Artykuł metodologiczny

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52556

⸱

12 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Streszczenie

Toxoplasma gondii, czynnik wywołujący toksoplazmozę, jest obligatoryjnym wewnątrzkomórkowym patogenem pierwotniaka. Pasożyt atakuje i replikuje się w praktycznie każdym typie komórek kręgowców stałocieplnych. Podczas inwazji pasożyta na komórkę gospodarza, pasożyt tworzy parazytoforyczną wakuolę (PV), która pochodzi z błony komórkowej gospodarza niezależnie od fagocytozy, w której pasożyt się replikuje. Podczas gdy odporność wrodzona zależna od IFN i komórkowa jest ważna dla ostatecznej kontroli infekcji, wrodzone komórki odpornościowe, w tym neutrofile, monocyty i komórki dendrytyczne, mogą również służyć jako nośniki ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się pasożyta na wczesnym etapie infekcji. Opisano podejście, które wykorzystuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza, w tym przypadku makrofagi, w przesiewowym badaniu genetycznym w celu identyfikacji mutantów pasożytów z defektem dopasowania w zakażonych makrofagach po aktywacji, ale normalną inwazją i replikacją w naiwnych makrofagach. W ten sposób badanie przesiewowe izoluje mutanty pasożytów, które mają specyficzny defekt w ich zdolności do opierania się skutkom aktywacji makrofagów. W artykule opisano dwa szerokie fenotypy zmutowanych pasożytów po aktywacji zakażonych makrofagów: zastój pasożytów kontra degradacja pasożytów, często w amorficznych wakuolach. Mutanty pasożytów są następnie analizowane w celu zidentyfikowania odpowiedzialnych genów pasożytów, szczególnie ważnych dla odporności na indukowane mediatory autonomicznej odporności komórek. W artykule przedstawiono ogólne podejście do badań przesiewowych genetyki do przodu, które teoretycznie można zmodyfikować tak, aby celowały w geny pasożytów ważne dla oporności na określone mediatory przeciwdrobnoustrojowe. Opisano w nim również podejście do oceny specyficznych mediatorów przeciwdrobnoustrojowych makrofagów, na które podatny jest mutant pasożyta. Aktywacja zakażonych makrofagów może również sprzyjać różnicowaniu pasożytów od stadium tachyzoitu do bradyzoitu, które utrzymuje przewlekłą infekcję. W związku z tym przedstawiono metodologię oceny znaczenia zidentyfikowanego genu pasożyta dla powstania przewlekłego zakażenia.

Wprowadzenie

Toxoplasma gondii (T. gondii) jest obowiązkowym wewnątrzkomórkowym, pierwotniakowym patogenem. Jest to czynnik wywołujący toksoplazmozę, zagrożenie dla zdrowia u osób z obniżoną odpornością. Jest to również system modelowy dla innych patogenów apikompleksów, które infekują ludzi, w tym Cryptosporidium i Cyclospora. Toksoplazmoza jest najczęściej nabywana poprzez spożycie żywności lub wody zanieczyszczonej w stadium bradyzoitu lub oocysty pasożyta. Po spożyciu etapy te przekształcają się w stadium tachyzoitowe pasożyta, który replikuje się w komórkach gospodarza i rozprzestrzenia się ogólnoustrojowo. Limfocyty T, IFN-γ i, w mniejszym stopniu, tlenek azotu 1-4, są ważne dla kontroli infekcji, ale nie są w stanie wyeliminować choroby, ponieważ część tachyzoitów przekształca się w stadium bradyzoitu, które są chronione w torbielach tkankowych, co prowadzi do długotrwałej przewlekłej infekcji. W rzeczywistości nie ma skutecznych środków terapeutycznych przeciwko przewlekłemu stadium torbieli choroby. Ciężka toksoplazmoza jest najczęściej spowodowana reaktywacją uporczywego zakażenia, przy czym stadium bradyzoitu pasożyta przekształca się z powrotem w stadium szybko replikujące się tachyzoitu, charakterystyczne dla zakażenia pierwotnego i ostrego.

