Busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy

Podsumowanie

Opisujemy protokół, w którym kondycjonowanie busulfanu pozwala na zastąpienie szpiku kostnego myszy biorcy komórkami szpiku kostnego od myszy dawców, które powszechnie wyrażają zielone białko fluorescencyjne, przy braku napromieniowania. Technika ta jest przydatna do badania akumulacji komórek szpiku kostnego w ośrodkowym układzie nerwowym.

Streszczenie

Przeszczep szpiku kostnego (BMT) jest często stosowany do zastąpienia przedziału szpiku kostnego (BM) myszy biorców komórkami BM wyrażającymi odrębny biomarker wyizolowany od myszy dawców. Technika ta pozwala na identyfikację komórek krwiotwórczych pochodzących od dawcy u myszy biorców i może być stosowana do izolowania i charakteryzowania komórek dawcy przy użyciu różnych technik biochemicznych. BMT zazwyczaj opiera się na kondycjonowaniu mieloablacyjnym z napromienianiem całego ciała w celu wytworzenia niszy w przedziale BM myszy biorców do wszczepienia komórek dawcy. Opisany przez nas protokół wykorzystuje kondycjonowanie mielosupresyjne za pomocą chemioterapeutyku busulfan. W przeciwieństwie do napromieniania, które wymaga użycia specjalistycznych urządzeń, kondycjonowanie busulfanu przeprowadza się za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć 20 mg/kg busulfanu, aż do podania całkowitej dawki 60-100 mg/kg. Co więcej, napromienianie mieloablacyjne może mieć toksyczne skutki uboczne i wymaga udanego wszczepienia komórek dawcy w celu przeżycia myszy biorców. W przeciwieństwie do tego, kondycjonowanie busulfanu przy użyciu tych dawek jest na ogół dobrze tolerowane i myszy przeżywają bez wsparcia komórek dawcy. Komórki BM dawcy są izolowane z kości udowych i piszczelowych myszy z wszechobecną ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) i wstrzykiwane do bocznej żyły ogonowej kondycjonowanych myszy biorców. Chimeryzm BM szacuje się poprzez ilościowe określenie liczby komórek GFP+ we krwi obwodowej po BMT. Poziomy chimeryzmu >80% są zwykle obserwowane we krwi obwodowej 3-4 tygodnie po przeszczepie i utrzymują się przez co najmniej 1 rok. Podobnie jak w przypadku napromieniania, kondycjonowanie busulfanem i BMT pozwala na akumulację komórek pochodzących od dawcy BM w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), szczególnie w mysich modelach neurodegeneracji. Ta akumulacja OUN za pośrednictwem busulfanu może być bardziej fizjologiczna niż napromienianie całego ciała, ponieważ leczenie busulfanem jest mniej toksyczne, a zapalenie OUN wydaje się być mniej rozległe. Stawiamy hipotezę, że komórki te mogą być genetycznie modyfikowane w celu dostarczania leków do OUN.

Wprowadzenie

Ostatnio pojawiło się znaczne zainteresowanie rolą mikrogleju i komórek pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), zarówno podczas choroby, jak i przy normalnym starzeniu się. Obecnie wiadomo, że mikroglej, rezydujące komórki odpornościowe OUN, rozwijają się w OUN po wejściu prymitywnych komórek progenitorowych szpiku podczas embriogenezy¹. Mikroglej zachowuje aspekty swojej linii mielomonocytarnej aż do dorosłego życia. Chociaż dowody sugerują, że udział BMDC w puli mikrogleju jest minimalny u zdrowych dorosłych zwierząt¹, rola, jaką BMDC odgrywają w progresji różnych chorób neurodegeneracyjnych, pozostaje niejasna. Niepewność tę potęguje fakt, że trudno jest odróżnić BMDC, które gromadzą się w OUN, od endogennego rezydującego mikrogleju, ponieważ nie zidentyfikowano powszechnie akceptowanego dyskryminującego markera immunohistochemicznego. W celu monitorowania BMDC in vivo stosujemy protokół przeszczepu BM (BMT), w którym endogenne komórki BM myszy biorcy są zastępowane komórkami myszy dawcy z wszechobecną ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora β-aktyny. Protokół ten pozwala na określenie zarówno lokalizacji, jak i morfologii BMDC GFP+ w myszy biorcy za pomocą immunohistochemii i ułatwia dalszą charakterystykę tych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), a następnie kolejnych testów biochemicznych.

