Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Streszczenie

Modele in vitro są opłacalną i etyczną alternatywą do badania procesów gojenia się ran skórnych. Co więcej, dzięki wykorzystaniu komórek ludzkich, modele te lepiej odzwierciedlają sytuację ran u ludzi niż modele zwierzęce. Chociaż modele dwuwymiarowe są szeroko stosowane do badania procesów takich jak migracja i proliferacja komórek, do uzyskania głębszej wiedzy na temat gojenia się ran potrzebne są modele, które są bardziej złożone. Oprócz odpowiedniego systemu modelowego, generowanie precyzyjnych i powtarzalnych ran ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia porównywalnych wyników między różnymi seriami testowymi. W tym badaniu pokazano generowanie trójwymiarowej skóry o pełnej grubości odpowiadającej badanemu gojeniu się ran. Część skórna modeli składa się z ludzkiego fibroblastu skórnego osadzonego w hydrożelu kolagenu typu I ze szczurzego ogona. Po inokulacji ludzkimi keratynocytami naskórka i wynikającej z tego hodowli na granicy faz powietrze-ciecz, na modelach tworzy się wielowarstwowy naskórek. Aby zbadać proces gojenia się ran, opracowaliśmy dodatkowo zautomatyzowane urządzenie do ranienia, które generuje standaryzowane rany w sterylnej atmosferze.

Wprowadzenie

Skóra jest największym organem ciała. Tworzy barierę między środowiskiem zewnętrznym a narządami wewnętrznymi. Ponadto skóra chroni organizm przed utratą płynów, wpływami środowiska, urazami i infekcjami oraz pomaga regulować temperaturę ciała¹. Ze względu na odsłonięte miejsce, skóra jest często dotknięta urazami mechanicznymi, termicznymi lub chemicznymi. Chociaż skóra jest ogólnie zdolna do samonaprawy, wiele czynników miejscowych, takich jak infekcja, dotlenienie i niewydolność żylna, może prowadzić do upośledzenia gojenia się ran. Gojenie się ran może być również zaburzone przez czynniki ogólnoustrojowe, takie jak otyłość, alkoholizm, palenie tytoniu, leki, odżywianie i choroby, takie jak cukrzyca. ^{cyfra arabska}

Proces gojenia się ran można podzielić na 3 fazy: (i) fazę zapalną, (ii) fazę proliferacyjną i (iii) fazę przebudowy. Po zranieniu skóry rozpoczyna się złożona kaskada sygnałowa, prowadząca do zamknięcia rany. ³ Po urazie rana krwawi i tworzy się skrzep krwi. Fibroblasty przemieszczają się do skrzepu krwi i zastępują go nową tkanką, która jest następnie przebudowywana przez lata.

Obecne zrozumienie procesów biologicznych leżących u podstaw naprawy skóry jest ograniczone. Modele małych zwierząt i świń zostały wykorzystane do badania gojenia się ran. Jednak wyników tych nie można bezpośrednio przenieść na ludzi ze względu na różnice specyficzne dla gatunku. Oprócz tych modeli in vivo, niektóre aspekty gojenia się ran można badać, symulując sytuację rany poprzez drapanie monowarstwowych kultur in vitro opartych na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych. ⁴ Te modele drapania są wysoce ustandaryzowane, ale nie odzwierciedlają w wystarczającym stopniu złożonej fizjologii in vivo. ⁵ Oprócz modeli dwuwymiarowych na potrzeby badań dermatologicznych opracowano trójwymiarowe odpowiedniki ludzkiej skóry. Część skórna tych modeli jest generowana przy użyciu różnych rusztowań, w tym pozbawionej komórek skóry ^właściwej6, hydrożeli kolagenowych,7,8 glikozaminoglikanów9 lub materiałów syntetycznych. ¹⁰ Wykorzystując te odpowiedniki skóry, można badać rolę oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych¹¹, reepitelializację, przesłuch komórkowy między fibroblastami a keratynocytami oraz wpływ różnych czynników wzrostu. Co więcej, modele te są przydatne do zdobycia nowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób fibroblasty migrują do zranionego obszaru i jak czynniki chemotaktyczne wpływają na regenerację tkanek. ¹²

Nie tylko generowanie modelu gojenia ran samo w sobie jest wyzwaniem, ale także ustalenie wysoce ustandaryzowanej rany w modelu jest problematyczne. Powszechnymi technikami tworzenia ran są testy zadrapań, ¹³ oparzeń, ¹⁴ ścieranie taśmy, ¹⁵ urazy termiczne, ¹⁶ pęcherzy ssących, ¹⁷ ciekłego azotu, ¹⁸ laserów, ¹⁹ skalpeli, ¹⁸ mesherów⁶ i stemple biopsyjne. ²⁰ Większość z tych metod ma te same pułapki. Urazy wdrażane ręcznie są trudne do standaryzacji i odtworzenia między wieloma testami. Wielkość, kształt i głębokość rany różnią się w zależności od badania, a tym samym pogarszają jakość danych badawczych. Zastosowanie lasera do zdefiniowanych ran skóry może być stosunkowo łatwo ustandaryzowane, ale prowadzi do sytuacji naśladującej rany oparzeniowe. Ciepło stosowane laserem może powodować denaturację białek, agregację płytek krwi lub zwężenie naczyń, co może prowadzić do martwicy tkanki.