Wczesne przeżycie w obliczu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej jest ważne, aby umożliwić pasożytowi osiągnięcie wystarczającej liczby pasożytów, jak również dotarcie do miejsc dystalnych, aby umożliwić rozpoczęcie przewlekłej infekcji. T. gondii rozwinął strategie przeciwdziałania mechanizmom obronnym gospodarza, które prawdopodobnie przyczyniają się do jego zdolności do replikacji i rozprzestrzeniania się we wczesnej fazie infekcji. Po pierwsze, T. gondii tworzy unikalny PV podczas inwazji pasożyta, który jest w dużej mierze oddzielony od procesów endocytarnych i egzocytarnych komórki gospodarza w porównaniu z innymi patogenami wewnątrzkomórkowymi 5-9. Ponadto, podobnie jak wszystkie skuteczne patogeny wewnątrzkomórkowe, T. gondii modyfikuje swoją komórkę gospodarza, aby stworzyć środowisko sprzyjające wzrostowi. Obejmuje to przeprogramowanie ekspresji genów w komórce gospodarza poprzez zmianę czynników transkrypcyjnych komórek gospodarza, w tym tych ważnych dla regulacji aktywacji komórek 10-15. Wykazano, że ROP16 16-19, GRA15 20, GRA16 21 i GRA24 22 są ważne w regulacji odpowiedzi transkrypcyjnej i kaskad sygnalizacji komórkowej komórek gospodarza zakażonych T. gondii. Ostatnie badania wykorzystujące krzyżówki genetyczne między szczepami pasożytów o różnych fenotypach były bardzo produktywne w identyfikacji genów pasożytów, które leżą u podstaw cech zależnych od genotypu pasożyta, w tym unikania GTPaz związanych z odpornością (IRG) 16,19,23-26. U myszy GTPazy związane z odpornością (IRG) mają kluczowe znaczenie dla kontroli genotypów typu II i III pasożyta, podczas gdy bardzo zjadliwe genotypy typu I wyewoluowały mechanizmy unikania mysich IRG. Jednak jasne jest również, że pasożyt wyewoluował mechanizmy unikania mediatorów przeciwdrobnoustrojowych oprócz IRG i że niektóre z tych mechanizmów mogą być zachowane w genotypach pasożyta 27,28. Ponadto bardzo niewiele wiadomo na temat krytycznych mediatorów autonomicznej odporności komórek przeciwko T. gondii podczas toksoplazmozy u ludzi. Geny pasożytów ważne dla odporności na mediatory autonomicznej odporności komórek mogą być również ważne dla przetrwania podczas konwersji tachyzoitu do bradyzoitu, która może być również wywołana przez odpowiedź immunologiczną gospodarza. Na przykład tlenek azotu w wysokich stężeniach może hamować replikację pasożytów w zakażonych makrofagach, ale może również stymulować konwersję tachyzoitu do bradyzoitu, powodując produkcję torbieli30-32.

ToxoDB to funkcjonalna genomiczna baza danych dla T. gondii, która funkcjonuje jako krytyczne źródło dla tej dziedziny pod względem dostarczania informacji o sekwencji genomu pasożyta oraz dostępu do opublikowanych i niepublikowanych danych w skali genomowej, w tym adnotacji społeczności, ekspresji genów i danych proteomicznych 33. Podobnie jak w przypadku wielu patogenów pierwotniakowych, większość genomu składa się z hipotetycznych genów, bez dostępnych informacji opartych na homologii genów, które zapewniłyby wgląd w ich potencjalne funkcje. W związku z tym genetyka postępowa jest potężnym narzędziem do identyfikacji nowych genów pasożytów ważnych dla unikania odporności, konwersji torbieli i innych funkcji krytycznych dla patogenezy pasożyta, a także dla konwersji między różnymi etapami rozwoju. Dodatkową zaletą genetyki postępowej jest to, że może być ona stosowana jako stosunkowo bezstronne podejście do badania pasożyta pod kątem genów, które są ważne dla określonych zadań w patogenezie, w tym unikania odporności i tworzenia torbieli. Ostatnie ulepszenia w sekwencjonowaniu nowej generacji do profilowania mutacji sprawiły, że jest to metoda z wyboru do identyfikacji odpowiedzialnych genów pasożytów z przyszłych badań genetycznych przy użyciu zarówno mutagenezy chemicznej, jak i insercyjnej 34-37.

Ważne jest, aby zidentyfikować słabe punkty u T. gondii, które mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności autonomicznych mechanizmów immunologicznych komórek przeciwko pasożytowi, szczególnie tych, które mogą być również aktywne przeciwko opornemu stadium torbieli. W tym celu opracowano model zakażenia i aktywacji mysich makrofagów in vitro w celu identyfikacji mutacji pasożyta, które specyficznie upośledzają przystosowanie T. gondii po aktywacji zakażonych makrofagów, ale nie u wcześniej nieleczonych makrofagów. To badanie przesiewowe makrofagów wykorzystano do zbadania biblioteki mutantów insercyjnych T. gondii w celu ostatecznej identyfikacji genów T. gondii ważnych dla odporności na tlenek azotu 27,28. Izolacja panelu mutantów T. gondii z upośledzoną odpornością na aktywację zakażonych makrofagów, w szczególności wyraźną wrażliwością na tlenek azotu, dowiodła użyteczności badania przesiewowego do identyfikacji genów pasożytów ważnych dla odporności na mediatory autonomicznej odporności komórek innych niż mechanizmy oporności opisane dla mysich IRG 28. Mutageneza insercyjna ma przewagę nad mutagenezą chemiczną pod względem generowania ograniczonej liczby losowych mutacji w każdym klonie pasożyta i, teoretycznie, łatwiejszej identyfikacji miejsca mutacji. Jednak identyfikacja genomowego miejsca insercji plazmidu w mutantach insercyjnych T. gondii w praktyce była zaskakująco trudna w wielu przypadkach 37. Wprowadzenie plazmidu do genu może również zakłócić funkcję genu, w przeciwieństwie do mutagenezy chemicznej, która zwykle powoduje zmiany pojedynczego nukleotydu. Jednak mutageneza chemiczna z N-etylo-N-nitrozomocznikiem (ENU) lub sulfonianem etylometanu (EMS) może oferować zwiększoną zdolność do analizy większej części genomu pasożyta w porównaniu z mutagenezą insercji, ponieważ tworzy wiele polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (szacowanych na 10 -100) na mutanta34,38. Co więcej, ostatnie postępy w profilowaniu całego genomu umożliwiły wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji najbardziej prawdopodobnych genów kandydujących odpowiedzialnych za zidentyfikowany fenotyp zmutowanego pasożyta 34,38. Niezależnie od podejścia opartego na mutagenezie, potwierdzenie roli genu pasożyta w odporności na aktywację makrofagów ostatecznie wymaga delecji i uzupełnienia genu, aby spełnić molekularne postulaty Kocha.