Aby BMT zakończyło się sukcesem, komórki BM biorcy muszą zostać poddane ablacji (tzw. mieloablacja) w celu wytworzenia niszy w BM biorcy, która umożliwi wszczepienie komórek dawcy. Często mieloablację uzyskuje się za pomocą promieniowania gamma całego ciała, które indukuje pęknięcia podwójnej nici w DNA, co prowadzi do śmierci komórki, szczególnie w aktywnie dzielących się komórkach, takich jak hematopoetyczne komórki progenitorowe^2,3. Protokoły napromieniania przeprowadza się w celu wywołania wystarczającej śmierci komórek BM, tak aby śmiertelność zwierzęcia donosiła do skutku, jeżeli zwierzę biorcy nie uzyska odpowiedniego wszczepienia komórek dawcy z BMT (tzw. "napromienianie śmiertelne"). Napromienianie wymaga jednak specjalistycznego urządzenia i sprzętu, a także zasobów weterynaryjnych i hodowli zwierząt, które nie są dostępne dla badaczy we wszystkich instytucjach. Ponadto napromienianie mieloablacyjne może powodować potencjalnie śmiertelne uszkodzenia innych tkanek, a ze względu na immunosupresję napromieniane zwierzęta są bardziej podatne na wtórne infekcje³. W związku z tym opracowano schematy kondycjonowania o zmniejszonej intensywności (tak zwane protokoły "RIC"), które mają na celu zminimalizowanie potencjalnie toksycznych skutków ubocznych protokołu kondycjonowania u pacjentów, szczególnie do stosowania w populacjach ryzyka, takich jak dzieci i osoby starsze⁴.

Niektóre protokoły RIC opierają się na chemioterapeutykach, takich jak busulfan, w celu kondycjonowania przedziału BM. Busulfan jest dwufunkcyjnym środkiem alkilującym DNA, często stosowanym klinicznie jako alternatywa dla napromieniania^5,6. Warto zauważyć, że busulfan może być bezpiecznie podawany myszom przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) i nie wymaga specjalistycznych urządzeń i sprzętu niezbędnego do napromieniania myszy. Kondycjonowanie busulfanem było szeroko stosowane w naszym laboratorium⁷, a także w kilku innych ostatnich publikacjach ^8-11. Przy zastosowaniu dawek 60-100 mg/kg mc. można ustalić wysoki stopień stabilnego chimeryzmu (>80% komórek GFP+) we krwi obwodowej i BM⁷. Co ważne, przy tych dawkach mieloablacja nie jest kompletna i jako takie myszy są w stanie przetrwać bez otrzymywania wspierających komórek BM (K. Peake, J. Manning, C. Lewis i C. Krieger, niepublikowane obserwacje). Co więcej, przy kondycjonowaniu busulfanu mielosupresyjnym dochodzi do szybkiej rekonstytucji komórek mielomonocytarnych krwi obwodowej przez komórki dawcy. Jednak zastępowanie limfocytów krwi obwodowej przez komórki dawcy jest wolniejsze, co podkreśla brak immunosupresji, która występuje w przypadku dawek 60-100 mg/kg busulfanu w porównaniu z napromienianiem całego ciała⁷.

Udało nam się wykorzystać chimeryzm wywołany busulfanem do zbadania BMDC u myszy dzikich typów, a także w mysich modelach zaburzeń neurodegeneracyjnych stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)⁷ i choroby Alzheimera. Zaobserwowano, że w pewnych warunkach znaczna liczba BMDC GFP+ gromadzi się w OUN^7,12. Co ważne, podobnie jak kondycjonowanie mieloablacyjne z napromienianiem, kondycjonowanie busulfanem, a następnie BMT jest wystarczające, aby umożliwić akumulację GFP+ BMDC w OUN zarówno u myszy typu dzikiego, jak i myszy z zaburzeniami neurologicznymi ^7-11. Ponieważ główną przeszkodą w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych jest zdolność do przenoszenia cząsteczek terapeutycznych z krążenia do OUN, gdzie mogą wywierać korzystne skutki, stwarza to możliwość, że BMDC mogą być modyfikowane do ekspresji cząsteczek terapeutycznych, a następnie wykorzystywane jako nośnik do dostarczania leków do OUN biorców kondycjonowanych busulfanem. Jest to mechanizm, nad którym aktywnie pracujemy. Chociaż stwierdziliśmy, że kondycjonowanie mieloablacyjne z napromienianiem prowadzi do większej akumulacji BMDC GFP+ w OUN w porównaniu z kondycjonowaniem busulfanem⁷, napromienianie może mieć znaczną toksyczność u pacjentów z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i w mysich modelach choroby OUN.

