Artykuł metodologiczny

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52562

⸱

14 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu złagodzenie ograniczeń związanych z nieprawidłowym przeszczepem komórek macierzystych w leczeniu zawałów mięśnia sercowego za pomocą systemu hydrożelowego i kleju na bazie fibryny. Dzięki takiemu podejściu można utrzymać kontakt komórka-tkanka po zawale choroby, zwiększając potencjał terapeutyczny korzystnych środków w miejscu urazu.

Streszczenie

Mysi model MI jest powszechnie uznawany w dziedzinie chorób sercowo-naczyniowych i jest konsekwentnie stosowany jako pierwszy krok do testowania skuteczności leczenia in vivo1. Tradycyjny, ustalony protokół został jeszcze bardziej dopracowany w celu zminimalizowania szkód wyrządzonych zwierzęciu. Warto zauważyć, że warstwy mięśni piersiowych są usuwane, a nie po prostu cięte, a torakotomia jest podchodziła międzyżebrowo, w przeciwieństwie do łamania żeber w sternotomii, zachowując integralność klatki piersiowej. Dzięki tym zmianom zmniejsza się ogólny stres zwierzęcia.

Terapie komórkami macierzystymi mające na celu złagodzenie szkód spowodowanych przez zawały serca okazały się obiecujące na przestrzeni lat ze względu na swoje pro-angiogenne i antyapoptotyczne korzyści. Obecne podejścia do dostarczania komórek na powierzchnię serca zazwyczaj obejmują wstrzyknięcie komórek w pobliżu uszkodzonego miejsca, w tętnicy wieńcowej lub do obwodowego krwiobiegu2-4. Chociaż udowodniono, że komórki są domem dla uszkodzonego mięśnia sercowego, jego funkcjonalność jest ograniczona przez ich słabe wszczepienie w miejscu urazu, co powoduje dyfuzję do krwiobiegu5. Niniejszy manuskrypt przedstawia procedurę, która pokonuje tę przeszkodę za pomocą plastra hydrożelowego otoczonego komórkami. Plaster jest wytwarzany przed zabiegiem chirurgicznym i umieszczany na uszkodzonym mięśniu sercowym bezpośrednio po niedrożności lewej tętnicy wieńcowej. Aby przykleić plaster na miejscu, biokompatybilny zewnętrzny klej fibrynowy jest umieszczany bezpośrednio na wierzchu plastra, co pozwala na wyschnięcie zarówno na plastrach, jak i na powierzchni serca. Podejście to zapewnia nowatorską metodę adhezji do zastosowania delikatnego konstruktu terapeutycznego otaczającego komórki.

Wprowadzenie

Zawał mięśnia sercowego (MI) definiuje się jako przerwanie dopływu krwi do obszaru serca spowodowane niedrożnością głównej tętnicy wieńcowej. Uszkodzenia wynikające z zawału mięśnia sercowego są spowodowane przebudową żywotnej tkanki serca w niefunkcjonalną tkankę bliznowatą, co zmniejsza zdolność serca, a dokładniej lewej komory, do prawidłowego bicia. Powoduje to zmniejszenie objętości krwi, która może być dostarczana do organizmu przy każdym uderzeniu serca, znanej jako objętość wyrzutowa, oraz procentu krwi, która jest wypompowywana z serca przy każdym uderzeniu serca, znanego jako frakcja wyrzutowa6. Te, wraz z innymi osłabionymi funkcjami, zwiększają obciążenie reszty serca, aby utrzymać odpowiednie funkcjonowanie. Często ten zwiększony szczep może stać się tak poważny, że powoduje drugi zawał serca, zjawisko obserwowane u około 10% osób7.

Chociaż praktyki medyczne ewoluowały w celu leczenia bezpośrednich następstw zawału mięśnia sercowego, nie opracowano żadnej techniki, która pozwoliłaby zatrzymać, spowolnić lub odwrócić negatywne skutki uboczne przebudowy tkanek. Terapie komórkami macierzystymi pojawiły się jako możliwa droga takiego leczenia, jednak pomimo ich obiecującego potencjału, komórki macierzyste nie okazały się skuteczne w warunkach klinicznych. Jedną z teorii wyjaśniających ich wady jest niezdolność do zapewnienia, że korzystne komórki pozostają w miejscu zawału wystarczająco długo, aby uzyskaćkorzystne wyniki. Wykazano, że nie więcej niż 24% komórek, które są po prostu wstrzykiwane w miejsce zawału, przeżyło i pozostało w uszkodzonym miejscu 1 dzień po porodzie2. Możliwą perspektywą rozwiązania tego problemu retencji komórek jest opracowanie biokompatybilnych systemów hydrożelowych, które otaczają albo komórki, albo środki terapeutyczne, które mogą być dostarczane do uszkodzonego miejsca. Hydrożelem z wyboru w tym protokole jest dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) ze względu na jego wcześniejsze zastosowanie w procedurach enkapsulacji komórek, jednak można użyć dowolnego hydrożelu zdolnego do enkapsulacji8. Dostarczenie plastra bezpośrednio do miejsca urazu zapewnia kontakt komórka-tkanka przez dłuższy czas, wydłużając czas, w którym komórki mogą dostarczać korzystne czynniki do leżącego poniżej mięśnia sercowego.

