Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52564

⸱

8 kwietnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Streszczenie

Ludzka skóra pełni ważną funkcję barierową i zawiera różne komórki odpornościowe, które przyczyniają się do homeostazy tkanek i ochrony przed patogenami. Ponieważ skóra jest stosunkowo łatwo dostępna, stanowi idealną platformę do badania obwodowych mechanizmów regulacji immunologicznej. Komórki rezydujące immunologicznie w zdrowej skórze prowadzą nadzór immunologiczny, ale odgrywają również ważną rolę w rozwoju chorób zapalnych skóry, takich jak łuszczyca. Pomimo pojawiających się spostrzeżeń, nasza wiedza na temat biologii leżącej u podstaw różnych chorób zapalnych skóry jest nadal ograniczona. Istnieje zapotrzebowanie na dobrej jakości (pojedyncze) populacje komórek wyizolowane z próbek skóry pobranych z biopsji. Do tej pory procedury izolacji były poważnie utrudnione ze względu na brak uzyskania wystarczającej liczby żywotnych komórek. Na izolację i późniejszą analizę wpłynęła również utrata markerów linii immunologicznej komórek ze względu na naprężenia mechaniczne i chemiczne spowodowane obecnymi procedurami dysocjacji w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Tutaj opisujemy zmodyfikowaną metodę izolowania limfocytów T zarówno ze zdrowej, jak i zaangażowanej łuszczycowej skóry ludzkiej, łącząc mechaniczną dysocjację skóry za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek i leczenia kolagenazą. Metodologia ta zachowuje ekspresję większości markerów linii immunologicznej, takich jak CD4, CD8, Foxp3 i CD11c po przygotowaniu zawiesin pojedynczych komórek. Przedstawiono przykłady udanej izolacji limfocytów T CD4 + oraz późniejszej analizy fenotypowej i funkcjonalnej.

Wprowadzenie

Skóra, jako główny interfejs między ciałem a środowiskiem, stanowi pierwszą linię obrony przed zewnętrznymi fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi zniewagami, takimi jak zranienia, promieniowanie ultrafioletowe i mikroorganizmy. Skóra składa się z dwóch głównych przedziałów, naskórka i skóry właściwej, i zawiera różne komórki odpornościowe, w tym komórki Langerhansa, makrofagi, komórki dendrytyczne (DC) i około 20 miliardów limfocytów T pamięci, prawie dwa razy więcej niż liczba obecna w całej objętości krwi1,2. Coraz więcej danych potwierdza pogląd, że skóra pełni podstawowe funkcje immunologiczne, zarówno podczas homeostazy tkanek, jak i w różnych stanach patologicznych. Uważa się, że komórki odpornościowe znajdujące się w normalnej skórze przeprowadzają nadzór immunologiczny3 i wykazano, że odgrywają rolę w rozwoju zaburzeń zapalnych, takich jak łuszczyca4. W łuszczycowej zmianie skórnej obserwowano zarówno limfocyty T naciekane CD4+, jak i CD8+ i wykazano, że stosunek CD4 i CD8 różni się w zależności od statusu choroby5. Jednak te populacje komórek są trudne do zbadania, ponieważ istniejące techniki pozwalają na izolację tylko kilku komórek.

Obecnie powszechnie stosowane techniki izolacji limfocytów T z ludzkiej skóry łączą mechaniczną dysocjację skóry z leczeniem enzymatycznym. Biopsje ludzkiej skóry są intensywnie mielone i inkubowane z enzymami, takimi jak trypsyna, kolagenaza i / lub EDTA6-8. Biorąc pod uwagę, że skóra jest tkanką barierową, która jest wysoce odporna na siły rozciągające i mechaniczną dezagregację, ustalone metody izolacji limfocytów T wytworzyły bardzo mało komórek, a nawet mniejszą liczbę żywotnych komórek, co sprawia, że hodowla komórkowa ex vivo tych populacji komórek jest trudna i wymagająca.