Zdolność do analizy funkcji genu poprzez manipulację genetyczną zarówno pasożyta, jak i makrofaga jest ważna, ponieważ wiele genów zidentyfikowanych za pomocą genetyki postępowej u T. gondii, jak również innych patogenów, jest nadal charakteryzowanych jako hipotetyczne geny z niewielką lub żadną homologią sekwencji do innych białek o znanych funkcjach. W niniejszym artykule przedstawiono ogólne podejście, które można wykorzystać do określenia, czy zakłócony gen u mutanta jest ważny dla odporności na znany lub nieznany mediator autonomicznej odporności komórki. Wstępna analiza czynników przeciwdrobnoustrojowych gospodarza jest przeprowadzana poprzez ocenę przeżywalności pasożytów typu dzikiego i zmutowanych w makrofagach myszy typu dzikiego w porównaniu z tymi ze specyficznymi delecjami genów w indukowalnej syntazie tlenku azotu (iNOS), gp-91 phox (oksydaza NADPH) i GTPazach związanych z odpornością specyficzną (IRG). Pozwoli to określić, czy zidentyfikowane geny pasożyta są ważne dla odporności odpowiednio na tlenek azotu, reaktywne produkty pośrednie tlenu lub GTPazy związane z odpornością 28, czy też zaangażowany jest nieznany mechanizm immunologiczny. Aktywacja zakażonych makrofagów zarówno IFN-γ, jak i LPS, opisana w obecnym protokole, skutkuje przede wszystkim izolacją genów pasożyta ważnych dla odporności na tlenek azotu 28. Zastosowanie środków farmakologicznych, które indukują tlenek azotu przy braku aktywacji makrofagów (donorów tlenku azotu) potwierdziło, że większość zidentyfikowanych genów była ważna dla oporności na tlenek azotu, a nie tlenek azotu w połączeniu z dodatkowymi mediatorami związanymi z aktywacją makrofagów 28.

Krok pierwszy i drugi opisują przesiewowe badanie genetyczne przeznaczone do izolowania mutantów pasożytów z defektem sprawności po aktywacji zakażonych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego in vitro. Krok pierwszy opisuje analizę miareczkowania dawki w celu empirycznego określenia dawki IFN-γ i LPS do wykorzystania do aktywacji makrofagów, która zmniejsza replikację pasożyta, ale nie hamuje w pełni replikacji szczepu rodzicielskiego T. gondii typu dzikiego, który jest używany do tworzenia biblioteki mutantów pasożytów. Krok drugi opisuje przesiewowe badanie genetyczne zmutowanych klonów w makrofagach na 96-dołkowych płytkach. Krok trzeci przedstawia podejście mające na celu potwierdzenie fenotypu każdego mutanta zidentyfikowanego na ekranie 96 płytek dołkowych i ocenę, czy defekt każdego mutanta wpływa na przeżycie, replikację lub produkcję torbieli pasożyta w odpowiedzi na aktywację makrofagów. Krok czwarty opisuje zastosowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy z delecjami w określonych szlakach przeciwdrobnoustrojowych w celu zidentyfikowania mediatorów immunologicznych, na które mutant pasożyta jest specyficznie podatny. Krok piąty przedstawia podejście mające na celu ustalenie, czy mutant pasożyta jest również zagrożony patogenezą in vivo, ocenianą przez produkcję torbieli w mózgach zakażonych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie protokoły związane z wykorzystaniem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt New York Medical College.
UWAGA: Odwołuje się do szczegółowych protokołów mutagenezy chemicznej 38, izolacji pasożytów poprzez ograniczenie rozcieńczenia 38, izolacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy 39, wzrostu T. gondii w ludzkich komórkach fibroblastów napletka (HFF) i produkcji torbieli w makrofagach oraz podstawowej analizy immunofluorescencyjnej (IFA) 32. Przeprowadzić całą hodowlę komórkową w temperaturze 37 °C w 5% pożywce CO2 w D10 (zmodyfikowana pożywka Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy Eagle uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Utrzymuj wszystkie odczynniki w sterylności podczas izolacji komórek i hodowli komórek.

1. Miareczkowanie dawki IFN-γ i LPS w celu określenia stężeń, które należy użyć do aktywacji zakażonych makrofagów do badania genetycznego