Wąskim gardłem w podejściu do łatki jest trudność przyklejenia łatki do powierzchni serca. Wiele grup poradziło sobie z tym za pomocą różnych technik, z których najbardziej rozpowszechnioną jest prosty szew do przywiązania konstruktu do powierzchni serca9,10. Okazało się to skuteczne w wielu przypadkach, w których konstrukcja jest wykonana ze sztywniejszego materiału, ale zawodzi przy próbie na systemie hydrożelowym, ze względu na wysokie stężenie wody i delikatną naturę konstrukcji łaty. Aby temu zaradzić, zastosowaliśmy zewnętrzny system klejenia z klejem fibrynowy, który naśladuje chemię tworzenia się skrzepów. Klej fibrynowy był stosowany w wielu operacjach medycznych, w tym w przypadku łez opony twardej, przetok oskrzelowych i przeszczepów rogówki, podkreślając biokompatybilność produktu jako uszczelniacza ran11-13. Ponadto fibryna była stosowana do różnych celów kardiologicznych, w tym do chirurgicznego leczenia pęknięć lewej komory i operacji pomostowania tętnic wieńcowych, jednak jej zastosowanie jako kleju adhezyjnego do plastra sercowego nie jest powszechnie stosowane14-17. Prosta formuła trombiny i fibrynogenu daje w efekcie biokompatybilny klej, który można umieścić bezpośrednio na zewnątrz zewnętrznego plastra nasercowego, zapewniając realny system adhezji zapewniający interakcję plastra z sercem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedura jest w pełni zgodna z protokołem IACUC numer 13302 i została zatwierdzona przez Wydział Zasobów Zwierzęcych.

1. Przygotowanie instrumentu

  1. Autoklawuj wszystkie jednorazowe narzędzia używane przed zabiegiem chirurgicznym, aby zapewnić sterylność.
  2. Sterylizuj narzędzia używane wiele razy podczas sesji za pomocą sterylizatora ze szklanymi kulkami między użyciami.

2. Przygotowanie hydrożelu

  1. Rozmrozić i ułożyć płytki komórek macierzystych co najmniej 24 godziny przed stworzeniem konstruktu hydrożelowego.
  2. Plastry należy przygotować na dzień przed zabiegiem chirurgicznym za pomocą aparatu stereolitograficznego (lub podobnego instrumentu), który został szczegółowo opisany w poprzednich publikacjach8,18.
  3. Aby stworzyć hydrożel, najpierw wygeneruj model projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) żądanej łaty i wyeksportuj projekt do formatu stereolitograficznego (STL).
  4. Stwórz roztwór żelu, rozpuszczając dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) (PEGDMA) w sterylnym 1x PBS, aby uzyskać 20% roztwór w/v. Jednocześnie rozpuścić fotoinicjator 1-[4-(2-hydroksy-etoksy)-fenylo]-2-hydroksy-2-metylo-1-propano-1-on w DMSO. Dodać fotoinicjator do roztworu PEGDMA przy końcowej w/v 0,5%. Bezpośrednio przed sieciowaniem dodać 100 ml pożądanej gęstości komórek. Uwaga: Zalecana jest gęstość komórek między 2,0 x 10 5-2,0 x 106 komórek/ml.
  5. Odpipetuj roztwór żelu wstępnego do naczynia znajdującego się na środku platformy SLA i uruchom oprogramowanie SLA z wcześniej przesłanym projektem w formacie STL.
  6. Usunąć plastry z aparatu i inkubować hydrożele O/N w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionym 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny, aby umożliwić komórkom dostosowanie się do środowiska w plastrach.