W alternatywnym podejściu, opracowaliśmy automatyczne urządzenie do ranienia (aWD), które pozwala nam generować zdefiniowane i precyzyjne rany skórne w sterylnych warunkach. Parametry nawijania, takie jak głębokość i prędkość penetracji oraz obroty głowicy wiertarskiej, można regulować. W tym badaniu połączyliśmy aWD z opracowanymi przez nas odpowiednikami skóry o pełnej grubości (ftSE), które są porównywalne z protokołem opublikowanym przez Gangatirkar i wsp. ⁸ Warstwa skórna odpowiednika skóry składa się z ludzkich fibroblastów skóry (hDF), które są osadzone w hydrożelu kolagenu I. Na warstwie skórnej wysiewane są ludzkie keratynocyty naskórka (hEK). W ciągu dwóch tygodni na granicy faz powietrze-ciecz hEK tworzy naskórek składający się z kilku ważnych warstw komórek i warstwy rogowej naskórka. Oprócz wygenerowania tego modelu, badanie to pokazuje wykorzystanie aWD do tworzenia zdefiniowanych i precyzyjnych ran w ftSE.

Protokół

UWAGA: Protokół jest przeznaczony do produkcji 24 odpowiedników skóry o pełnej grubości. Ludzkie fibroblasty skóry i keratynocyty naskórka wyizolowano z biopsji skóry zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem. ^21,22 Wcześniej uzyskano świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną ds. badań na ludziach Uniwersytetu Juliusza Maksymiliana w Würzburgu (głos 182/10).

1. Produkcja składnika skórnego

1. Rozpuść kolagen w 0,1% kwasie octowym do końcowego stężenia 6 mg/ml. Aby uzyskać roztwór neutralizujący żel, wymieszaj 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml płodowej surowicy cielęcej, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml siarczanu chondroityny (5 mg / ml). Trzymaj roztwór neutralizujący żel i roztwór kolagenu na lodzie. Obliczać 500 μl żelu na wkładkę/ekwiwalent skóry.
   UWAGA: Ponieważ roztwór neutralizujący żel zostanie zmieszany z dwiema częściami roztworu kolagenu, przygotuj podwójną ilość kolagenu.
2. Umieść 24 wkładki w płytce 24-dołkowej.
3. Zawiesić ludzkie fibroblasty skóry (hDF) w 10 ml DMEM, wirować przez 5 minut przy 270 x g i policzyć komórki. Wyekstrahuj potrzebną ilość hDF (5 x 10⁴ komórki na 500 μl żelu kolagenowego) i odwiruj komórki przez 5 minut przy 270 x g.
4. Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić hDF w 4 ml schłodzonego roztworu neutralizującego żel, nie wytwarzając pęcherzyków powietrza. Na tym etapie upewnij się, że pracujesz tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć przedwczesnego zestalenia żeli kolagenowych.
5. Zawiesić roztwór z 8 ml roztworu kolagenu.
6. Weź mieszaninę kolagenowo-komórkową za pomocą pipety wieloetapowej i szybko napełnij 500 μl mieszaniny do każdej wkładki. Inkubować żele przez 20 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ) w celu wypłukania żeli.
7. Zanurzyć żele w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) na dołek i inkubować przez 24 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO_{2 ).}

2. Dodawanie ludzkich keratynocytów naskórka (hEK)

1. Usunąć podłoże po 24 godzinach. Rozpuścić ludzkie białko fibronektyny w ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 50 μg/ml. Pokryć każdy odpowiednik skórny 25 μl roztworu fibronektyny. Inkubować żele przez 30 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ).
2. W międzyczasie ponownie zawiesić hEK w 10 ml KGM-2 i ustawić stężenie komórek na 1 x 10⁶ komórek/ml z gotowym KGM-2 + 5% FCS. Wysiew 1 x 10⁵ hEK na każdy żel. Inkubować żele przez 45 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ), aby umożliwić przyleganie komórek.
3. Zanurzyć żele w KGM-2 ready + 5% FCS i hodować je w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ).