  1. Hodowla mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego O/N w ośmiokomorowych szkiełkach szkiełkowych o stężeniu 3 × 105 komórek/ml w 250 μl pożywki D10 na komorę. Makrofagi należy stosować od jednego do dwóch tygodni po izolacji ze szpiku kostnego.
    UWAGA: Kupowane są zjeżdżalnie komorowe, które posiadają myjkę RS wspomagającą wzrost.
  2. Użyj hemocytometru, aby policzyć pasożyty typu dzikiego zebrane z ludzkich komórek fibroblastów napletka (HFF) wyhodowanych w kolbie do hodowli tkankowej T25. Zawiesić pasożyty w stężeniu 5 x 105 pasożytów typu dzikiego na ml w pożywce D10. To stężenie spowoduje wielokrotność infekcji około 1:1, ponieważ makrofagi będą się namnażać O / N. Używaj rurek polistyrenowych lub PET do wszelkich manipulacji pasożytami, ponieważ pasożyt przykleja się do polipropylenu.
  3. Usunąć pożywkę D10 ze szkiełek komorowych i zastąpić 250 μl zawiesiny pasożytów typu dzikiego. Delikatnie dodaj zawiesinę pasożyta do każdej komory szkiełka, pozwalając jej spływać po wewnętrznej powierzchni każdej komory. Nie pozwól, aby makrofagi wyschły w żadnym momencie podczas protokołu.
  4. Przykryj szkiełka komory zakażone pasożytami pokrywą szkiełka komory i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 ° C w 5% CO2 na 4 godziny, aby dać czas na inwazję pasożyta i utworzenie PV.
  5. Rozcieńczyć LPS i IFN-γ w 1 ml pożywki D10 w sterylnych probówkach do miareczkowania dawki. W przypadku miareczkowania dawki należy utrzymywać stałe stężenie LPS lub IFN i zmieniać drugi bodziec 40.
    1. Na przykład utrzymuj LPS na stałym poziomie 10 ng LPS na ml i zmieniaj stężenie IFN-γ (0, 1 jednostka/ml, 10 jednostek/ml, 100 jednostek/ml, 1,000 jednostek/ml). Utrzymuj IFN-γ na stałym poziomie 100 jednostek/ml i zmieniaj stężenie LPS (0, 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml). Krótko sonikować bulion LPS przez 2 minuty bez podgrzewania w kąpieli sonikatora (nie z sonatorem końcówki) przed rozcieńczeniem.
      UWAGA: Sonikacja jest zalecana w celu zakłócenia agregatów miceli utworzonych przez LPS, które mogą nie wiązać się prawidłowo z komórkami gospodarza.
  6. 4 godziny po rozpoczęciu kohodowli między pasożytami i przylegającymi makrofagami w szkiełku komorowym, należy wyrzucić pożywkę D10 z każdej komory i zastąpić ją 300 μl odpowiednich rozcieńczeń IFN-γ i LPS w pożywce D10. Dołącz kontrolę tylko z pożywką D10, aby ocenić replikację pasożyta przy braku aktywacji makrofagów.
  7. Ponownie przykryj szkiełka komory pokrywą szkiełek komory i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 ° C w 5% CO2 przez dodatkowe 24 do 30 godzin
    UWAGA: Czas inkubacji zależy od czasu podwojenia szczepu pasożyta typu dzikiego, który może wynosić od 6 do 12 godzin w zależności od szczepu pasożyta. Punkt czasowy jest wybierany przed lizą pasożytów naiwnych makrofagów, ale wystarczająco długi, aby umożliwić co najmniej 3-4 razy podwojenia.
  8. Przygotować 2,5% roztwór formaldehydu w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) firmy Dulbecco. Wyrzuć pożywkę ze szkiełka komory i zastąp ją 300 μl 2,5% roztworu formaldehydu. Poprawka na 20 minut w RT.
  9. Przepłukać szkiełko (szkiełka) dwukrotnie 300 μl PBS na komorę. Przy każdym płukaniu należy wyrzucić PBS ze szkiełka i delikatnie dodać nowy PBS po wewnętrznej powierzchni każdej komory szkiełka, aby uniknąć zakłócenia makrofagów przylegających do szkiełka. Dodać 300 μl PBS na komorę i przykryć na szkiełku komorowym, aby zapobiec wysychaniu szkiełek przed barwieniem.
    UWAGA: Szkiełka można w tym momencie umieścić w temperaturze 4 C do 3 dni przed barwieniem.
  10. Protokół barwienia do wykrywania T. gondii za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (IFA).
    1. Przygotować 0,2% roztwór Triton X-100 w PBS (bufor przepuszczalny). Umieść roztwór w probówce w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i krótko go wymieszaj, aby upewnić się, że Triton X-100 znajdzie się w roztworze. Wyrzucić PBS ze szkiełek komorowych i zastąpić 300 μl buforu przepuszczalnego. Wyjazd w RT na 30 min.
    2. Przygotować roztwór 10% surowicy koziej w PBS (roztwór blokujący). Odrzucić bufor przepuszczalny ze szkiełka i zastąpić go 300 μl roztworu blokującego na komorę. Wyjazd w RT na 30 min.
      UWAGA: Surowicę cielęcą płodu można zastąpić surowicą kozią we wszystkich protokołach barwienia.
    3. Aby uzyskać jednoetapowy protokół barwienia IFA, należy rozcieńczyć 1:1,000 fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała przeciwko T. gondii w roztworze blokującym. Usunąć roztwór blokujący ze szkiełka i dodać 150 μl roztworu przeciwciał na komorę. Wymień szkiełko pokrywy na szkiełku komory, aby zapobiec wysychaniu komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT .
      UWAGA: Stężenie przeciwciał należy określić empirycznie w zależności od źródła. Przeciwciało jest kupowane bezpośrednio sprzężone z fluorochromem lub sprzężone z fluorochromem przez użytkownika.
      1. W przypadku dwuetapowego protokołu barwienia IFA z niesprzężonym przeciwciałem przeciwko T. gondii i fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym, barwienie szkiełkuje się 150 μl niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko T. gondii w buforze blokującym przez 1 godzinę w RT . Przepłukać 3x 300 μl PBS plus 1% koziej surowicy (bufor do płukania).
      2. Dodać 150 μl fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego specyficznego dla gatunku pochodzenia przeciwciała pierwszorzędowego. Wymień szkiełko pokrywy na szkiełku komory, aby zapobiec wysychaniu komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej .
    4. Przepłukać szkiełka 3x PBS plus 1% koziej surowicy (bufor myjący). Przy każdym płukaniu należy usunąć roztwór ze szkiełek komory, wysypując jego zawartość i zastąpić 300 μl buforu do mycia.
    5. Przepłukać szkiełka 2x 300 μl PBS.
    6. Wyjmij komorę ze szkiełka studzienki zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Zamocuj szkiełka z materiałami montażowymi zawierającymi DAPI (4'6-diamidyn-2-fenyloindol, dilmleczan) i szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 50 mm.
  11. Zbadaj preparaty za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii fluorescencyjnej. Określ średnią liczbę pasożytów na wakuolę, badając co najmniej 100 PV na studzienkę komory. Wybrana dawka IFN-γ i LPS do badania przesiewowego musi być wystarczająca do zahamowania, ale nie zapobieżenia replikacji pasożytów typu dzikiego (patrz rysunek 1).

2. Izolacja mutantów pasożytów z defektem sprawności po aktywacji zakażonych makrofagów

UWAGA: Biblioteka losowych mutantów T. gondii jest wymagana do ekranu genetyki do przodu. Losową mutagenezę T. gondii można przeprowadzić za pomocą mutagenezy chemicznej (ENU/EMS) lub insercyjnej 27,28,38. Po mutagenezie klonuje pasożyty, ograniczając rozcieńczenie i hoduje pojedyncze klony na 96-dołkowych płytkach zawierających przylegające komórki HFF w objętości 200 μl pożywki D10 32,38. Bardzo ważne jest, aby 96-dołkowe płytki do badań przesiewowych pasożytów w makrofagach za pomocą mikroskopii miały dna optyczne, aby umożliwić badania przesiewowe pod mikroskopem. Mikroskopia kontrastu fazowego i mikroskopia fluorescencyjna do badań przesiewowych barwionych płytek 96-dołkowych wymaga odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z kontrastem fazowym 4, 10, 20 lub 40-krotnego obiektywu przystosowanego do pracy na duże odległości. Obiektyw 4X jest przydatny do widzenia całej studni, ale lepszą rozdzielczość pasożytów uzyskuje się dzięki obiektywowi 20X.

  1. Przenieś 50 μl mutantów tachyzoitowych hodowanych w zlewających się komórkach HFF na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej na dwie powtórzone 96-dołkowe płytki zawierające makrofagi pochodzące z mysiego szpiku kostnego (1-2 tygodnie po izolacji) w 100 μl pożywki D10.
    UWAGA: Wykonaj wstępne badanie przesiewowe pasożyta na 96-dołkowych płytkach w oparciu o objętość kultury pasożyta, aby uniknąć konieczności liczenia liczby pasożytów przenoszonych na każdą studzienkę. Tak więc analiza mikroskopowa w 2.6 opiera się jakościowo na tym, czy pasożyty na ogół się replikowały, czy nie. Krok 3 opisuje podejście do potwierdzenia fenotypu mutantów w szkiełkach komorowych przy użyciu równej liczby pasożytów typu dzikiego lub zmutowanych do zakażenia makrofagów.
    1. Bezpośrednio dodaj pasożyty do pożywki D10 już w każdym dołku. Zainfekuj dwie studzienki tachyzoitami typu dzikiego jako pozytywną kontrolę replikacji pasożytów.
  2. Umieść zainfekowane komórki w inkubatorze (37 ° C i 5% CO2 ) na 4 godziny, aby pasożyty miały czas na inwazję komórek i wytworzenie ich PV.
  3. Usuń nośnik z jednej płyty, wyrzucając zawartość płyty. Użyj jednego ruchu nadgarstka, aby wrzucić media z płytki do miski na odpadki zawierającej detergent cydaliczny dla pasożytów.
    1. Dodać 100 μl "pożywki aktywującej makrofagi" za pomocą sterylnego zbiornika na pożywkę i pipety wielokanałowej. Stosować optymalne stężenie LPS i IFN-γ określone od kroku 1 dla pożywki aktywacyjnej makrofagów. W podobny sposób wyjmij nośnik ze zduplikowanej płytki kontrolnej i zastąp go 100 μl nośnika D10.
  4. Umieść zainfekowane komórki w inkubatorze (37 ° C i 5% CO2 ) na dodatkowe 24-30 godzin.
  5. Protokół barwienia dla płytek 96-dołkowych dla IFA.
    1. Wyrzuć pożywkę z płytki i zastąp ją 100 μl 2,5% formaldehydu w PBS. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej . Użyj sterylnej miski na formaldehyd i pipety wielokanałowej.
    2. Wyrzuć roztwór formaldehydu z płytki i dodaj 100 μl PBS, aby wypłukać formaldehyd z płytki.
    3. Wyrzucić roztwór do płytki i dodać 100 μl buforu permeabilacyjnego (PBS z 0,2% Triton X-100) do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej .
    4. Wyrzuć roztwór z płytki i dodaj 100 μl roztworu blokującego (PBS z 10% kozią surowicą) do każdego dołka. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej .
    5. Wyrzuć roztwór z płytki. Dodać 50 μl/studzienkę fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała anty-T. gondii rozcieńczonego w stosunku 1:1,000 w PBS plus 1% surowicy koziej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z założoną pokrywą płytki i na kołysce.
      1. Alternatywnie można użyć niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko T. gondii, a następnie wybarwienia fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym, jak opisano w 1.10.3.1.
    6. Odrzucić roztwór przeciwciała znajdujący się na płytce i zastąpić go 100 μl/basenik PBS plus 1% koziej surowicy. Wykonaj to płukanie 3 razy, a następnie 2 dodatkowe płukania samym PBS. Pozostaw 200 μl PBS w każdym dołku i załóż pokrywę na płytkę 96-dołkową, aby zapobiec wysychaniu studzienek.
      UWAGA: Płytkę z założoną osłoną można owinąć folią parafilmową i umieścić w temperaturze 4 ° C na okres do 3 dni przed analizą pod mikroskopem.
  6. Zbadaj komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą obiektywu 20-40X. Wybierz mutanty, które replikują się w naiwnej płytce makrofagowej, ale w większości przypadków nie replikują się poza jednym pasożytem/wakuolą w "aktywowanych makrofagach" lub które wydają się amorficzne lub zdegradowane w "aktywowanych makrofagach".
    UWAGA: Liczba pasożytów typu dzikiego w wakuoli będzie zależeć od dawki zastosowanej IFN-γ i LPS, ale idealnie jest to około 4 pasożyty na wakuolę; Liczba odzwierciedlająca zahamowanie wzrostu, ale nie całkowite zahamowanie replikacji przez bodziec aktywacyjny.