Podczas gdy my, jak i wielu innych, używaliśmy modeli BMT do badania BMDC w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, możliwość zastąpienia komory BM myszy biorcy wyraźnie rozpoznawalną populacją komórek BM jest nieocenionym narzędziem do badania różnych aspektów układu krwiotwórczego. Obejmuje to szeroki zakres tematów badawczych, takich jak rozwój linii krwiotwórczej, białaczka, przeszczepianie narządów, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i immunobiologia.

Protokół

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Ten protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Simona Frasera (UACC; numery zezwoleń 1037K-12 i 1060K-03) i jest zgodny z Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami, Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Dyrektywą Rady EWG.

1. Uwagi specjalne

UWAGA: Busulfan jest cytotoksyczny. Obchodzić się z materiałem niebezpiecznym i utylizować zgodnie z kartą charakterystyki i wytycznymi instytucji.

1. Wszystkie techniki należy wykonywać aseptycznie w okapie z przepływem laminarnym.
2. Sterylizuj narzędzia przed użyciem, owijając je w odpowiedni materiał opakowaniowy, taki jak opakowanie typu peel i sterylizując w autoklawie.
3. Chociaż ryzyko zakażenia jest mniejsze w przypadku kondycjonowania busulfanu w porównaniu z napromienianiem, ze zwierzętami należy obchodzić się tylko w kapturze z przepływem laminarnym przez pierwsze 2 tygodnie po przeszczepie.

2. Kondycjonowanie myszy biorców

1. Rozcieńczyć busulfan do 3 mg/ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).
   UWAGA: Ważne jest, aby ponownie rozcieńczyć busulfan tuż przed użyciem każdego dnia po wstrzyknięciu.
2. Podawać 20 mg/kg rozcieńczonego busulfanu myszom biorcom we wstrzyknięciu IP dziennie.
3. Powtarzać codzienne wstrzyknięcia IP busulfanu w dawce 20 mg/kg mc., aż do uzyskania całkowitej dawki 60-100 mg/kg mc. (tj. w przypadku całkowitej dawki 80 mg/kg mc. należy podawać 20 mg/kg mc. busulfanu przez 4 kolejne dni).

3. Izolacja komórek szpiku kostnego dawcy

UWAGA: Ten protokół został z powodzeniem wykorzystany do izolacji i przygotowania komórek BM od maksymalnie 5 myszy dawców. Zazwyczaj wydajność komórek na mysz wynosi około 30-40 milionów BMDC, co wystarcza do przeszczepienia 12-16 myszy biorców. Jeśli potrzebnych jest więcej myszy dawców, może być konieczne odpowiednie dostosowanie protokołu.

