Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

DOI:

10.3791/52650

⸱

24 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy sygnatur ekspresji IFN typu I i III. Test dyskryminuje różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi transkryptami tych genów. Dzięki montażowi wsadowemu i zrobotyzowanemu pipetowaniu testy są spójne i powtarzalne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany w tym raporcie jest test qRT-PCR do analizy siedemnastu ludzkich podtypów IFN w formacie płytki 384-dołkowej, który zawiera wysoce specyficzne sondy z zablokowanym kwasem nukleinowym (LNA) i molekularnym sygnalizatorem (MB), standardy transkrypcji, automatyczne pipetowanie wielokanałowe i suszenie płytek. Określenie ekspresji wśród interferonów typu I (IFN), zwłaszcza dwunastu podtypów IFN-α, jest ograniczone przez ich wspólną tożsamość sekwencyjną; podobnie sekwencje IFN typu III, zwłaszcza IFN-λ2 i -λ3, są bardzo podobne. Test ten zapewnia wiarygodny, powtarzalny i stosunkowo niedrogi sposób analizy ekspresji siedemnastu transkryptów podtypu interferonu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interferony typu I i III (IFN) są kluczowe w odpowiedzi immunologicznej na wirusy i inne bodźce chorobotwórcze i występują u wszystkich kręgowców1. Komórki immunologiczne i nieimmunologiczne wyrażają i wydzielają, a także reagują na IFN2. Wrodzone czujniki immunologiczne, takie jak receptory toll-podobne (TLR), STING i RIG-I, indukują ekspresję IFN typu I i III po wykryciu wzorców molekularnych związanych z patogenem (PAMP)3,4. U ludzi IFN typu I obejmuje IFN-β, -ω, -κ i 12 podtypów IFN-α i wiąże się z kompleksem receptora IFNAR1 / IFNAR22,5. IFN typu III obejmują IFN-λ1, -λ2 i -λ3 i wiążą się z kompleksem receptora IL10RB / IL28RA2. Klasycznie IFN typu I i III wiążą się z odpowiednimi kompleksami receptorowymi, które następnie rekrutują heterodimery STAT1/STAT2 i inicjują transkrypcję genów stymulowanych interferonem (ISG)6. ISG są zaangażowane w różnorodny zakres funkcji, od działania przeciwwirusowego i antyproliferacyjnego po aktywację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej7.

Liczne mechanizmy, które patogeny wyewoluowały, aby unikać, obalać i przejmować elementy szlaku sygnałowego IFN, pokazują znaczenie IFN we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej8. Na przykład wirus krowianki wykazuje ekspresję receptora wabika z homologią IFNAR1, który sekwestruje IFN9 typu I, podczas gdy wirus choroby podobnej do Yaba wydziela glikoproteinę, która hamuje białka IFN typu I i III10. Oprócz ich roli w obronie gospodarza, IFN są również zaangażowane w nadzór nad rakiem i szereg chorób autozapalnych: wyciszenie ekspresji IFN w komórkach raka piersi ogranicza nadzór immunologiczny11, nadprodukcja IFN-α jest mechanizmem rozwoju tocznia rumieniowatego układowego12, a błędna aktywacja STING prowadzi do ogólnoustrojowego zapalenia spowodowanego nadmierną ilością IFN w waskulopatii związanej z STING13. Terapeutycznie IFN są stosowane w leczeniu stwardnienia rozsianego14, przewlekłych infekcji wirusowych, takich jak HBV15 i HCV16,17, oraz nowotworów, takich jak białaczka włochatokomórkowa18 i przewlekła białaczka szpikowa19. Pytania o znaczenie IFN w określonym procesie fizjologicznym nieustannie ujawniają wszechobecny charakter tej rodziny cytokin.

IFN typu I, zwłaszcza podtypy IFN-α, są często uważane za jedną jednostkę20-23, a nie jako grupę blisko spokrewnionych, ale odrębnych białek. Istnienie i utrzymywanie się wielu gatunków IFN, w tym podtypów IFN-α, w trakcie ewolucji kręgowców24 sugeruje, że co najmniej podzbiór tych podtypów ma specyficzne lub unikalne funkcje. Możliwe jest, że zdefiniowanie wzorców wyrażeń IFN rozszyfruje i pomoże scharakteryzować specyficzne funkcje jednego lub więcej podtypów17. Wyzwanie związane z badaniem podtypów IFN typu I i III opiera się na ich wspólnej tożsamości sekwencyjnej: dwanaście podtypów IFN-α ma wspólne >50%25, a podtypy IFN-λ mają 81-96%26 sekwencji aminokwasowych. W opisanym teście qRT-PCR sondy fluorescencyjne z radiolatarnią molekularną (MB) i zablokowanym kwasem nukleinowym (LNA) rozróżniają różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi sekwencjami podtypu IFN i pozwalają na scharakteryzowanie sygnatury ekspresji IFN. Format 384-dołkowej płytki testu obejmuje zarówno pomiary ilościowe (standardy transkryptów), jak i półilościowe (geny porządkowe (HKG)), co pozwala na analizę odpowiednio według liczby kopii transkryptu i ∆Cq. Montaż wsadowy, ułatwiony dzięki zautomatyzowanemu pipetowaniu wielokanałowemu, oraz długotrwałe przechowywanie, możliwe dzięki suszeniu zestawów starter/sonda (Pr/Pb) na płytkach, zwiększają powtarzalność, użyteczność i praktyczność testu.