3. Przygotowanie zwierząt i intubacja doustna

  1. Oceń każdą mysz przed zabiegiem, aby upewnić się, że zwierzę jest w dobrym zdrowiu, zgodnie z ich nawykami pielęgnacyjnymi i interakcjami z kolegami w klatce. Uwaga: Do tej procedury użyto samic myszy C57BL / 6J w wieku 8-10 tygodni, jednak można użyć dowolnego wieku i typu myszy.
  2. Umieść zwierzęta w komorze anestezjologicznej i poddaj działaniu 5% izofluoranu z podparciem 1 l/minO2. Monitoruj poziom znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp.
  3. Gdy zwierzę zostanie odpowiednio znieczulone, zważ je i umieść na stanowisku do intubacji.
  4. Skieruj źródło światła w stronę klatki piersiowej zwierzęcia i użyj kleszczy, aby cofnąć powierzchnię krtani i odsłonić struny głosowe. Ostrożnie poprowadź angiocath 20 G między strunami głosowymi i płynnie włóż do tchawicy. Wykryj prawidłowe wprowadzenie poprzez mechaniczny ruch jamy klatki piersiowej po podłączeniu cewnika do respiratora dla małych zwierząt.
  5. Dostosuj ustawienia wentylacji do wagi zwierzęcia w oparciu o wytyczne producenta.
  6. Po zaintubowaniu umieść zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii. Upewnij się, że temperatura poduszki grzewczej nie przekracza 40 °C. W razie potrzeby umieść barierę między zwierzęciem a poduszką grzewczą, aby zminimalizować ryzyko poparzenia.
  7. Usuń włosy z miejsca operowanego za pomocą kremu do depilacji. Wysterylizuj miejsce za pomocą 3 naprzemiennych peelingów z betadyny i 75% etanolu, aby zapewnić prawidłową sterylizację. Umieść zasłonę, aby odsłonić tylko pole operowane, i umieść maść weterynaryjną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.

4. Zabieg chirurgiczny

  1. Torakotomię wykonuje się po lewej stronie zwierzęcia, dlatego należy wykonać nacięcie skóry około 1 cm na lewo od mostka, które biegnie wzdłuż mostka.
  2. Użyj kleszczy, aby oddzielić warstwę mięśniową od leżącej pod nią klatki piersiowej w dwóch krokach. Zwróć uwagę na linię wyznaczającą, która reprezentuje mięśnie piersiowe większe zwierzęcia. Lekko unieś ten mięsień, oddziel go od leżącego pod nim zewnętrznego mięśnia skośnego i cofnij przyśrodkowo. Następnie w ten sam sposób uwolnij zewnętrzny mięsień skośny od leżącego poniżej żebra i cofnij się na boki, zapewniając niezakłócony widok drugiego, trzeciego i czwartego żebra.
  3. Wykonaj torakotomię między trzecim a czwartym żebrem. Delikatnie podnieś czwarte żebro i użyj kauteryzatora, aby otworzyć jamę klatki piersiowej między trzecim a czwartym żebrem. Umieść retraktory, aby jeszcze bardziej otworzyć jamę i odsłonić serce.
  4. Użyj kleszczy, aby rozerwać cienkie osierdzie serca.
  5. Podwiązaj lewą tętnicę wieńcową za pomocą 8-0 Szew nylonowy z monofilamentu. Szew należy umieścić około 4 mm od wierzchołka serca, bezpośrednio pod dolnym końcem lewego przedsionka. Określ prawidłowe założenie szwów poprzez blanszowanie mięśnia sercowego komory i zwiększenie rozmiaru lewego przedsionka po zawiązaniu szwu.

5. Umieszczanie naszywek i klejenie

  1. Plastry należy przechowywać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu użycia.
  2. Delikatnie unieś plaster za pomocą szpatułki z płaskim końcem i delikatnie umieść go na powierzchni serca, w miejscu zawału.
    Uwaga: Aby zapobiec zsuwaniu się z lewej komory, plaster można przytrzymać na miejscu, lekko utrzymując kontakt za pomocą szpatułki lub końcówki kleszczy.
  3. Przygotuj klej, mieszając fibrynogen i trombinę w stosunku 4:1. Roztwór mieszać wielokrotnym pipetowaniem, aż zacznie gęstnieć, zwykle w ciągu 1 minuty od rozpoczęcia przygotowania.
  4. Gdy lepkość roztworu osiągnie pożądany poziom, szybko przenieś około 10 ml na powierzchnię plastra. Uwaga: Czas krzepnięcia kleju fibrynowego jest szybki, co zapewnia niewielkie okno możliwości skutecznego przenoszenia kleju.

6. Szycie

  1. Wszystkie szwy zamykające należy wykonać za pomocą nici nylonowej 6-0 monofilamentowej.
  2. Zamknij warstwę żeber trzema do czterech pojedynczych przerwanych szwów.
  3. Przed całkowitym zamknięciem warstwy międzyżebrowej należy wprowadzić kaniulę PE-10 do nacięcia, aby ewakuować jamę klatki piersiowej po całkowitym zamknięciu i przywrócić prawidłowe ciśnienie wewnątrzopłucnowe.
  4. Zamknij mięśnie piersiowe za pomocą trzech do czterech pojedynczych przerwanych szwów.
  5. Uszczelnij warstwę skóry za pomocą ciągłego szwu.
  6. Po całkowitym zamknięciu przymocuj strzykawkę o pojemności 1,0 ml do końca kaniuli i użyj jej do opróżnienia jamy klatki piersiowej.
  7. Nałóż klej tkankowy na miejsce nacięcia, aby wzmocnić miejsce szwu.

7. Leczenie pooperacyjne

  1. Podać myszom zastrzyk buprenorfiny (0,05-1,0 mg/kg) i karprofenu (2,2 mg/kg) podskórnie bezpośrednio po podwiązaniu naczyń wieńcowych i co najmniej 20 minut przed przebudzeniem. Podawaj oba leki 6-8 godzin po zabiegu, a następnie podawaj dwa razy dziennie przez okres do trzech dni, aby kontrolować ból i niepokój.
  2. Stale monitoruj zwierzęta do momentu uzyskania przytomności i co godzinę przez pierwsze 4 godziny po operacji. Wykonaj drugą kontrolę w noc operacji (2-4 godziny później), aby podać drugą dawkę leku przeciwbólowego.
  3. Monitorować zwierzęta codziennie po drugim dniu po zabiegu, aż do momentu, gdy stan zwierząt okaże się stabilny.

8. Analiza funkcji serca i histologii

  1. Wykonaj echokardiografy na myszach 4 tygodnie po zabiegu, aby określić zakres uszkodzeń po zawale mięśnia sercowego.
  2. Znieczulić myszy 4-5% izofluranem w komorze anestezjologicznej w celu indukcji znieczulenia wziewnego, a następnie 2% izofluranem za pomocą maski na twarz w celu znieczulenia podtrzymującego.
  3. Oczyść obszar obrazowania kremem do depilacji i użyj USG małego zwierzęcia, aby uzyskać skan echokardiograficzny 2D w trybie M bijącego serca i zarejestrować związane z nim parametry funkcjonalne
    4. .
  4. Myszy należy poddać eutanazji w komorze z dwutlenkiem węgla, a następnie zebrać serca zwierząt i umieścić w 10% roztworze formaliny na 24 godziny. Po 24 godzinach przenieść serca do 70% etanolu i utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia tkanek.
  5. Przetwórz serca i zanurz je w blokach parafinowych.
  6. Wytnij odcinki 5 mm przez obszar komorowy serca, zaczynając od wierzchołka, a kończąc na przedsionku.
  7. Plastry podzielone na sekcje zarówno trichromem Massona, jak i barwieniem hematoksyliną i eozyną przy użyciu standardowych protokołów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas procedury chirurgicznej podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej można zidentyfikować po wyraźnym zblednięciu tkanek poniżej miejsca zamknięcia tętnicy. W ramach testu przed zawiązaniem węzła można krótko zacisnąć szew, aby sprawdzić, czy znajduje się on w odpowiednim miejscu. Ponadto, ponieważ zamknięcie tętnicy skutkuje niemal natychmiastowym spadkiem zdolności lewego przedsionka do prawidłowego skurczu, lewy przedsionek powiększy się w odpowiedzi na cofanie się krwi w układzie.

Pomiary e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dzięki takiemu podejściu do mysiego modelu zawału mięśnia sercowego opracowaliśmy system, który minimalizuje uszkodzenia obszarów innych niż mięśni sercowe, które są związane z innymi technikami zawału mięśnia sercowego. Obszary te obejmują uszkodzenia spowodowane tracheostomią, przecięciem warstwy mięśniowej i złamaniem żeber w celu odsłonięcia jamy klatki piersiowej. Uważamy, że zmiany te poprawiają ogólny wynik operacji dzięki dbałości o zachowanie jak najwięks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez US Army Grant (W81XWH-08-1-0701) oraz stypendium ze Szpitala Fundacji Carle.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wentylator myszy Harvard Model 687Aparat Harvard55-0001
Inintech Biosciences LLC Sterylizator suchych szklanych kulekFisher ScientificNC9531961
Mikroskop chirurgiczny Leica MZ6
GEM 5917
- końcówki 0,4 mm Kątowenarzędzia naukowe11063-07
Zwijacz Agricola - 3,5 cm rozpiętyFine Science Tools17005-04
Nożyczki sprężynowe - Ostrza 2,5 mm Prostenarzędzia do nauki15000-08
Castroviejo Uchwyt na igły - z blokadą z węglika wolframu 14 cmFine Science Tools12565-14
Nożyczki do tęczówki - delikatne proste 10,5 cmNarzędzia do nauki o nakryciu14060-10
Szew monofilamentowy 8-0Ethicon8730P
6-0 Szew jedwabnyEthicon639G
ThrombinSigmaT7009
FibrinogenSigmaF3879
Klej tkankowy Vetbond3M1469SB
Zestaw do kauteryzacji Gemini

Bibliografia

  1. Kolk, M. V., et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2009).
  2. Li, Y., Yao, Y., Sheng, Z., Yang, Y., Ma, G. Dual-modal tracking of transplanted mesenchymal stem cells after myocardial infarction. International journal of nanomedicine. 6, 815-823 (2011).
  3. Nagaya, N., et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 287, H2670-H2676 (2004).
  4. Wang, J. S., Shum-Tim, D., Chedrawy, E., Chiu, R. C. The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiologic and therapeutic implications. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 122, 699-705 (2001).
  5. Cashman, T. J., Gouon-Evans, V., Costa, K. D. Mesenchymal stem cells for cardiac therapy: practical challenges and potential mechanisms. Stem cell reviews. 9, 254-265 (2013).
  6. Sutton, M. G., Sharpe, N. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: pathophysiology and therapy. Circulation. 101, 2981-2988 (2000).
  7. Smolina, K., Wright, F. L., Rayner, M., Goldacre, M. J. Long-term survival and recurrence after acute myocardial infarction in England, 2004 to 2010. Circulation. Cardiovascular quality and outcomes. 5, 532-540 (2012).
  8. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab on a chip. 10, 2062-2070 (2010).
  9. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta biomaterialia. 10, 2727-2738 (2014).
  10. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  11. Cavallo, L. M., Solari, D., Somma, T., Savic, D., Cappabianca, P. The Awake Endoscope-Guided Sealant Technique with Fibrin Glue in the Treatment of Postoperative Cerebrospinal Fluid Leak After Extended Transsphenoidal Surgery: Technical Note. World neurosurgery. , (2013).
  12. Chung, H. W., Mehta, J. S. Fibrin glue for Gundersen flap surgery. Clinical Ophthalmology. 7, 479-484 (2013).
  13. Dunn, C. J., Goa, K. L. Fibrin sealant: a review of its use in surgery and endoscopy. Drugs. 58, 863-886 (1999).
  14. Chi, N. H., et al. Cardiac repair achieved by bone marrow mesenchymal stem cells/silk fibroin/hyaluronic acid patches in a rat of myocardial infarction model. Biomaterials. 33, 5541-5551 (2012).
  15. Erb, M. A., Claus, T., Hartrumpf, M., Bachmann, S., Albes, J. M. The use of Tachosil surgical patch or fibrin glue in coronary artery surgery does not affect quality of anastomosis or provoke postoperative adhesions in pigs. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 36, 703-707 (2009).
  16. Okada, K., et al. Surgical treatment for rupture of left ventricular free wall after acute myocardial infarction. Interactive cardiovascular and thoracic surgery. 4, 203-206 (2005).
  17. Simpson, D., Liu, H., Fan, T. H., Nerem, R., Dudley, S. C. A tissue engineering approach to progenitor cell delivery results in significant cell engraftment and improved myocardial remodeling. Stem Cells. 25, 2350-2357 (2007).
  18. Jeong, J. H., et al. Living' microvascular stamp for patterning of functional neovessels; orchestrated control of matrix property and geometry. Advanced Materials. 24, 58-63 (2012).
  19. Wu, X., Ren, J., Li, J. Fibrin glue as the cell-delivery vehicle for mesenchymal stromal cells in regenerative medicine. Cytotherapy. 14, 555-562 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie za pomoc plastra hydro elowegoadhezja klejem fibrynowymprocedura torakotomiipodwi zanie lewej t tnicy wie cowejanaliza histologicznaechokardiografia ma ych zwierz tterapia enkapsulacji kom rekchirurgiczne zamkni cie szwempodawanie lek w przeciwb lowych po operacji

Powiązane artykuły