3. Kultura ekwiwalentów skóry pełnej grubości (ftSE)

1. Hodowla ftSE przez 6-7 dni w malejącym stężeniu FCS (5%, 2% i 0% FCS). Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni z następnym niższym stężeniem FCS. W tym celu całkowicie usuń podłoże i dodaj 1,6 ml świeżego podłoża.
2. W dniu 7 całkowicie usuń podłoże.
   UWAGA: Nie dotykaj przy tym powierzchni ftSE końcówką pipety.
3. Umieść każdą wkładkę w 1 dołku na 6-dołkowej płytce ze sterylnymi kleszkami. Dodaj 1,5 ml pożywki powietrznej do każdego dołka, uważając, aby nie zmoczyć powierzchni ftSE. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni przez dodatkowe 14 dni.
   UWAGA: Poziom napełnienia pożywki wynosi do menisku ftSE.

4. Analiza histologiczna

1. Utrwalanie i zatapianie parafiny w ftSE
   1. Usunąć pożywkę hodowlaną, przenieść wkładki do świeżych 24-dołkowych płytek i utrwalić tkanki, dodając 1,6 ml 4% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubować tkanki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Uwaga! Paraformaldehyd jest toksyczny, manipuluje pod wyciągiem. Przenieś ftSE do kasety z zatopieniem tkanki. Usuń pozostały utrwalacz, przemywając go wodą i odwodnić tkankę za pomocą rosnących stężeń etanolu.
   2. Podziel odpowiednik skóry pionowym nacięciem pośrodku. Umieść dwa kawałki w metalowej formie wypełnionej parafiną z przyciętymi powierzchniami w dół. Dodaj kasetę z bibułkami na wierzchu formy jako podkład.
   3. Pokrój plastry o grubości 3-5 μm i umieść je na łaźni wodnej o temperaturze 40 °C w celu oczyszczenia, zamontuj szkiełka na odpowiednich szkiełkach mikroskopowych. Dokładnie wysuszyć plastry.
2. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunohistochemią (IHC)
   1. Umieścić szkiełka podstawowe w stojaku i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C. Upewnij się, że parafina jest stopiona. Ponownie nawodnione plastry należy zabarwić za pomocą H&E jako znormalizowanego barwienia przeglądowego.
   2. Do barwienia H&E przygotuj 4x szklane kuwety do barwienia z ksylolem, 3x z etanolem 96%, 2x z etanolem 70%, 1x z etanolem 50%, 4x wodę dejonizowaną, 1x hematoksylinę, 1x HCl-etanol (13,7 ml 1 M HCl i 200 ml 50% etanolu), 1x wodę w tabletce, 1x eozynę (1 g eozyny w 100 ml wody dejonizowanej) i 2x 2-propanol.
   3. Umieść szkiełka na 10 minut w ksylolu I i 10 minut w ksylolu II w celu odparafinowania i ponownego uwodnienia szkiełek. Szkiełka zanurzeniowe 3x w etanolu 96% I, 3x w etanolu 96% II, 3x w etanolu 70% i 3x w etanolu 50%. Obracaj szkiełka w wodzie dejonizowanej. Aby rozróżnić barwnik hematoksyninowy, zanurz 2x w HCl-etanolu. Spłucz w wodzie dejonizowanej. W celu zaniebieszczenia umieść szkiełka na 5 minut w wodzie z zakładkami. W przypadku barwienia eozyną umieść szkiełka na 1 minutę w eozynie, a następnie umyj w wodzie dejonizowanej. W celu odwodnienia zanurz szkiełka 2x w etanolu 70%, 2x w etanolu 96% i umieść je na 5 minut w 2-propanolu I, na 5 minut w 2-propanolu II, 5 minut w ksylolu I i 5 minut w ksylolu II. Po barwieniu H&E jądra komórkowe są barwione na niebiesko, cytoplazma i macierz zewnątrzkomórkowa są barwione na czerwono.
   4. W celu pobrania antygenu usuń parafinę ksylenem i ponownie uwodnij plastry do barwienia. Umieść plastry w parowarze i gotuj odparafinowane i ponownie uwodnione plastry przez 20 minut w podgrzanym 10 mM buforze cytrynianowym (pH 6).
   5. Umieść szkiełka w buforze do mycia (bufor PBS + 0,5% Polysorbat 20) i zakreśl plasterki za pomocą płynoodpornego markera do slajdów, pisaka lub rysika diamentowego.
   6. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej. Zablokuj endogenną peroksydazę, dodając 100 μl 3% roztworu nadtlenku wodoru na każdy plasterek. Ostrożność! Bardzo niebezpieczne w przypadku kontaktu ze skórą i oczami. Obchodzić się z osobistymi środkami ochrony osobistej. Umyj szkiełka w buforze myjącym.
   7. Zastosować przeciwciało pierwszorzędowe i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć szkiełka trzykrotnie buforem do mycia. Od tego momentu próbki należy przechowywać w ciemności.
   8. Użyj systemu wykrywania biotyny i streptawidyny do wykrywania specyficznego wiązania antygen-przeciwciało.
   9. Przeciwbarwić jądra hematoksyliną przez 1 min. Odwodnić i zamontować szkiełka.
   10. Obrazowanie próbek za pomocą mikroskopu odwrotnego.