3. Oceń mutanty, aby określić, czy defekt jest na poziomie przetrwania pasożyta lub replikacji po aktywacji zakażonych makrofagów

  1. Przenieś wybrane mutanty pasożytów z 96-dołkowych płytek (zawartość całego dołka) do T25 zawierających komórki HFF i pozwól na replikację.
  2. Hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego O/N w 8-komorowych szkiełkach szkiełkowych o stężeniu 3 × 105 komórek/ml w 250 μl pożywki D10. Przygotuj jeden slajd do porównania replikacji pasożyta w nieprawidłowo wykrytych makrofagach i dodatkowy slajd do porównania replikacji pasożyta po aktywacji zakażonych makrofagów.
  3. Zbierz pasożyty tachyzoitu i policz w hemocytometrze. Dodać 5 × 104 pasożyty T. gondii do studzienki komory zawierającej makrofagi w pożywce D10 i kulturze na 4 godziny. Dołącz jedną studzienkę z dzikimi pasożytami rodzicielskimi jako kontrolą. Zaszczepić identyczny preparat repliki tym samym klonem pasożyta, który nie otrzyma pożywki aktywacyjnej, w celu monitorowania replikacji pasożytów w nieleczonych makrofagach.
  4. Wyrzucić pożywkę D10 z 1 z powtórzonych szkiełek komorowych i zastąpić 250 μl "pożywki aktywacyjnej". Wyrzucić pożywkę D10 z drugiego szkiełka komory repliki i zastąpić 250 μl pożywki D10. Inkubować zarówno "aktywowany", jak i "naiwny" szkiełko makrofagowe z założoną pokrywą szkiełka komory w temperaturze 37 ° C i 5% CO2 przez dodatkowe 24-30 godzin.
  5. Mocowanie, przepuszczalność i blokowanie szkiełek do barwienia IFA i analizy pasożytów zgodnie z opisem w kroku 1. Wykonaj barwienie IFA z nienaruszonymi komorami.
    1. Współbarwić komórki przeciwciałem przeciwko lizosomalnej błonie związanej z 1 (LAMP1) lub Lysotracker i przeciwciałem przeciwko T. gondii, aby ocenić, czy aktywacja zakażonych makrofagów wyzwala fuzję zmutowanych PV z lizosomami (Figura 4).
    2. Użyj przeciwciał przeciwko specyficznym kompartmentom/organellom w obrębie pasożyta/PV do barwienia za pomocą IFA w celu zidentyfikowania zmian w mutancie pasożyta, które są widoczne wcześnie po aktywacji makrofagów 28.
      UWAGA: Takie zmiany mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmu, który leży u podstaw niedostatecznego przeżycia/replikacji mutanta po aktywacji makrofagów.
  6. Zbadaj preparaty za pomocą 100-krotnego obiektywu olejowego i mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Oceń replikację pasożytów, określając liczbę pasożytów na PV w 100 losowych wakuolach. Wykonaj co najmniej 2 zliczenia po 100 wakuoli każda w celu analizy statystycznej.
    2. Oceń ogólną morfologię pasożyta za pomocą zarówno analizy fluorescencyjnej, jak i mikroskopii z kontrastem fazowym. Zobacz pasożyty w fazie 100x obiektyw. Zdrowe pasożyty mają pasożyty szczelnie zamknięte w ściśle przylegającej parazytoforowej wakuoli. Pasożyty, które mają amorficzne, przestronne wakuole z gęstymi obrzeżami fazowymi lub pasożyty amorficzne sugerują śmierć pasożyta, a nie tylko defekt replikacji (ryc. 1 i 3).