Tutaj przedstawiamy zmodyfikowaną metodę izolacji limfocytów zarówno ze zdrowej, jak i zaangażowanej łuszczycowej skóry ludzkiej, łącząc mechaniczną dysocjację skóry za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek zamiast ustalonej metody intensywnego mielenia, wraz z trawieniem enzymatycznym za pomocą kolagenazy. Po przygotowaniu zawiesiny pojedynczej komórki obserwowano różne żywotne podgrupy komórek odpornościowych, w tym limfocyty DC i T. Co ważne, ekspresja markerów powierzchniowych CD3, CD4 i CD8 była dobrze zachowana. Tak przygotowane komórki są gotowe do użycia w hodowlach komórkowych ex vivo lub analizie metodą cytometrii przepływowej. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do analizy pojedynczych biopsji skóry (4 mm) pochodzących ze skóry chorobowej pacjentów z łuszczycą. Wyniki wykazały, że limfocyty T pacjentów przebywających w skórze wytwarzały więcej cytokin zapalnych, takich jak IL-17 i IFNγ, w porównaniu ze zdrowymi ochotnikami9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Biopsje skóry od zdrowych osób zostały pobrane z resztek skóry brzucha osób poddawanych planowej operacji plastycznej po ustnej lub pisemnej świadomej zgodzie na wykorzystanie naukowe. Stosowanie ludzkiej skóry zostało zatwierdzone i zgodne z przepisami ustalonymi przez Medyczne Komisje Etyczne ds. Badań na Ludziach Centrum Medycznego Uniwersytetu Radboud w Nijmegen w Holandii i Uniwersytetu w Essen w Niemczech.

1. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z ludzkiej skóry (praca sterylna w komorze przepływowej, jeśli wymagana jest kolejna hodowla komórkowa)

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych: RPMI 1640 + penicylina/streptomycyna (końcowe stężenia odpowiednio 100 jednostek/ml i 100 μg/ml) + pirogronian (0,02 mM) i glutamax (0,02 mM), bez dodatku surowicy.
  2. Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną: pożywkę przygotowaną w kroku 1.1 + 10% zbiorcza surowica ludzka (HPS); przechowywać w temperaturze 4°C. Przed użyciem doprowadzić pożywkę do temperatury 20 °C ± 2.
  3. Wykonać biopsję skóry za pomocą okrągłego dziurkacza do biopsji o średnicy 4 mm i przechowywać go w RPMI1640 kompletnej pożywce hodowlanej w temperaturze 20 °C ± 2 przez okres do 4 godzin lub w temperaturze 4 °C ON. Biopsję należy wykonać jak najszybciej po przybyciu do laboratorium.
    UWAGA: Dłuższe przechowywanie skóry wpłynie na wydajność komórek i ich żywotność.
  4. Oznaczyć probówkę dysocjacyjną z niebieską nakrętką i dodać 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej do znakowanej probówki.
  5. Dodać 2 ml kompletnej pożywki do każdej studzienki (w sumie 3 dołki) sterylnej 6-dołkowej płytki hodowlanej. Za pomocą sterylnych narzędzi umieść biopsję w jednym dołku, przepłucz, przenieś ją do drugiego dołka i powtórz ten krok jeszcze raz, uzyskując w ten sposób w sumie trzy płukania.
  6. Przenieś dobrze wypłukaną biopsję skóry na sterylną szalkę Petriego, dodaj 100 μl kompletnej pożywki hodowlanej na wierzch biopsji i ostrożnie zeskrob podskórną tkankę tłuszczową za pomocą jednorazowego sterylnego skalpela ze stali nierdzewnej.
    UWAGA: Jest to krytyczny krok.
  7. Pokrój każdą biopsję skóry na 4 mniejsze kawałki na sterylnej szalce Petriego. Przenieść próbki (do czterech biopsji po 4 mm na probówkę) do przygotowanej probówki dysocjacyjnej zawierającej 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
  8. Szczelnie zamknij rurki nakrętką i przymocuj do góry nogami tuleję automatycznego dysocjatora tkanek. Upewnij się, że cały materiał próbki znajduje się w obszarze wirnika.
  9. Rozpocznij proces dysocjacji, uruchamiając "program m_spleen _01" (predefiniowany program dostarczany przez pamięć wewnętrzną instrumentu lub dołączoną kartę programu) w celu dysocjacji biopsji z odpowiednią prędkością obrotową przez 56 sekund.
  10. Po przetworzeniu odłącz rurkę dysocjacyjną od dysocjatora i upewnij się, że cały zdysocjowany materiał został zebrany na dnie probówki.
  11. Dodać 150 μl kolagenazy I-A (80 mg/ml) do probówki dysocjacyjnej i inkubować próbkę w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Dodać 100 μl DNazy I (5 mu/ml) do probówki dysocjującej, dobrze wymieszać.
    UWAGA: Wyższe stężenie kolagenazy lub dłuższy czas inkubacji zmieni żywotność komórek.
  12. Podłącz rurkę dysocjacyjną do tulei automatycznego dysocjatora tkanek i uruchom "program m_ śledziony _01", aby jeszcze raz oddzielić biopsję.
  13. Umieść sitko z nylonu o pojemności 70 μM na górze probówki Falcon o pojemności 50 ml. Nałóż zdysocjowane materiały próbek do tego sitka do komórek, aby usunąć grudki komórek/resztki tkanek.
  14. Sitko przemyć raz 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 10 minut i odsysać supernatant.
  15. Powtórz krok prania jeszcze raz. Zawiesić osady komórkowe w 300 μl kompletnej pożywki hodowlanej. Zawiesiny jednokomórkowe są gotowe do dalszej analizy; Kontynuuj stosowanie protokołów hodowli komórkowych ex vivo lub analizy cytometrii przepływowej.
  16. W przypadku dalszego barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi przed wykonaniem analizy cytometrii przepływowej należy stymulować komórki PMA (12,5 ng/ml), jonomycyną (500 ng/ml) i brefeldyną A (5 μg/ml) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, inkubatorze 5% CO2 przez 4 godziny.

2. Poliklonalna aktywacja limfocytów T rezydujących w skórze (hodowla komórkowa ex vivo)

  1. Podwielokrotność 100 μl zawiesin jednokomórkowych (przygotowanych w kroku 1.15) na okrągłodenną 96-dołkową płytkę.
    UWAGA: Dla każdej biopsji skóry o średnicy 4 mm nabyte zawiesiny jednokomórkowe można podzielić na co najmniej dwie studzienki 96-dołkowej płytki.
  2. Dodać mikrogranulki pokryte mAb anty-CD3/anty-CD28 (25 000 kulek na studzienkę), rekombinowaną ludzką cytokinę rIL-2 (końcowe stężenie 25 U/ml) i rIL-1β (końcowe stężenie 50 ng / ml).
  3. Przykryj płytkę hodowlaną dobrze oznakowaną pokrywką płytki, inkubować w inkubatorze o wilgotności 5% CO2 i wilgotności 37 °C. Zmień średnie, gdy kolor medium zmieni się na żółty.
    UWAGA: Przejrzystą kolonię komórkową można zaobserwować od 8 dnia hodowli komórkowej.

3. Analiza cytometrii przepływowej pierwotnych/hodowanych limfocytów T rezydujących w skórze

  1. Przygotować bufor FACS: PBS + 0,2% BSA.
  2. Przenieś interesujące komórki do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odsysać supernatant.
  3. Zawiesić osad w 100 μl PBS. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odsysać supernatant.
  4. Wybarwić komórki 100 μl przygotowanego sprzężonego barwnika żywotności eFluorescence780 (rozcieńczenie 1:1 000 przy użyciu PBS) w temperaturze 4 °C przez 30 min. Dodać 100 μl buforu FACS, odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i aspirować supernatant.
  5. Wybierz wymagany marker powierzchni komórki mAb, na przykład: CD45-BV421 (HI30, 1:: 20), CD3-ECD(UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5(1388.2, 1:200), CD8-APC-AlexFluo700(B9.11, 1:400), CD14-FITC(TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750(13-119, 1:50), CD56-PE(MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7(BC96, 1:50), CD11c-PeCy7(BU15, 1:10) i CD1c-APC(AD5-8E7, 1:10), przygotować mieszaninę mAbs, używając buforu FACS, zgodnie z każdym badanym współczynnikiem rozcieńczenia mAb. Zdefiniuj ustawienia bramki za pomocą kontroli izotypu przeciwciała wraz z próbką niebarwiącą.
  6. Dodać 25 μl przygotowanej mieszaniny mAbs do każdej studzienki. Inkubować 20 minut w temperaturze 20 °C ± 2, chronić przed światłem.
  7. Dodać 100 μl buforu FACS, odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odessać supernatant.
  8. W przypadku próbek, które wymagają jedynie barwienia powierzchni komórek, przejdź do kroku 3.16.
  9. W przypadku wewnątrzkomórkowego barwienia Foxp3:
    1. Przygotować bufor utrwalający i przepuszczalny, mieszając jedną część koncentratu z 3 częściami rozcieńczalników.
    2. Przygotować 1x bufor permeabilizacyjny: 1 część 10x bufor permeabilizacji + 9 części wysterylizowanegoH2O.
  10. Zawiesić osady w 100 μl buforu utrwalającego i przepuszczalnego, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  11. Dodać 100 μl buforu permeabilacyjnego do każdej studzienki, odwirować przy 450 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty i odessać supernatant.
  12. Jeszcze raz przemyć komórki buforem permeabilizacyjnym.
  13. Wybierz wymagane wewnątrzkomórkowe przeciwciała monoklonalne, na przykład Foxp3-eFluo450(PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488(eBio64DEC1, 1:50) i IFNγ-PeCy7(4S. B3, 1:400). Przygotować mieszaninę mAbs przy użyciu buforu permeabilacyjnego zawierającego 2% normalnej surowicy szczura zgodnie z każdym badanym współczynnikiem rozcieńczenia mAb. Zdefiniuj ustawienia bramki za pomocą kontroli izotypu przeciwciała wraz z próbką niebarwiącą.
  14. Do każdej studzienki dodać 20 μl przygotowanej mieszaniny mAb. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, chronić przed światłem.
  15. Po 30 minutach inkubacji dodać 100 μl buforu permeabilizacji do każdej studzienki. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odsysać supernatant.
  16. Jeszcze raz przemyć komórki buforem permeabilizacyjnym. Zawiesić osad w 110 μl buforu FACS i przenieść zawiesiny komórek do probówki microFACS.
    UWAGA: Próbka jest gotowa do pomiaru za pomocą 10-kolorowej cytometrii przepływowej.
  17. W przypadku gdy wymagana jest dokładna liczba komórek, należy dodać 10 μl dobrze wymieszanej jednorodnej zawiesiny fluorosfer do każdej próbki bezpośrednio przed wykonaniem pomiarów za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu pozwala na uzyskanie od 2 200 ± 615 (średnia ± SEM, skóra zdrowych ochotników) do 178 000 ± 760 (średnia ± SEM, skóra z obszarów zmian u pacjentów z łuszczycą) żywych limfocytów ze skóry ludzkiej przy zastosowaniu pojedynczej biopsji skóry o średnicy 4 mm.

W zawiesinach pojedynczych komórek uzyskanych ze skóry zdrowych osób zidentyfikowano różne typy komórek CD45+, w tym limfocyty T CD4+ (~45%), limfocyty T CD8+ (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Zaletą tego protokołu jest izolacja stosunkowo dużej liczby żywotnych limfocytów i ekspresja odpowiednich markerów powierzchniowych. Zidentyfikowanymi podzbiorami komórek były: CD11c+ DCs, CD4+ i CD8+ T cell oraz Foxp3+CD25+ cells. Co ważne, hodowla ex vivo wyizolowanych limfocytów T rezydujących w skórze była bardzo dobrze wykonalna i poz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Biopsje skóry od pacjentów z łuszczycą zostały uprzejmie dostarczone przez dr Andreasa Koerbera (Wydział Dermatologii Uniwersytetu w Essen, Niemcy) po ustnej lub pisemnej świadomej zgodzie na wykorzystanie naukowe.