5. Obrażenia spowodowane użyciem automatycznego urządzenia do ranienia (aWD)

1. Przygotuj aWD, dezynfekując obszar roboczy 70% etanolem i światłem ultrafioletowym. Upewnij się, że zamocowana jest głowica wiertarska o żądanym rozmiarze (np. 1 mm).
2. Umieść odpowiedniki skóry w wyznaczonych obszarach autoklawizowanej płytki nośnej próbki za pomocą sterylnych kleszczy. Umieść płytkę nośną próbki w gnieździe pod głowicą wiertarską.
3. Za pomocą oprogramowania sterującego ustaw parametry nawijania w następujący sposób: prędkość wirowania: 15 000 obr./min; penetracja: 1,5 mm; napęd: 100 Hz. Parametry te muszą być zdefiniowane indywidualnie dla każdego typu próbki. Przenieś parametry nawijania do aWD.
4. Rozpocznij procedurę ranienia. Wyjąć płytkę nośną próbki z gniazda. Przenieś zraniony ftSE z powrotem do wkładek używanych do hodowli za pomocą sterylnych kleszczy.
5. Kontynuuj posiew zranionego ftSE w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) w celu zbadania regeneracji. Alternatywnie, w dowolnym momencie można użyć modeli do analizy histologicznej.

Wyniki

Izolowane hDF i hEK różnią się zarówno morfologią, jak i ekspresją typowych markerów. hDF wykazywał typową morfologię wrzecionowatą, podczas gdy morfologię hEK można opisać za pomocą morfologii bruku. Komórki charakteryzowano za pomocą barwienia immunohistochemicznego (ryc. 1) przed użyciem ich do ftSE. hDF są dodatnie dla wimentyny (ryc. 1A), markera fibroblastów. Pierwotne białko różnicujące hEK o wysokiej ekspresji wcześnie różnicującej cytokeratynę-14 (Figura 1B), al...

Dyskusja

Komórki in vitro są zwykle namnażane w dwuwymiarowych hodowlach komórkowych, w których komórki przylegają do powierzchni z tworzywa sztucznego. Jednak te warunki hodowli nie odzwierciedlają fizjologicznych warunków trójwymiarowych, w których komórki rosną in vivo. W warunkach trójwymiarowych komórki mogą tworzyć naturalne przyłącza komórka-komórka i komórka-matryca i migrować w trzech wymiarach. Szczególnie w przypadku gojenia się ran skórnych podobieństwo do sytuacji in vivo ma kluczowe znacze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trypsyna EDTA (1:250) 0,5% w DPBS	PAA	L11-003	0,05%
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma	D8537
Kolagen (6 mg / ml w 0,1% kwasie octowym)	Wyprodukowany w domu
Fibronektyna Białko ludzkie, osocze (50  &mikro; g / ml)	Life Technologies	33016-015
Wkładki	Nunc	140627
płytka 6-dołkowa	Szkiełko mikroskopowe Nunc	140685
24-dołkowe	142485		Nunc
	. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts hodowla (500 ml):
DMEM, wysoki poziom glukozy	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Surowica bydlęca płodu	Bio & Sprzedaj	SKO. ADD.0500	10% (50 ml)
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Pożywka do hodowli keratynozyny (500 ml):
Keratynocyte Pożywka wzrostowa 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Pożywka dla wzrostu keratynocytów 2 Suplement	Promocell	C-39011
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Roztwór neutralizujący żel (250 ml):
Dulbecco' s Modified Eagle Medium, wysoka zawartość glukozy w proszku z L-glutaminą	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Sól sodowa siarczanu chondroityny z chrząstki rekina	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Surowica bydlęca	płodu Bio & Sprzedaj	SKO. ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Podłoże do modelu skóry (500  ml):
Keratynocyte Pożywka wzrostowa 2	Promocell	C-20111
Pożywka wzrostowa keratynocytów 2 Pakiet uzupełniający	Promocell	C-39011
Surowica cielęca płodu	Bio & Sprzedaj	SKO. ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Podłoże na granicy powietrze-ciecz model skóry (500 ml):
Keratynocyte Growth Medium 2
Pakiet suplementów	Promocell	C-39011	dodając tylko suplementy: insulinę, hydrokortyzon, epinefrynę, transferynę, CaCl2
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Przeciwciało wimentyny	Abcam	ab92547
Przeciwciało CK14	Sigma	HPA023040-100 i mikro; l
Przeciwciało CK10	Dako	M7002
Przeciwciało Filaggrin	Abcam	ab81468
H& Barwienie E: < / silne>
Mayer i ostre; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Etanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mocowanie medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML