Luminescencyjna identyfikacja elementów funkcjonalnych w nieulegających translacji regionach 3' (3'UTR) (3'LIFE) to technika identyfikacji funkcjonalnej regulacji w 3'UTR przez miRNA lub inne czynniki regulacyjne. Protokół ten wykorzystuje metodologię o wysokiej przepustowości, taką jak transfekcja 96-dołkowa i testy lucyferazy, do badania przesiewowego setek domniemanych interakcji pod kątem represji funkcjonalnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie celów miRNA w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3'LIFE
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Luminescencyjna identyfikacja elementów funkcjonalnych w 3'UTR (3'LIFE) pozwala na szybką identyfikację celów określonych miRNA w tablicy setek odpytywanych 3'UTR. Identyfikacja celu opiera się na teście podwójnej lucyferazy, który wykrywa wiązanie na poziomie mRNA poprzez pomiar wyjścia translacyjnego, dając funkcjonalny odczyt celowania w miRNA. W ramach projektu 3'LIFE wykorzystywane są niezastrzeżone i odczynniki oraz publicznie dostępne biblioteki reporterów, dzięki czemu badania przesiewowe całego genomu są wykonalne i opłacalne. Badanie 3'LIFE można przeprowadzić zarówno w standardowym laboratorium, jak i zwiększyć przy użyciu robotów do obsługi cieczy i innych urządzeń o wysokiej przepustowości. Ilustrujemy to podejście, używając zestawu danych ludzkich 3'UTR sklonowanych na 96-dołkowych płytkach oraz dwóch testowych miRNA, let-7c i miR-10b. Pokazujemy, jak przeprowadzać przygotowanie DNA, transfekcję, hodowlę komórkową i testy lucyferazy w formacie 96-dołkowym oraz udostępniamy narzędzia do analizy danych. Podsumowując, projekt 3'LIFE jest wysoce powtarzalny, szybki, systematyczny i identyfikuje cele o wysokim poziomie ufności.
Wprowadzenie
Ogólnym celem tej metody jest wykrywanie i precyzyjne mapowanie celów mikroRNA (miRNA) w wysokiej przepustowości. MiRNA to endogenne niekodujące RNA o długości ~22 nukleotydów. Po transkrypcji i przetwarzaniu dojrzałe miRNA są włączane do kompleksu białkowego zwanego kompleksem wyciszającym indukowanym RNA (RISC). Każdy miRNA kieruje RISC do docelowych elementów zlokalizowanych głównie w regionach 3'nieulegających translacji (3'UTR) informacyjnych RNA (mRNA), co skutkuje albo represją translacji, albo rozszczepieniem mRNA 1. MiRNA rozpoznaje miejsca docelowe na podstawie standardowego parowania zasad chwiejnych Watsona-Cricka i G:U i mają charakter zdegener....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórkowa (24-48 godzin przed transfekcją)
- 24-48 godzin przed transfekcją wysiewać wystarczającą ilość komórek HEK293T w oparciu o liczbę transfekowanych płytek 96-dołkowych.
UWAGA: Aby zapewnić spójne transfekcje, płytki komórkowe o wystarczającej gęstości, aby sprzyjać szybkiemu podziałowi, ale nie powinny być przy zbiegu większym niż 70-90% w momencie transfekcji. - Każda 96-dołkowa płytka wymaga 9 x 106 komórek (75 000 komórek na dołek i 120 dołków na płytkę, aby uwzględnić użycie pipety zbiornikowej i wielokanałowej). Oblicz czas podwojenia komórek HEK293 (zwykle ~ 20 godzin) i zasiej odpowiednią liczbę komórek, ab....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Plik wyjściowy z luminometru zawiera surowe pomiary dla białek lucyferazy świetlika oraz Renilla. Ten surowy format jest kompatybilny z arkuszami kalkulacyjnymi „3’LIFE – single plate analysis” oraz „3’LIFE – multiplate analysis” dostępnymi na stronie internetowej laboratorium Mangone (www.mangonelab.com). Arkusz do analizy pojedynczej płytki automatycznie oblicza stosunek lucyferazy świetlika/Renilla, normalizuje każde miRNA względem odpowiedniej kontroli negatyw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test 3'LIFE identyfikuje funkcjonalne cele miRNA w 3'UTR w trybie wysokoprzepustowym. Ten test jest przydatny dla badaczy, którzy chcą eksperymentalnie zidentyfikować dużą liczbę przypuszczalnych celów dla swoich interesujących ich miRNA. Test 3'LIFE jest potężnym podejściem do zapytania o regulację sterowaną przez 3'UTR, ponieważ test zapewnia funkcjonalną miarę celowania w miRNA, a binarne testowanie pojedynczego reportera::3'UTR na pojedynczym miRNA może z pewnością zająć się statusem celowania poszczególnych genów. A.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Prace te są wspierane przez fundusze z College of Liberal Arts and Science oraz Biodesign Institute na Uniwersytecie Stanowym Arizony oraz NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.
Podziękowania
Dziękujemy Stephenowi Blazie, Karen Anderson, Joshowi LaBaerowi za rady i dyskusję. Karen Anderson, Johnowi Chaputowi i Joshowi LaBaerowi za udostępnienie odczynników i oprzyrządowania, Michaelowi Gaskinowi i Andrei Throop za porady techniczne i protokoły. Justin Wolter jest stypendystą Mahera i dziękuje rodzinie Maher za hojne wsparcie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynniki | |||
| glicyloglicyna | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| lucyferyna | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicylina/Streptomycyna | Sigma | P4333 | |
| Trypsyna | T2600000 | ||
| Materiały eksploatacyjne | |||
| Zestaw MaxiPrep Promega | A2392 | ||
| 96-dołkowa minipłytka przygotowawcza | Pall | 8032 | |
| 96-dołkowa płytka wahadłowa | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Bufor do lizy | Promega | E1941 | |
| Instrumenty | |||
| 96-dołkowy czytnik płytek GloMax Promega | E9032 | ||
| Biomech FX Robot do obsługi cieczy | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-dołkowy system wahadłowy | Lonza | AAM-1001 | |
| Licznik komórek Hrabina | Invitrogen | Zobacz materiał C10227 |
Bibliografia
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (680....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