Ten protokół opisuje proces przygotowania 384-dołkowych płytek testowych qRT-PCR (Rysunek 1) z maksymalnie siedemnastoma różnymi zestawami Pr/Pb ukierunkowanymi na ludzkie podtypy IFN (Tabela 1). Talerze źródłowe z zestawu roboczego Pr/Pb (rysunek 2) służą do przygotowania wielu 384-dołkowych płytek testowych w procesie, który można zautomatyzować za pomocą zrobotyzowanego pipetora wielokanałowego. Podczas gdy początkowo skupiono się na stworzeniu protokołu do badania sygnatur ekspresji ludzkiego IFN, metoda ta została zastosowana również w przypadku makaków rezusów. Chociaż układy płytek są nieco inne, a zestawy Pr/Pb (Tabela 2) są różne, ogólna metoda przygotowania do tworzenia płytek człowieka i rezusa jest identyczna. Przy minimalnych modyfikacjach protokołu metoda może zostać zrealizowana, aby umożliwić opracowanie testów do badania innych grup blisko spokrewnionych genów.

Zobacz rysunki 1 i 2 poniżej

Zobacz tabele 1 i 2 poniżej

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie standardowych rozcieńczeń seryjnych (Rysunek 3A)

UWAGA: Seria seryjnych rozcieńczeń linearyzowanych plazmidów zawierających sekwencje docelowe przez zestaw Pr/Pb jest używana jako standardy ilościowe dla testu qRT-PCR. Każdy standardowy zestaw do rozcieńczania seryjnego dla podtypów IFN zawiera wystarczającą objętość, aby uruchomić 90 płytek testowych. Cztery punkty wzorcowej krzywej rozcieńczania używanej do oznaczania dobiera się tak, aby obejmowały wartości Ct z zakresu od 20 do 32 (tabela 3).

  1. Rozmrozić, odwirować i krótko odwirować roztwory wzorcowe (50 pM) i roztwory podstawowe DNA plemników łososia (SSDNA, 10 mg/ml).
  2. Przygotować mieszaninę SSDNA/woda dla 17 standardowych zestawów rozcieńczeń, mieszając 51 μl SSDNA z 20,3 ml wody.
  3. Oznaczyć jeden 8-probówkowy pasek PCR dla standardowego zestawu do rozcieńczania.
    UWAGA: Przygotowanie wzorcowych rozcieńczeń seryjnych z roztworów podstawowych zajmie 2-3 godziny.
  4. Dozować 190 μl mieszanki SSDNA/woda do pierwszej probówki w pasku i 180 μl mieszanki SSDNA/woda do pięciu pozostałych probówek.
  5. Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:20, przenosząc 10 μl z wywaru wzorcowego 50 pM do probówki ze 190 μl SSDNA/wody, wymieszać; odwirować i szybko odwirować pasek PCR.
  6. Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:10, przenosząc 20 μl z ostatnio rozcieńczonej probówki do następnej probówki z serii; odwirować i szybko odwirować pasek PCR.
  7. Powtarzać krok 1.6 do momentu, gdy ostatnia probówka z serii rozcieńczeń otrzyma wzorzec.
  8. Powtórz kroki 1.3-1.7 dla każdego standardu.

Zobacz Tabelę 3 poniżej

2. Przygotowanie startera/sondy (Pr/Pb) i bez kontroli szablonu (NTC) Robocze mieszanki stockowe (Rysunek 3B)

UWAGA: Każdy 1,7 ml zapasu roboczego zestawu Pr/Pb i 128,6 μl mieszanki roboczej NTC (No Template Control) wytworzy 30 płytek testowych.

  1. Przygotuj zestaw Pr/Pb robocze mieszanki zapasów.
    UWAGA: Przygotowanie zestawu Pr/Pb i roboczych mieszanek towarowych NTC z roztworów podstawowych zajmie 2-3 godziny.
    1. Zawiesić startery i sondy w temperaturze 100 μM z ultraczystą wodą w celu przygotowania roztworów podstawowych.
    2. Oznaczyć do siedemnastu probówek o pojemności 2 ml; po jednej dla każdego zestawu Pr/Pb dołączonego do testu.
    3. Rozmrozić, odwirować i krótko odwirować startery (100 μM), sondy (100 μM) i roztwory podstawowe SSDNA (10 mg/ml).
    4. Dodaj 2 μl SSDNA do każdej probówki za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 μl. Dodaj odpowiedni starter do przodu, starter wsteczny i sondę do każdej działającej rurki zestawu Pr / Pb. Patrz Tabela 1 dla zestawów Pr/Pb ukierunkowanych na ludzkie podtypy IFN i Tabela 2 dla zestawów Pr/Pb makaków rezusów. Dodaj wodę, aby zwiększyć objętość każdej działającej rurki zestawu Pr/Pb do 200 μl.
      UWAGA: Objętość starterów, sondy i wody do dodania zależy od wymaganego końcowego stężenia reakcyjnego zestawu Pr/Pb.
  2. Przygotuj robocze mieszanki zapasów NTC.
    1. Oznacz dwa 5-probówkowe paski PCR dla mieszanek zapasów roboczych NTC.
    2. Przenieś 14,3 μl każdego zestawu Pr/Pb do odpowiedniej probówki do mieszania materiałów roboczych NTC. Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z kombinacjami zestawów Pr/Pb dla studni NTC. Dodać wodę do każdej z mieszanin roboczych NTC, aby uzyskać ostateczną objętość do 128,6 μl.
    3. Odwirować, krótko odwirować i umieścić probówki w ciemności na lodzie lub w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.