1. Po ostatnim dniu kondycjonowania busulfanu należy poddać eutanazji mysz dawcę GFP (w wieku od jednego do sześciu miesięcy) przy użyciu CO₂ (lub za pomocą innej procedury eutanazji akceptowanej w placówce). Aby uniknąć powikłań po przeszczepie, należy używać dawców syngenicznych, którzy są tej samej płci co biorcy.
2. Spryskaj mysz 70% etanolem. Podnieś skórę na brzuchu i za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie przez skórę od jamy brzusznej w górę nogi w kierunku kostki. Trzymając stopę, mocno pociągnij skórę od kostki w kierunku biodra, odsłaniając tkankę nogi
.
3. Odetnij tkankę mięśniową i tłuszczową z kości udowej, aby odsłonić staw biodrowy.
4. Delikatnie ciągnąc za stopę, aby wyprostować nogę, dociśnij nożyczki do stawu biodrowego. Wytnij tuż nad głową kości udowej, uważając, aby nie przeciąć samej kości udowej.
5. Aby pomóc w utrzymaniu bezpłodności, trzymaj nogę za stopę i oczyść pozostałą tkankę z kości, pocierając powierzchnię kości autoklawowanymi tkankami.
6. Oddziel kość udową i piszczelową, przecinając staw kolanowy i umieść kość udową w naczyniu hodowlanym zawierającym sterylny PBS. Inkubować na lodzie.
7. Usuń i wyrzuć kość strzałkową, przecinając w miejscach, w których kość strzałkowa łączy się z piszczelem. Umieść piszczel w naczyniu hodowlanym z kością udową i inkubuj na lodzie.
8. Powtórz kroki 3.2-3.7 dla drugiej nogi i, jeśli to konieczne, dodatkowych myszy dawców. Po usunięciu kości wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami lub użyj nowego zestawu sterylnych narzędzi do kolejnych kroków.
9. W przypadku kości udowych przytrzymaj kość udową kleszczami i za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie "ogol" dystalne końce kości. Usuń tyle kości, ile jest konieczne, aby odsłonić jamę BM.
10. Napełnić strzykawkę 3 ml jałowego PBS i założyć igłę 23 G. Ostrożnie wwiercić igłę w jamę BM i przepłukać BM do sterylnego naczynia hodowlanego. Pamiętaj, aby zeskrobać jamę szpikową czubkiem igły, aby zapewnić usunięcie wszystkich pożądanych komórek. Po ekstrakcji upewnij się, że czerwony BM nie jest już widoczny, a kość wydaje się teraz biała.
11. Powtórz kroki 3.9-3.10 dla kolejnych kości udowych, gromadząc wszystkie BM w tym samym naczyniu hodowlanym.
12. W przypadku kości piszczelowych chwyć kość piszczelową kleszczami i ostrożnie "ogol" koniec, w którym piszczel była przymocowana do kolana, aby odsłonić jamę BM. Wykonaj drugie cięcie wzdłuż kości w miejscu, gdzie kończy się widoczny czerwony BM.
13. Napełnić strzykawkę 3 ml jałowego PBS i założyć igłę 25 G. Delikatnie wbić igłę do jamy BM (od końca, który był przymocowany do kolana) i przepłukać BM do naczynia hodowlanego zawierającego BM z kości udowych. Zeskrob ściany jamy BM igłą, aby usunąć wszystkie komórki. Po ekstrakcji upewnij się, że czerwony BM nie jest już widoczny, a kość wydaje się teraz biała.
14. Powtórz kroki 3.12-3.13 dla kolejnych piszczeli, łącząc wszystkie BM w tym samym naczyniu hodowlanym.
15. Delikatnie rozetrzeć BM za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby oddzielić komórki.
16. Przepuścić zawiesinę komórek przez filtr koszowy 40 μM do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wypłucz naczynie PBS, aby uzyskać pozostałe komórki i przenieś je przez filtr do probówki wirówkowej.
17. Wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant.
18. Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 8,5 min.
19. Dodać ~30 ml sterylnego PBS, aby ugasić bufor lizujący.
20. Wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant.
21. Zawiesić osad w 1 ml jałowego PBS. Trzymaj na lodzie.
22. Weź małą porcję homogenatu komórkowego i rozcieńcz PBS (1:100 dla 1 myszy; 1:200 dla 2 myszy itd.), aby określić ilościowo liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
23. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 8 x 10⁶ komórek/ml i inkubować na lodzie aż do wstrzyknięcia.

4. Przeszczep szpiku kostnego

1. Napełnić strzykawkę o pojemności 0,5 ml (igłą insulinową 28 g) 300 μl rozcieńczonej zawiesiny komórkowej dla każdej myszy przeznaczonej do wstrzyknięcia. Należy upewnić się, że usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się w strzykawce.
2. Umieść klatkę myszy zawierającą kondycjonowane myszy biorcę na poduszce grzewczej i pozwól żyłom ogonowym się rozszerzyć.
3. Weź mysz odbiorcy i umieść ją w urządzeniu krępującym. Przetrzyj ogon gazą chirurgiczną nasączoną 70% etanolem.
4. Mocno przytrzymaj ogon i skosem do góry delikatnie włóż igłę do jednej z bocznych żył ogonowych i wstrzyknij zawiesinę komórkową.
5. Trzymać gazę chirurgiczną w miejscu wstrzyknięcia do momentu ustania krwawienia przed umieszczeniem myszy w nowej, czystej klatce.

5. Szacowanie zakresu chimeryzmu BM

UWAGA: Poziomy chimeryzmu są zazwyczaj zmienne we krwi obwodowej po 1 tygodniu od BMT, a zatem poziomy chimeryzmu są zwykle szacowane co najmniej 2 tygodnie po BMT. Poziom chimeryzmu powinien osiągnąć >80% komórek GFP+ we krwi obwodowej w ciągu 3-4 tygodni po BMT.

1. Przygotować bufor FACS (2 mM EDTA + 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS).
   UWAGA: Bufor FACS może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
2. Umieść mysz w rurce krępującej i ogol futro na tylnej nodze, aby odsłonić boczną żyłę odpiszczelową.
3. Cienko pokryj nogę wazeliną i przebij żyłę odpiszczelową igłą 25 G.
4. Zebrać około 50 μl krwi za pomocą rurki kapilarnej pokrytej heparyną. Dodać krew do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml buforu FACS. Wymieszaj probówkę przez odwrócenie i przechowuj na lodzie.
5. Przytrzymaj gazę chirurgiczną w miejscu wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie, zanim wrócisz do klatki.
6. Odwirować próbki krwi przez 5 minut przy 900 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant.
7. Ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do lizy erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 8,5 min.
8. Dodać 1 ml buforu FACS, aby ugasić bufor lizujący.
9. Odwirowywać próbki przez 5 minut przy sile 900 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant.
10. Wykonać drugi etap lizy w 500 μl buforu do lizy erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 8,5 min.
11. Dodać 1 ml buforu FACS, aby ugasić bufor lizujący.
12. Odwirowywać próbki przez 5 minut przy sile 900 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant. Sprawdź, czy granulka jest teraz biała.
    UWAGA: Jeśli granulka nadal wydaje się czerwona, przed przejściem do następnego kroku może być potrzebny dodatkowy etap lizy.
13. Zawiesić osad w 1 ml buforu FACS. Odwirowywać próbki przez 5 minut przy 900 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
14. Ponownie zawiesić osad w 300 μl buforu FACS i określić ilościowo komórki GFP+ za pomocą cytometrii przepływowej (UWAGA: W tym momencie można przeprowadzić dowolne pożądane barwienie immunologiczne komórek, przy użyciu standardowych technik, przed analizą cytometryczną przepływową).

Wyniki

Podawanie busulfanu w dawkach 60-100 mg/kg jest zazwyczaj dobrze tolerowane przez myszy. Jednak zwierzęta zazwyczaj tracą na wadze podczas fazy kondycjonowania (~5-10%), dlatego dieta może wymagać suplementacji przysmakami, takimi jak naświetlone nasiona słonecznika, aby zachęcić je do jedzenia. Poziomy chimeryzmu >80% komórek GFP+ we krwi obwodowej i w szpiku kostnym (BM) powinny być konsekwentnie osiągalne przy zastosowaniu 60-100 mg/kg busulfanu⁷. Nasze laboratorium z powodzeniem zastosowało ten protokół...

Dyskusja

Kondycjonowanie busulfanem pozwala na generowanie chimeryzmu BM wysokiego poziomu u myszy z łatwo wykrywalnymi komórkami krwiotwórczymi. Kondycjonowanie to można przeprowadzić bez konieczności stosowania urządzeń do napromieniania. Co więcej, supresja szpiku kostnego za pomocą dawek busulfanu opisanych w tym protokole jest dobrze tolerowana, minimalizując toksyczne skutki uboczne spowodowane mieloablacyjnymi dawkami promieniowania, a zatem może być bardziej odpowiednią techniką generowania chimeryzmu BM u młodych, staryc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Busulfex	Otsuka Kanada Pharmaceutical Inc.	DIN 02240602	Rozcieńczyć busulfan do 3 mg/ml sterylnym PBS tuż przed użyciem. Busulfanan jest cytotoksyczny. Utylizuj i utylizuj zgodnie z kartą charakterystyki i wytycznymi instytucji.
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01	Można zastąpić inny bufor do lizy, ale może być konieczne odpowiednie dostosowanie czasu inkubacji
Technologie życia	płodu bydlęcego	12483-020