X.H. jest również obsługiwany przez NSFC 61263039 i NSFC 11101321.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednorazowy dziurkacz do biopsjiKai EuropeBP-40F 4mm
Jednorazowe sterylne skalpeleDalhausen1100000510
probówka gentleMACS CMiltenyi Biotech130-093-237Z niebieską nasadką, używana jako rurka dysocjacyjna.
gentleMACS DysocjatorMiltenyi Biotech130-093-235Automatyczny dysocjator tkanek. Korzystanie z "programu spleen_01" do dysocjacji biopsji skóry.
Sitko do komórek BD35235070 &mikro; m nylonowa
96-dołkowa płyta dolna w kształcie litery UGreiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
Pirogronian soduLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies15140-122
Człowiek Pooled Serum (HPS)we własnym zakresie
Kolagenaza ISigma-AldrichC2674Typ 1-A, odpowiednie do hodowli komórkowych
DNaza ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Utrwalany barwnik żywotności (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18Barwienie martwych komórek przed utrwaleniem komórek; rozcieńczyć PBS w stosunku 1:1,000
Koncentrat utrwalający/przepuszczalnyeBioscience00-5123-43
Rozcieńczalnik utrwalający/przepuszczalnyeBioscience00-5223-56
Bufor przepuszczalny (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 Mysz anty-ludzka CD45BD563879klon: HI30; współczynnik rozcieńczenia 1:50
FITC Mysz anty-ludzka CD14DakoT0844Klon: TUK4; współczynnik rozcieńczenia 1:50
PE Mysz anty-ludzka CD56DakoR7127Klon: MOC-1; współczynnik rozcieńczenia 1:50
ECD Mysz anty-ludzka CD3Beckman - CoulterA07748Klon: UCHT1; współczynnik rozcieńczenia 1:50 dla barwienia powierzchni; współczynnik rozcieńczenia 1:25 dla barwienia wewnątrzkomórkowego.
PC5.5 Mysz anty-ludzka CD4Beckman - CoulterB16491Klon: 13B8.2; współczynnik rozcieńczenia 1:200
PeCy7 Mysz anty-ludzka CD11cBeckman - CoulterA80249Klon: BU15; współczynnik rozcieńczenia 1:50
Mysz APC anty-ludzka CD1cMiltenyi Biotech130-090-903Klon: AD5-8E7; współczynnik rozcieńczenia 1:10
APC-AlexFluo700 Mysz anty-ludzka CD8Beckman - RedlicaA66332Klon: B9.11; współczynnik rozcieńczenia 1:400
APC-AlexFluo750 Mysz anty-ludzka CD19Beckman - CoulterA94681Klon: J3-119; współczynnik rozcieńczenia 1:50
PeCy7 Mysz anty-ludzka CD25eBioscienceAD5-8E7Klon: BC96; współczynnik rozcieńczenia 1:50
  PE Szczur anty-ludzki CLAMiltenyi Biotech130-091-635klon: HECA-452; współczynnik rozcieńczenia 1:
eFluo450 Szczur anty-ludzki Foxp3eBIoscience48-4776-42Klon: PCH101; barwienie wewnątrzkomórkowe; współczynnik rozcieńczenia 1:50
AlexFluo488 Mysz anty-ludzka IL-17AeBioscience53-7179-42Klon: eBio64DEC17; barwienie wewnątrzkomórkowe; współczynnik rozcieńczenia 1:50
PeCy7 Mysz anty-ludzka IFNgeBioscience25-7319-41Klon: 4S. Klasa B3; barwienie wewnątrzkomórkowe; współczynnik rozcieńczenia 1:400
Fluorosfery zliczające przepływBeckman - Coulter7547053Kulki zliczające, do cytometrii przepływowej
przygotowane

Bibliografia

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biopsja sk rydysocjacja tkankitraktowanie kolagenazcytometria przep ywowasitko do kom rekwirowanieanaliza FACShodowla ex vivomarkery kom rek odporno ciowych
Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.