych wyników uzyskano również w analizie z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), przedstawionej na Rycynie 3. W szczególności obrazy SEM pokazują, że zdolność neuronów DRG do wypustkowania neurytów występuje preferencyjnie w połączeniu z SC-like ASC, co wskazują żółte strzałki na Rycynie 3C.

Należy zaznaczyć, że stosowanie podłoży zmodyfikowanych lamininą (w tym peptydów pochodnych lamininy) w systemach hodowlanych zawierających neurony DRG jest często definiowane jako odpowiedni warunek dla hodowli komórek neuronalnych, wykazując znaczący wpływ na formowanie i wydłużanie neurytów30–32. Jednak wyniki przedstawione na Ryc. 2D oraz Ryc. 3D wykazują, że połączenie sygnałów chemicznych i biologicznych może dodatkowo wzmocnić odpowiedź neuronów DRG.

Schemat subkultury komórek tłuszczowych i ekstrakcji neuronów DRG; proces współhodowli DRG/dASC.
Rysunek 1. Przygotowanie bezpośredniego systemu współhodowli DRG-SC-like ASC. Neurony DRG oraz ASC pochodzą odpowiednio z kolumny kręgosłupa oraz z tłuszczu trzewnego i pachwinowego dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley. Po trawieniu tkanki tłuszczowej za pomocą kaskady reakcji enzymatycznych, ASC są różnicowane w komórki typu SC (SC-like) i utrzymywane w warunkach subkonfluencyjnych do momentu zapotrzebowania. ASC typu SC są wysiewane na każde podłoże 24 hr przed pobraniem DRG. W dniu eksperymentu neurony DRG są ekstrahowane i dysocjowane poprzez serię działań enzymatycznych i mechanicznych. Następnie neurony są wysiewane na wierzch wcześniej wysianych ASC typu SC i utrzymywane w hodowli do czasu przeprowadzenia analiz (pożywka mieszana: zawierająca 50 % pożywki do różnicowania komórek macierzystych i 50 % zmodyfikowanej pożywki BS). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek nerwowych, uwydatniające strukturę komórek i różnicowanie wzrostu.
Rycina 2. Obrazy fluorescencyjne neuronów DRG w różnych warunkach hodowli. (A) niepoddane modyfikacji folie PCL; (B) folie PCL modyfikowane RGD; (C) kokultura z ASC podobnymi do SC na niepoddanych modyfikacji foliach PCL; (D) kokultura z ASC podobnymi do SC na foliach PCL modyfikowanych RGD. Komórki utrzymywano w hodowli przez 3 dni w mieszanym roztworze zawierającym 50 % zmodyfikowanego medium BS i 50 % medium do różnicowania komórek macierzystych. Po tym czasie komórki utrwalono w 4 % paraformaldehydzie, permeabilizowano w roztworze Triton-X, a niespecyficzne miejsca wiązania zablokowano 1 % BSA. Następnie komórki neuronalne barwiono przeciwciałami przeciwko β-tubulinie III (FITC; zielony), a ASC podobne do SC przeciwko S-100 (AlexaFluor568; czerwony). Na koniec jądra barwiono DAPI (niebieski). Obrazy pozyskano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Olympus BX60, Japonia). (Wydrukowano za zgodą de Luca et al.30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza SEM adhezji komórek na porowatym rusztowaniu; mikrografia podkreśla morfologię komórek.
Rycina 3. Obrazy SEM neuronów DRG wróżnych warunkach hodowli. (A) niezmodyfikowane filmy PCL (B) filmy PCL modyfikowane RGD; (C) ko-hodowla z ASC o fenotypie SC na niezmodyfikowanych filmach PCL; (D) ko-hodowla z ASC o fenotypie SC na filmach PCL modyfikowanych RGD. Żółte strzałki wskazują punkty kontaktu między ASC o fenotypie SC a DRG, potwierdzając ich bezpośrednią interakcję w systemie ko-hodowli. Komórki utrzymywano w hodowli przez 3 dni i utrwalano w 2,5 % glutaraldehydzie. Po dehydratacji w szeregu etanolu o rosnącym stężeniu (50 %, 70 %, 90 %, 100 %), komórki wypłukano w heksametylodisylazanie i wysuszono przed zamocowaniem na stubach i napyleniem złotem do analizy SEM. Obrazy wykonano za pomocą SEM (Zeiss EVO60, UK) przy napięciu przyspieszającym 10kV. (Przedruk za zgodą de Luca et al.30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Neurony DRG są często wykorzystywane w komórkach neuronalnych do hodowli pierwotnej w celu zbadania regeneracji neuronów po aksotomii in vivo. W tym miejscu przedstawiono dokładny protokół pozyskiwania DRG od dorosłych szczurów, mający na celu zmniejszenie populacji komórek satelitarnych w otaczającym środowisku bez uszczerbku dla przeżycia neuronów. Ponieważ ASC zróżnicowane w fenotyp podobny do SC są ważną alternatywą dla SC w terapiach komórkowych, szczegółowo opisano również system kohodowli ASC/DRG podobny do SC.

Powszechnie wiadomo, że laminina (lub sekwencje peptydowe pochodzące z lamininy) mają korzystny wpływ na przeżycie neuronów i tworzenie neurytów31–33. Dlatego podczas wykonywania hodowli neuronów DRG zaleca się wcześniejsze pokrycie każdego substratu lamininą, aby uniknąć utraty funkcjonalności komórek neuronalnych. Koncepcja powłok lamininowych ma również zastosowanie do substratów biomateriałowych do projektowania konstrukcji inżynierii tkankowej, takich jak poli-kaprolakton (PCL) często stosowany do wytwarzania przewodów nerwowych30. Wcześniejsze prace wykazały również, że matryce fibrynowe są odpowiednimi materiałami do hodowli neuronów w trójwymiarze11.

Oprócz powlekania białek, modele kokultur zapewniają cenne warunki dla przetrwania neuronów DRG oraz odpowiednie środowisko do badania interakcji, które zachodzą między neuronami a SC w obwodowym układzie nerwowym po urazie. Komórki można również przeszczepiać in vivo za pomocą urządzeń neuronowych w celu skrócenia czasu rekrutacji komórek autologicznych w miejscu urazu. Jest to szczególnie ważne w przypadku ciężkich urazów, które mogą prowadzić do starzenia się/śmierci komórek i zaniku mięśni. Chociaż SC są najważniejszymi komórkami glejowymi biorącymi udział w procesie regeneracji i mielinizacji nerwów obwodowych, ich ograniczona dostępność i powolne tempo proliferacji sprawiają, że nie nadają się do zastosowań w inżynierii tkankowej34. ASC są ważną alternatywą ze względu na ich obfitość i zdolność do różnicowania się w fenotyp SC, ekspresję specyficznych markerów glejowych i wykazywanie funkcjonalnych podobieństw do natywnego SC19. ASC są również zdolne do wytwarzania białek i czynników wzrostu5, które mogą być korzystne dla tworzenia i rozszerzania neurytów przez neurony DRG w systemie kohodowli. Jednak w zależności od potrzeb eksperymentalnych można ustanowić dwa różne systemy kohodowli. Metoda zaproponowana w tym artykule jest poprawioną wersją dobrze ugruntowanego protokołu w naszym laboratorium11 i obejmuje bezpośredni kontakt między dwoma typami komórek (bezpośrednia kokultura), w której drugi typ komórek (neurony DRG) są wysiewane na wierzchu pozostałych (ASC podobny do SC). Podejście to opiera się na wcześniejszych odkryciach, które wykazały znaczenie obecności warstwy komórek glejowych na podłożu podczas wysiewu kultur neuronalnych35-37. Efekt ten jest prawdopodobnie spowodowany interakcjami komórka-komórka poprzez integryny DRG i cząsteczki ECM zdeponowane z ASC i innych wskazówek na powierzchni komórki macierzystej. Zaobserwowano również, że zmniejszenie stężenia białka w surowicy w pożywce zmniejszyło proliferację zanieczyszczających komórek satelitarnych, które mogą pochodzić z dysocjacji neuronów DRG, bez wpływu na funkcje ASC. Jednak komórki satelitarne, w tym niewielka populacja SC, są trudne do całkowitego wyeliminowania z hodowli neuronów DRG, a niewiele pozostałych komórek będzie również obecnych w systemie kohodowli. Dlatego ważne jest, aby zauważyć, że te małe subpopulacje mogą również uczestniczyć w procesach mielinizacji podczas badań in vitro, przywołując komórki autologiczne, które są obecne in vivo po urazie. Drugie podejście (nieprzedstawione tutaj) polega na zastosowaniu wkładek do hodowli komórkowych, unikając bezpośredniego kontaktu między dwoma różnymi typami komórek (pośrednia kokultura). Nie jest jednak reprezentatywny dla warunków in vivo podczas regeneracji nerwów (zmniejszona zdolność komórek nerwowych do rozwoju długich neurytów), ale służy do badania wpływu czynników dyfuzyjnych uwalnianych w pożywce przez pewną populację komórek na pozostałe38.

Oświadczenia

Autorzy potwierdzają, że nie ma konfliktu interesów związanego z tą publikacją.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez National Institute for Health Research, Akademię Nauk Medycznych i Brytyjskie Towarzystwo Chirurgii Ręki. Z wdzięcznością dziękujemy również za ciągłe dostawy GGF-2 od Acorda Therapeutics, USA. Na koniec autorzy chcieliby podziękować prof. Giorgio Terenghiemu za jego cenne wsparcie i wskazówki w naszej grupie w ciągu ostatnich lat, które doprowadziły do opracowania i optymalizacji tego protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 &mikro; m sitko komórkoweBD Biosciences35236070 μ m sitka (nr kat. 352350) mogą być używane jako alternatywa
15 ml probówki plastikoweSarstedt62.554.002
Probówki plastikowe 50 mlSarstedt62.547.004
Kolby 75 cm2CorningBC301
Kwas retinowy >98% HPLCSigmaR2625
Suplement ARA-CSigmaC6645
Rekombinowana ludzka zasada FGF (154 aa)Peprotech100-18B
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA9205
Kolagenaza typu IGibco17100-017Uwaga: ta kolagenaza jest używana tylko do trawienia tkanki tłuszczowej
Kolagenaza typu IVWorthingtonBiochemical LS004188Uwaga: ta kolagenaza jest używana tylko do dysocjacji eksplantatów DRG
Surowica bydlęca płodu (FBS)BiosurowicaFB-1001
Forskolina SigmaF3917
Pipetyszklane Fisher ScientificFB50253Ostry materiał do odpowiedniej utylizacji
Glial Growth Factor-2 (GGF-2)Acorda TherapeuticsGGF-2 został uprzejmie podarowany przez Acorda Therapeutics. Aby uzyskać komercyjnie dostępną alternatywę, zalecamy NRG1-β 1 (R & D Systems, Abingdon) do różnicowania komórek macierzystych do stosowania przy końcowym stężeniu 200 ng/ml
Mieszanka składników odżywczych F12 HAMSigmaN6658Ciepła przy 37 stopniach; C w łaźni wodnej, chyba że określono
inaczej, Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)SigmaH9394Ciepły w 37 & stopni; C w kąpieli wodnej, chyba że określono
inaczej Suplement N-2 (100x)Invitrogen17502
Czynnik wzrostu nerwów 2,5s Białko, Mysie gruczoły podszczękowe  (NGF) Panie Przewodniczący, Panie i PanowieMilliporeNC011
Penicylina-Streptomycyna (PS)SigmaP0781
[nagłówek]
Szalki PetriegoCorning430165
Rekombinowany ludzki PDGF-AAPeprotech100-13A
Trypsyna Invitrogen25200-056Ciepły przy 37 & deg; C w łaźni wodnej. Służy do odrywania komórek od kolb do hodowli tkankowych
Trypsyna (2x trzustka bydlęca)Worthington BiochemicalLS003703Służy do dysocjacji DRG
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)SigmaM8042Warm at 37 ° C w łaźni wodnej, chyba że określono inaczej
2-merkaptoetanolSigmaM3148Przygotować roztwór w komorze biologicznej
,

Bibliografia

  1. Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
  2. Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
  3. Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
  4. Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
  5. Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
  6. Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
  7. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
  8. Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
  9. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558(2013).
  10. Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
  11. Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
  12. Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
  13. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
  14. Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
  15. Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
  16. Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
  17. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
  18. Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
  19. Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
  21. Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
  22. Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
  23. Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
  24. Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
  25. Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
  26. Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
  27. Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
  28. Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
  29. Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
  30. Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  31. Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
  32. Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
  33. Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
  34. Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
  35. Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015(2011).
  36. Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001(2010).
  37. Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
  38. Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie komórek Schwannafrakcja naczyniowo-stromalnatrawienie kolagenaząkiełkowanie neurytówskaningowa mikroskopia elektronowaczynnik wzrostu nerwów
Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.