4. Oceń, czy podatność zmutowanych pasożytów na aktywację zakażonych makrofagów jest związana ze znanymi mediatorami przeciwdrobnoustrojowymi

  1. Wyizoluj makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego od myszy typu dzikiego C57 / BL6, iNOS-/-, gp91-phox-/- lub myszy Irgm1/Irgm3-/- 32.
  2. Hodowla odpowiednich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego O/N w 8-komorowych szkiełkach szkiełkowych w stężeniu 3 × 105 komórek/ml w 250 μl pożywki D10.
  3. Kontynuuj prowokację pasożytami, barwienie IFA i analizę zgodnie z opisem w kroku 3.
  4. Określ, czy zdolność zmutowanych pasożytów do przetrwania i replikacji po aktywacji zakażonych makrofagów zostaje przywrócona przy braku reaktywnych form tlenu lub azotu lub GTPaz związanych z odpornością swoistą 28.
  5. Należy stosować środki farmakologiczne, takie jak donory tlenku azotu, aby ocenić, czy specyficzne mediatory przeciwdrobnoustrojowe są same w sobie wystarczające do upośledzenia zmutowanych pasożytów w komórkach HFF lub naiwnych makrofagów, czy też działają tylko w porozumieniu z innymi mediatorami aktywacji makrofagów 28.

5. Oceń, czy defekt zmutowanego pasożyta zagraża przewlekłej infekcji

  1. Wyizoluj tachyzoity z pasożytów typu dzikiego, zmutowanych lub docelowych z delecją genu hodowanych w T25 zawierających komórki HFF. Pasożyty muszą być świeżo zlosowane z kultur HFF.
  2. Policz pasożyty za pomocą hemocytometru. Zawiesić pasożyty w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) o stężeniu na ml odpowiednim dla subletalnej dawki pasożyta dostarczonej w 200 μl przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP).
  3. Za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml i igły 25 G wstrzyknąć dootrzewnowo (IP) pasożyty o objętości 200 μl. Dawka zależy od dzikiego szczepu pasożyta i genotypu myszy.
    UWAGA: Genotypy pasożyta typu I są śmiertelne dla myszy w ostrym stadium infekcji, niezależnie od dawki pasożyta i nie są odpowiednie do badań nad przewlekłym zakażeniem przy braku chemioterapii T. gondii w celu zahamowania replikacji pasożyta.
  4. Trzydzieści dni po wykryciu pasożyta należy złożyć ofiary myszy poprzez wdychanie CO2 ze zbiornika pod ciśnieniem w niezatłoczonej komorze (klatka dla myszy o standardowej wielkości może zawierać nie więcej niż 5 myszy), a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  5. Odizoluj mózg od myszy za pomocą ustalonych procedur41-43.
    1. Połóż mysz na przedniej stronie. Spryskaj głowę 70% etanolem, aby wysterylizować obszar.
    2. Użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć pień mózgu. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać płytkie cięcie boczne wokół prawej, a następnie lewej strony czaszki, zaczynając od podstawy pnia mózgu. Użyj kleszczy, aby delikatnie odkleić czaszkę, aby odsłonić mózg.
    3. Delikatnie podnieś mózg i umieść nożyczki między mózgiem a podstawą czaszki, aby przeciąć nerw węchowy i uwolnić mózg. Wyjmij mózg za pomocą sterylnych kleszczy lub szpatułki i umieść na bakteriologicznej płytce Petriego zawierającej 10 ml sterylnego PBS.
  6. Przeciąć mózg na pół sterylnym skalpelem przez środek między prawą i lewą półkulą.
  7. Dodać połowę mózgu do małego moździerza zawierającego 1 ml PBS. Użyj moździerza i tłuczka, aby wykonać delikatną zawiesinę tkankową mózgu, która może przejść przez końcówkę pipety o szerokim otworze 20-200 μl.
    UWAGA: Drugą połowę mózgu należy utrwalić w 2,5% formaldehydzie przez 1 godzinę, jeśli do histopatologii potrzebne są skrawki tkanki.
  8. Umieścić 100 μl lizatu mózgowego w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Dodać 1 ml 2,5% formaldehydu z PBS do probówki zawierającej lizat mózgu, aby utrwalić zawiesinę mózgową do barwienia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  9. Odwirować lizat o stężeniu 8 000 x g przez 5 minut w mikrowirówce i ostrożnie wyrzucić supernatant.
  10. Dodać 1 ml buforu permeabilizacyjnego/blokującego do lizatu (10% surowicy koziej, 0,2% Triton X-100 w PBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  11. Odwirować lizat przy 8 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  12. Dodać 200 μl dolichos biflorus agglutin (DBA) sprzężonego z FITC. Użyj rozcieńczenia lektyny w stosunku 1:100 w PBS plus 10% koziej surowicy. Delikatnie zawiesić lizat, pipetując. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT .
    UWAGA: DBA to ligand, który wiąże się z CST1 na ścianie torbieli pasożyta.
  13. Odwirować lizat przy 8 000 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Dodać 1 ml PBS do granulki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz pranie PBS 3x. Po ostatnim przemyciu za pomocą pipety usunąć sklarowany osad końcowy.
  14. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 20-200 μl o szerokim otworze pobrać 5 μl barwionego lizatu mózgowego i umieścić go na szkiełku mikroskopowym. Zamontuj szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 25 x 25 mm, aby utworzyć mokre mocowanie lizatu mózgu. Wykonaj 3 powtórzone preparaty, używając 5 μl lizatu mózgowego każde.
  15. Policz liczbę torbieli na każdą podwielokrotność 5 μl za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obiektywu 10X (ryc. 6).
    UWAGA: Niektóre torbiele są duże (około 8 lub więcej pasożytów), podczas gdy niektóre są bardzo małe (1-2 pasożyty na torbiel). Policz całkowitą liczbę torbieli na każdym slajdzie, ale udokumentuj liczbę dużych i małych torbieli.
  16. Dodać liczbę torbieli wykrytych w trzech różnych podwielokrotnościach o wielkości 5 μl i pomnożyć przez całkowity współczynnik rozcieńczenia x 2 (tylko połowa mózgu została przekształcona w lizat), aby oszacować całkowitą liczbę torbieli na mózg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Toxoplasma gondii swobodnie namnaża się w naiwnych makrofagach, a czas podwojenia liczby pasożytów wynosi od 6 do 12 hr, w zależności od szczepu. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne pasożyty w naiwnych oraz aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego. Rycina 2 pokazuje ogólną morfologię pasożytów w komórkach gospodarza HFF przy 2, 4, 8, 16 i 32 pasożytach/PV. W niniejszym protokole pasożytowi umożliwia się zainfekowanie naiwnych makrofagów i utworzenie początkowej w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany protokół zapewnia bezstronne podejście, które wykorzystuje aktywację makrofagów pochodzących z mysiego szpiku kostnego i genetykę naprzód w celu wyizolowania mutantów T. gondii z defektem ich zdolności do przetrwania aktywacji zakażonych makrofagów. Fenotyp mutantów po aktywacji makrofagów zazwyczaj należy do jednej z dwóch szerokich kategorii: 1) Pasożyty wydają się nienaruszone, ale nie są w stanie replikować się powyżej 1 pasożyta na PV; 2) Pasożyty wyglądają na zdegradowane i mogą znajdować się w prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla Dr. Petera Bradleya za przeciwciało do wykrywania mitochondriów T. gondii. Prace były wspierane przez National Institute of Health Grants AI072028 i AI107431 dla D.G.M oraz hojną darowiznę na rzecz New York Medical College na badania nad medycyną tropikalną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM HycloneSH3008101https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29101& productId=3255471& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=0
Hyclone FBSThermoSH3091003https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=11737973& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=0
Hyclon DPBSThermoSH3002802 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=2434305& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType
=PROD& hasPromo=0
Hyclon L-glutaminaThermoSH3003401 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=3311957& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType
=PROD& hasPromo=0
Pióro hyklonowe paciorkowiecThermoSV30010 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6& catalogId=29104& dopasowanyKot
No=SV30010& fromSearch=1&
searchKey=SV30010& highlightPro
kanałyItemsFlag=Y& endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Od& oszczędności= 0,0& xrefEvent=1407777949003_0
& searchType=PROD& hasPromo=0
Hyclone Hanks BSSThermoSH3003002https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=3064595& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=0
LPS LIST biologiczne201http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γPepro Tech Inc50-813-664https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494& catalogId=29
104& matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1& searchKey=myszy+ifn+pepro+tech& highlightProductsItemsFlag
=Y& endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Od& oszczędności
=0.0& xrefEvent=1407778210608_
12& searchType=PROD& hasPromo
=0
Prowadnice komoroweThermo177402https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=2164545& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=0
96-dołkowe płytki optyczneThermo165306https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=3010670& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=0
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFisher353072https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=3158736& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=0
Wybuch do hodowli tkankowej T25Fisher156367https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67& catalogId=29104& dopasowanyKot
No=12565351& fromSearch=1&
searchKey=156367& highlightProdu
ctsItemsFlag=Y& endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Od& oszczędności
=0.0& xrefEvent=1407778974800_
0& searchType=PROD& hasPromo
=0
Ted Pella Formaldehyd klasy EMTed Pella18505http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100FisherBP151https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=3425922& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=1
Alexa 488 - zestaw do koniugacji białekLife TechnologiesA20181http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
surowicy koziejMP BiomedicalsICN19135680https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=2133236& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& crossRefData
=ICN19135680=2& searchType
=PROD& hasPromo=0
Nośniki montażowe VectashieldVector LabsH1200https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
Dolichos sprzężone z FITCVector LabsFL-1031https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Przeciwciało przeciwko LAMP1Badania rozwojowe Bank Hybridomahttp://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTrackerLife TechnologieL-7526https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
Myszy C57BL6Jackson Laboratories664http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 myszy z nokautem phoxLabaoratories2365http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out myszyJackson Laboratories2609http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
nitroprusydku soduACROS OrganicsAC21164-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=2627727& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=1
DETA NONOateACROS OrganicsAC32865-0250https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Identyfikator=29104& productId=2252389& dis
type=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
PROD& hasPromo=1
Monoklonalny mysz anty-Toxoplasma gondii AbFitzgerald Industries International10T19Ahttp://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947
Jackson

Bibliografia

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483(2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589(2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236(2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14(2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784(2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091(2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354(2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180(2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807(2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348(2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225(2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358(2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927(2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiew genetyczny typu forwardaktywacja makrofag wmutanty paso yt woporno na IFN gammawakuola paso ytniczastaza paso yt wdegradacja paso yt winfekcja przewlek a

Powiązane artykuły