Zobacz Tabelę 4 poniżej

  1. Rozcieńczyć zapasy robocze zestawu Pr/Pb.
    1. Po usunięciu podwielokrotności zestawów Pr/Pb wymaganych dla mieszanin materiałów roboczych NTC, dodać 1,5 ml wody, aby doprowadzić końcową objętość każdej probówki roboczej zestawu Pr/Pb do 1,7 ml.
    2. Odwirować, krótko odwirować i umieścić probówki w ciemności na lodzie lub w temperaturze -20 °C w celu dłuższego przechowywania.

3. Przygotowanie 384-dołkowych płytek testowych przy użyciu automatycznego pipetora wielokanałowego

  1. Przygotować 96-dołkową płytkę źródłową z zestawów Pr/Pb i mieszanin NTC do porcjowania na 384-dołkowe płytki testowe.
    UWAGA: Przygotowanie płyty źródłowej z mieszanek wyrobisk Pr/Pb zajmie mniej niż 1 godzinę. Każda 96-dołkowa płytka źródłowa wystarcza do wytworzenia sześciu 384-dołkowych płytek testowych (rysunek 3C).
    1. Odwirować i krótko odwirować zapasy robocze zestawu Pr / Pb i mieszanki materiałów roboczych NTC.
    2. Umieścić nową 96-dołkową płytkę w schłodzonym 96-dołkowym bloku chłodzącym i oznaczyć studzienki dla każdego zestawu Pr/Pb lub mieszanki NTC, którą otrzymują studzienki (patrz rysunek 2).
    3. Dodać wodę do płytki 96-dołkowej za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 250 μl: Dozować 66 μl wody do każdej studzienki z zestawem Pr/Pb (z wyjątkiem 4 studzienek dla Celu 17). Dozuj 82,5 μl wody do 4 studni Target 17. Dozuj 27,5 μl wody do każdej studzienki NTC.
    4. Dodaj odpowiedni zapas roboczy zestawu Pr/Pb do wyznaczonych dołków płytki 96-dołkowej: Dozuj 54 μl odpowiedniego zapasu roboczego zestawu Pr/Pb do wyznaczonych dołków zestawu Pr/Pb (z wyjątkiem 4 dołków dla Celu 17). Dozować 67,5 μl materiału roboczego z zestawu Target 17 Pr/Pb do wyznaczonych studzienek zestawu Target 17 Pr/Pb. Do wyznaczonych dołków dodać 22,5 μl odpowiedniej mieszanki roboczej NTC.
    5. Uszczelnić 96-dołkową płytkę z płytką samoprzylepną, uszczelnić i odwirować przez 1 minutę przy 700 x g, aby upewnić się, że zawartość znajduje się na dnie studzienek.
    6. Umieść 96-dołkową płytkę w mieszalniku wirowym za pomocą adaptera do płytki 96-dołkowej i mieszaj przez 1 minutę z prędkością 1,000 obr./min. Odwirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut przy 700 x g.
    7. Przechowywać 96-dołkową płytkę źródłową w ciemności w temperaturze 4 °C, jeśli jest używana tego samego dnia, w przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Przygotować 384-dołkowe płytki testowe, dodając zestawy Pr/Pb za pomocą zautomatyzowanego pipetora wielokanałowego.
    UWAGA: Przygotowanie sześciu płytek testowych z 96-dołkowej płytki źródłowej zajmie 3-4 godziny.
    1. Przed wykonaniem płyt należy wstępnie schłodzić gniazdo chłodzące do 4 °C i podgrzać parownik płytowy do 125 °C, a dolny blok grzewczy do 80 °C przy przepływie powietrza wydmuchiwanym w zakresie 20-25 litrów na minutę (LPM).
    2. Włącz automatyczny pipet wielokanałowy i otwórz protokół do wykonywania płytek testowych IFN, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.
    3. Aby ustawić platformę, umieść całkowicie wypełnione pudełko z końcówkami do pipet w pozycji 1 platformy, 96-dołkową płytkę źródłową w pozycji 4, a nową 384-dołkową płytkę w pozycji 6. Rozpocznij bieg, naciskając przycisk odtwarzania.
      UWAGA: Po zakończeniu cyklu każda studzienka będzie zawierała 5 μl mieszanki Pr/Pb.
      UWAGA: Ostateczna ilość SSDNA dodana na studzienkę z 384-dołkowej płytki testowej wynosi 0,025 μg.
    4. Delikatnie postukaj 384-dołkową płytką testową o płaską powierzchnię, aby upewnić się, że płyny znajdują się na dnie studzienek i nałóż samoprzylepną uszczelkę płytkową.
    5. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 700 x g. Usunąć samoprzylepną uszczelkę płytki, umieścić 384-dołkową płytkę testową w suszarce płytkowej i umieścić kolektor 384-dołkowy bezpośrednio nad studzienkami.
    6. Gdy zawartość 384-dołkowej płytki testowej wyschnie, nałożyć nową uszczelkę z płytki samoprzylepnej, zawinąć w folię, oznaczyć etykietą i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Płyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
    7. Powtarzać kroki 3.2.3-3.2.6 do momentu przygotowania 6 384-dołkowych płytek testowych lub wyczerpania cieczy w 96-dołkowej płytce źródłowej.
    8. Wyłącz gniazdo chłodzące, zamknij oprogramowanie i wyłącz automatyczny pipetor wielokanałowy. Wyłącz suszarkę płytową.

4. Ładowanie i uruchamianie 384-dołkowej płytki testowej

  1. Przygotuj dwie mieszanki dołków genów porządkowych (HKG), które składają się z zestawu Pr / Pb dla mieszanki głównej HKG, SSDNA, PCR i wody, które zostaną dodane do wysuszonej płytki testowej 384 dołków (ryc. 3D).
    UWAGA: Przygotowanie mieszanek i załadowanie płytki testowej zajmie 1-2 godziny. Uruchomienie płytki testowej zajmie mniej niż 2 godziny.
    1. Oznacz probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdej mieszanki HKG.
    2. Rozcieńczyć 2 μl SSDNA (10 mg/ml) w 84,9 μl wody. Dodać 2 μl rozcieńczonego SSDNA, 11,8 μl wody, 23 μl mieszanki głównej i 9,2 μl odpowiedniego zestawu 20x HKG Pr/Pr do każdej probówki, wiru i krótkiej wirówki.
    3. Należy użyć dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) i ubikwityny C (UBC) jako HKG do testu na ludziach (patrz tabela materiałów). Użyj GAPDH i rybosomalnego RNA 18S jako HKG do testu Rh.
      UWAGA: HKG użyte do przeprowadzenia testu są elastyczne i powinny odzwierciedlać geny odpowiednie dla badanego typu komórki. GAPDH, UBC i 18S to przykłady powszechnie używanych HKG; inne HKG mogą być bardziej odpowiednie.
  2. Przygotować mieszaniny próbek i studzienek do kontroli dodatniej, które składają się z próbki lub cDNA kontroli dodatniej, mieszaniny wzorcowej i wody, które należy dodać do wysuszonej płytki do oznaczania 384-dołkowego. Przygotować próbkę, a kontrola dodatnia miesza się w ilości wystarczającej do dozowania do 21 dołków płytkowych (rysunek 3D).
    1. Przed syntezą cDNA postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować próbki RNA z etapem trawienia DNazy.
    2. Przygotować próbki i przeprowadzić kontrolę pozytywną z wyprzedzeniem na podstawie syntezy cDNA co najmniej 500 ng RNA, a następnie poddać działaniu RNazy H (końcowa objętość 24 μl dla każdej próbki) zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotowane cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Rozmrozić, odwirować i krótko odwirować próbkę cDNA.
    3. Dodać 78,8 μl mieszanki wzorcowej i 54,8 μl wody do każdej próbki o objętości 24 μl i probówki kontroli pozytywnej.
    4. Zwirować i krótko odwirować probówki.
  3. Przygotować wzorce i mieszaniny studzienek NTC, składające się z mieszanki wzorcowej i wody, które zostaną dodane do wysuszonej płytki do oznaczania 384-dołkowego (rysunek 3D). W przypadku studzienki wzorcowej należy dodać 165 μl wody do 275 μl mieszanki wzorcowej w probówce o pojemności 1,5 ml. W przypadku mieszania studzienek NTC dodać 52,5 μl wody do 52,5 μl mieszanki wzorcowej w probówce o pojemności 1,5 ml. Zwirować i krótko odwirować probówki.
  4. Przygotować wysuszoną 384-dołkową płytkę testową do załadowania mieszanin i próbek.
    1. Wyjąć wysuszoną 384-dołkową płytkę testową z 4 °C i odwirować przez 1 minutę przy 700 x g.
    2. Umieścić płytkę na schłodzonym 384-dołkowym bloku chłodzącym, zdjąć samoprzylepną uszczelkę płytki i obrysować dołki płytki, aby wskazać miejsca, w których różne mieszaniny i próbki będą pipetowane (rysunek 1).
  5. Załaduj 384-dołkową płytkę testową standardową mieszanką studzienek, wzorcami, mieszaniną studzienek NTC, próbkami, kontrolą pozytywną i mieszanką HKG (rysunek 3E). Zwirować i krótko odwirować wszystkie roztwory przed dozowaniem do płytki.
    1. Dozować 6 μl wzorców, dobrze wymieszać z każdym dołkiem wzorcowym za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl. Dozować 1,5 μl odpowiedniego standardowego rozcieńczenia seryjnego do wyznaczonej studzienki za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 μl.
    2. Dozować 7,5 μl studzienki NTC do każdej studzienki NTC za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl. Dozować 7,5 μl próbki do wyznaczonych studzienek za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl. Dozować 2,5 μl mieszanin HKG Pr/Pb do wyznaczonych dołków za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 μl.
    3. Napełnij puste studzienki 7,5 μl pozostałej wody i wymieszaj mieszaninę wzorcową za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl; 7,5 μl samej wody również będzie odpowiednie.
    4. Uszczelnić 384-dołkową płytkę testową optyczną folią adhezyjną i odwirować przez 1 minutę przy 700 x g. Wirować zapieczętowaną płytkę 384-dołkową w mieszalniku wirowym przez 2 minuty przy 2 600 obr./min i wirować przez 5 minut przy 700 x g.
    5. Umieść zapieczętowaną 384-dołkową płytkę testową w maszynie qRT-PCR, otwórz szablon układu testu i rozpocznij przebieg.
      UWAGA: Wyniki można wyeksportować jako arkusz kalkulacyjny lub jako plik tekstowy do analizy.
    6. Do testu należy zastosować następujące optymalne warunki reakcji termocyklera: i) 50 °C przez 2 min, ii) 95 °C przez 10 min, iii) 95 °C przez 25 s, iv) 59 °C przez 1 min. Powtórz kroki iii i iv przez 40 cykli.
    7. Eksportuj surowe dane z platformy qRT-PCR do oprogramowania aplikacyjnego do arkuszy kalkulacyjnych. Wykreśl każdy 4-punktowy zestaw wzorców jako krzywą standardową, aby zaobserwować liniowość. Przeprowadzić analizę, obliczając ∆Cq lub liczbę kopii na podstawie czteropunktowych krzywych standardowych27.

Zobacz Rysunek 3 poniżej

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany test qRT-PCR może być zaimplementowany do analizy wzorców ekspresji IFN typu I i III w różnych typach komórek i kontekstach. Na przykład ludzkie sygnatury ekspresji IFN typu I i III analizowano w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od 6 dawców stymulowanych ligandami TLR; poli I:C (25 μg / ml), LPS (10 ng / ml), imikwimod (10 μM) i oligonukleotydy CpG (1 μM) (ryc. 4). Dane analizowano za pomocą arkusza kalkulacyjnego i przedstawiano w postaci wykresów radarowych z podtypami IFN-α ułożonymi zgodnie z ruchem wskazówek zegara zgodnie z drzewem filogenetycznym ich sekwencji białek27. Wykresy radarowe ludzkiej ekspresji IFN są przedstawione w skali logarytmicznej obliczonej przy użyciu dwóch różnych metod analizy włączonych do projektu testu: bezwzględnej wartości Cq znormalizowanej do HKG (ΔCq) i liczby kopii matrycy na mikrogram (μg) całkowitego RNA. Wartości liczb kopii są obliczane na podstawie wyników krzywej standardowej transkrypcji. Dane pokazują, że sygnatury ludzkiej ekspresji IFN wywoływane przez agonistów TLR są specyficzne dla ligandów.

Zobacz Rysunek 4 poniżej

Jak wykazano dla ludzkich sygnatur ekspresji IFN, sygnatury ekspresji IFN typu I i III u makaków rezusów były również specyficzne dla ligandów TLR. PBMC od 3 dawców stymulowano poli I:C (50 μg / ml), LPS (10 μg / ml) i imikwimodem (10 μg / ml) przez 3 godziny (ryc. 5). Ekspresja podtypu IFN w komórkach niestymulowanych na początku badania była niska. Ograniczona liczba podtypów IFN- uległa ekspresji w odpowiedzi na LPS i poli I:C. W przeciwieństwie do tego, ekspresja IFN w odpowiedzi na imikwimod była wysoka, a ekspresja podtypu była szeroka. Ekspresja IFN-β i IFN-λ1 została zwiększona przez wszystkich trzech agonistów TLR28.

Zobacz Rysunek 5 poniżej

figure-results-1
Rysunek 1: Układ 384-dołkowej płytki testowej z siedemnastoma zestawami Pr/Pb. Numer docelowy odnosi się do zestawu Pr/Pb. Czteropunktowe krzywe standardowe (ciemnoszary trójkąt) są dodawane do kolumn 1–5. Zestawy HKG Pr/Pb (białe tło) są dodawane do kolumn 6 i 7. Pozostałe kolumny, 8-24, są specyficzne dla jednego z siedemnastu zestawów Pr/Pb. Próbki są dodawane do wierszy A-P, z kolumn 6-24 (czarne strzałki). Dwie studzienki (O5, P5) na dnie kolumny 5 otrzymują tylko wodę i mieszankę główną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Układ 96-dołkowej płytki źródłowej z siedemnastoma zestawami Pr/Pb. Numer docelowy odnosi się do zestawu Pr/Pb. Czarne strzałki oznaczają, gdy zestaw Pr/Pb jest dodawany do wielu studzienek. Mieszanki NTC są dodawane do wyznaczonych studzienek (ciemnoszare tło). Dwie studzienki (F3, G3) z ukośnymi liniami są nieużywane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat poszczególnych kroków w protokole testu qRT-PCR. Diagram AE wybiera fragmenty protokołu. (A) Etap 1: Przygotowanie wzorcowych rozcieńczeń seryjnych. (B) Krok 2: Przygotowanie mieszanek materiałów roboczych Pr/Pb i NTC. (C) Krok 3.1: Przygotowanie 96-dołkowej płytki roboczej z zestawami Pr/Pb i mieszankami NTC. (D) Etap 4.1-3: Przygotowanie mieszanek do załadowania płytki do oznaczania 384-dołkowego. (E) Krok 4.5: Ładowanie płytki do badania 384-dołkowego. Diagramy są odczytywane od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu. Odczynniki do oznaczania interferonu (IFN) są przechowywane w temperaturze -20 oC i są wymienione w lewej kolumnie; linie oddzielają akcje w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Sygnatura ekspresji ludzkiego IFN w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) różni się w odpowiedzi na ligandy TLR używane do stymulacji. PBMC stymulowano ligandami TLR, a RNA pobrano do analizy qRT-PCR. Średnie geometryczne pikowych reakcji na poli I:C (25 μg/ml) po 8 godzinach (czerwone kwadraty), LPS (10 ng/ml) po 4 godzinach (zielone trójkąty), imikwimod (10 μM) po 16 godzinach (fioletowe diamenty), CpG (1 μM) po 16 godzinach (czarne kółka) i niestymulowaną kontrolę po 16 godzinach (niebieskie kółka) od 6 dawców są pokazane w skali logarytmu10 jako funkcja ekspresji HKG UBC ΔCq (po lewej) lub jako liczba kopii na μg RNA (po prawej). Podtypy IFN-α są uporządkowane zgodnie z wykresem filogenetycznym podobieństwa sekwencji aminokwasów. Rysunek ten został pierwotnie opublikowany w Immunology and Cell Biology27.

figure-results-5
Rycina 5: Sygnatura ekspresji IFN makaka rezusa w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) różni się w odpowiedzi na ligandy TLR stosowane do stymulacji. PBMC od trzech makaków rezusów (oznaczonych kwadratem, rombem i trójkątem) wyizolowano z krwi pełnej i stymulowano lipopolisacharydem (LPS) (10 μg/ml), poli I:C (50 μg/ml) lub imikwimodem (10 μg/ml). Komórki pobrano po 0 godzinach (kształty otwarte) lub po 3 godzinach stymulacji TLR (kształty zamknięte) w celu pomiaru ekspresji IFN. Poziomy transkryptu IFN typu I, II i III są wyświetlane w skali logarytmu10 jako funkcja ekspresji HKG GAPDH ΔCq (po lewej) lub jako liczba kopii/μg RNA (po prawej). Liczba ta została pierwotnie opublikowana w Journal of Interferon and Cytokine Research28.

figure-results-6
Tabela 1: Sekwencje ludzkiego zestawu starter/sonda IFN i informacje o reakcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-7
Tabela 2: Sekwencje zestawu starter/sonda IFN makaka rezusa i informacje o reakcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

pkt. pkt. pkt. pkt. szt. szt. pkt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt.
Stężenie plazmidu (fM)
ZAWZD
IFN-α125Rozdział 2.50,250,025
IFN-α225Rozdział 2.50,250,025
IFN-α42500Z kolei 25025Rozdział 2.5
IFN-α525Rozdział 2.50,250,025
IFN-α6Z kolei 25025Rozdział 2.50,25
IFN-α7Z kolei 25025Rozdział 2.50,25
IFN-α8Z kolei 25025Rozdział 2.50,25
IFN-α1025Rozdział 2.50,250,025
IFN-α1425Rozdział 2.50,250,025
IFN-α16Z kolei 25025Rozdział 2.50,25
IFN-α1725Rozdział 2.50,250,025
IFN-α2125Rozdział 2.50,250,025
IFN-λ125Rozdział 2.50,250,025
IFN-λ225Rozdział 2.50,250,025
IFN-λ3Z kolei 25025Rozdział 2.50,25
IFN-β25Rozdział 2.50,250,025
IFN-ωZ kolei 25025Rozdział 2.50,25

Tabela 3: Informacje o stężeniu zestawu standardowych rozcieńczeń.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt.
Dodano zestawy IFN Pr/PbObjętość dodanej wody (ml)
Zobacz materiał NTC 1IFN-β, -ω, -λ385,7
Dzielnica NTC 2IFN-α1, -α5100,0
Zobacz materiał NTC 3IFN-α2114,3
Magazyn NTC 4IFN-α4114,3
Zobacz materiał NTC 5IFN-α7114,3
Dzielnica NTC 6IFN-α6, -α8, -α1085,7
Zobacz materiał NTC 7IFN-α14, -α16100,0
Zobacz materiał NTC 8IFN-α17114,3
Dzielnica NTC 9IFN-α21, -λ1100,0
Zobacz materiał NTC 10IFN-λ2114,3

Tabela 4: Informacje o mieszankach roboczych NTC.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisano projekt, produkcję seryjną i podejście do analizy testu w celu pomiaru transkrypcji zestawu bardzo podobnych genów w warunkach laboratorium badawczego. Opisany tutaj wysokoprzepustowy test qRT-PCR mierzy podtypy IFN- i -λ z wysoką swoistością. Metoda ta obejmuje dwa kluczowe aspekty: projektowanie zestawów Pr / Pb, które rozróżniają członków homologicznej rodziny genów oraz opracowanie platformy produkcyjnej do tworzenia wiarygodnych i spójnych 384-dołkowych płytek testowych wstępnie załadowanych zestawami Pr / Pb. Sondy qRT-PCR wykorzystują podejście strukturalne (MB) lub chemiczne (LNA) w celu zwiększenia ich specyficzności29. W przypadku dwóch zestawów starterów w teście rezusów (Tabela 2) system mutacji opornych na amplifikację (ARMS) został włączony do sekwencji starterów, aby jeszcze bardziej zwiększyć swoistość30. Chociaż generalnie najlepiej jest celować w połączenia ekson-ekson w celu zwiększenia swoistości reakcji qRT-PCR, nie było to możliwe, ponieważ geny IFN typu I nie mają intronów. W związku z tym genomowe DNA zostanie amplifikowane w reakcji PCR i musi zostać zdegradowane przez traktowanie DNazą po ekstrakcji RNA.

Region docelowy dla zestawów Pr / Pb był ograniczony do regionów kodujących dojrzały peptyd dla każdego IFN. Ze względu na duże podobieństwo sekwencji między podtypami IFN-α, w szczególności regionu dojrzałego peptydu, czasami konieczne było obniżenie czułości w celu zapewnienia swoistości. Dotyczyło to w szczególności IFN-α17, gdzie transkrypt dojrzałego peptydu ma tylko cztery unikalne zasady w porównaniu z innymi podtypami IFN-α. Celowanie w IFN-α17 wymagało starterów, które wiążą transkrypty wielu podtypów, ograniczając swoistość do sondy. W konsekwencji reakcja PCR amplifikuje podtypy inne niż IFN-α17, zużywając w ten sposób znaczny procent odczynników PCR i obniżając amplitudę sygnału fluorescencji ze specyficznej sondy dla IFN-α17. Dodatkowym wyzwaniem związanym z projektowaniem czułych i specyficznych zestawów Pr/Pb dla bardzo podobnych genów, takich jak IFN, jest możliwość, że sekwencje z adnotacjami w bazie danych GenBank mogą nie być kompletne lub kompleksowe w momencie projektowania. Również w tym przypadku stanowiło to wyzwanie dla IFN-α17, w którym nowo opisane sekwencje nie są idealnie dopasowane do wersji sekwencji w bazie danych w momencie projektowania. Dlatego też, projektując zestawy Pr/Pb dla genów, które nie były intensywnie badane, dobrze jest okresowo sprawdzać najnowszą sekwencję z adnotacjami docelowego genu. Wreszcie, konieczne jest zapewnienie, że zestawy Pr/Pb nie amplifikują pseudogenów, które mogą być transkrybowane, ale nie mogą być translowane.

Po zaprojektowaniu zestawów Pr/Pb, kolejnym wyzwaniem jest optymalizacja warunków PCR siedemnastu różnych zestawów Pr/Pb na jednej płytce 384-dołkowej. Wzorce transkryptu są ważne w testowaniu specyficzności zestawu Pr/Pb i stają się niezbędne do harmonizacji warunków qRT-PCR wielu różnych reakcji PCR. Testowanie zestawu Pr/Pb w stosunku do standardów transkrypcji ustala jego skuteczność i czułość; plazmidy, które wyrażają bardzo podobne pseudogeny, mogą być konieczne, aby zapewnić, że zestaw Pr / Pb selektywnie mierzy transkrypcję funkcjonalnego genu. Standardy transkryptów zapewniają również ilościowe środki analizy (liczba transkryptów), oprócz analizy półilościowej w odniesieniu do genu porządkowego (ΔCq).

Zrobotyzowane pipetowanie wielokanałowe z 96-dołkowej płytki źródłowej do wielu 384-dołkowych płytek testowych poprawia precyzję i spójność wyników międzypłytkowych. DNA plemników łososia (SSDNA) jest używane jako nośnik, który stabilizuje i zachowuje zestawy Pr / Pb do długotrwałego przechowywania, podobnie jak suszenie odczynników dozowanych do płytek. Suszenie płytek zmniejsza również objętość reakcji niezbędnej do uzyskania powtarzalnych wyników, co z kolei pozwala zachować cenne próbki i zmniejszyć zużycie kosztownych odczynników. Na tych etapach montowane są partie płyt, które zapewniają precyzję i spójność przez ponad sześć miesięcy.

Po przygotowaniu płytek kluczowe znaczenie mają środki kontroli jakości, aby sprawdzić konsystencję partii płytek. W tym celu na płycie uruchamiane są dodatkowe cztery zestawy wzorców. Tablica "5x standard" śledzi wydajność i tworzy zestaw danych, z którym porównywane są standardy poszczególnych płyt. Podczas gdy podczas projektowania testu stosuje się dziesięć 10-krotnych rozcieńczeń każdego wzorca, względy przestrzenne wymagają, aby dla krzywej wzorcowej na każdej płytce testowej i dla płytki wzorcowej 5x były używane cztery punkty. Ponadto na każdej tabliczce powinna znajdować się kontrola dodatnia, aby zapewnić jej ważność.

Zazwyczaj przygotowanie sześciu płytek testowych z jednej płytki źródłowej Pr / Pb zajmuje 3-4 godziny; Możliwe jest przygotowanie dwunastu płytek w ciągu jednego dnia w laboratorium badawczym. Ponieważ każda ludzka płytka testowa podtypu IFN bada siedemnaście zestawów Pr / Pb i może pomieścić piętnaście próbek eksperymentalnych, jeden dzień montażu wytwarza partię płytek o zdolności do wygenerowania do 3,060 punktów danych eksperymentalnych. Surowe dane z platformy qRT-PCR mogą być przetwarzane i łączone za pomocą skryptów programistycznych w oprogramowaniu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych w celu automatycznego wypełnienia wstępnie zaprojektowanego szablonu analizy. Ta metoda minimalizuje ręczne wprowadzanie danych, zapobiegając w ten sposób błędom kopiowania i pozwala badaczowi skupić się na analizie danych, a nie na ich gromadzeniu. Jak opisano tutaj, ten wysokoprzepustowy test qRT-PCR może być stosowany do pomiaru ekspresji podtypów interferonu w próbkach makaków ludzkich lub rezusów i może być dostosowany do stosowania dla innych gatunków lub homologicznych zestawów genów. Elastyczność układu płytki pozwala użytkownikowi na zmianę zestawów starterów/sond w celu dostosowania interesujących genów do określonego typu komórki lub systemu modelowego. Test ten można zastosować do pomiaru sygnatur ekspresji IFN w modelach hodowli komórkowych badających patogeny lub w próbkach pacjentów w kontekście modeli chorób w celu wyjaśnienia mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VPM i RLR są współtwórcami technologii do pomiaru ekspresji podtypów IFN i IFN oraz uzyskiwania z niej dochodów z opłat licencyjnych. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez CBER/FDA-NIAID/NIH Interagency Agreement YI-AI-6153-01, fundusze wewnętrzne FDA/CBER oraz Inicjatywę Medycznych Środków Zaradczych FDA. TCT, MNB, VPM, LMS i KDK otrzymały wsparcie w postaci powołania do Programu Uczestnictwa w Badaniach w Centrum Oceny i Badań Biologicznych zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Amerykańską Agencją ds. Żywności i Leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Paski probówek do PCR 0,2 ml Eppendorf (Westbury, NY, USA)E0030 124 286
12-kanałowa pipeta elektroniczna 384 Equalizer, 0,5-12,5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-139*Wycofana
z produkcji 12-kanałowa pipeta elektroniczna 384 Equalizer, 1-30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-137*Wycofana
12-kanałowa pipeta elektroniczna, 5-250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-118*Wycofano
2,0 ml probówkę do mikrowirówek, sterylneCelltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)229446
8-kanałowa pipeta elektroniczna, 15-1250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-115*
Wycofane jednorazowe zbiorniki na odczynniki VWR International (Radnor, PA, Stany Zjednoczone)89094-668Zbiorniki 25 ml z 2 przegrodami
E-wirówkaWealtec Corp. (Sparks, NV, USA)1090003
Eukariotyczny 18S rRNA (18S)Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Hs99999901_s1Rhesus HKG Zestaw podkładów/sond
Mini Vortexer o stałej prędkościThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)02-215-360
Uszczelka samoprzylepna przepuszczająca gazThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)AB-0580Jednorazowa uszczelka płytowa stosowana podczas procesu przygotowania płyty 
Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GAPDH)FBR (Silver Spring, MD, USA)Zamówienie niestandardoweZestaw podkładów/sond Human HKG
Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GAPDH)Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Rh02621745_g1Zestaw podkładów/sond Rhesus HKG
Automatyczny pipeter wielokanałowy Hudson Solo Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)800200Zmodyfikowany z 384-dołkowym gniazdem chłodzącym
Linearyzowane plazmidy (geny IFN)Aldevron (Fargo, ND, USA)Na zamówienie3000, 3580; Używany do wzorców testowych 
Inhibitory LNAExiqon (Woburn, MA, USA)Na zamówienie500100
Sondy LNASigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)Zamówienie niestandardoweNumer materiału VC00023
Końcówki do pipet z filtrem matrycowym, 12.5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-193
Końcówki do pipet z filtrem matrycowym, 30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-196
Końcówki do pipet Matrix TallTip o przedłużonej długości, 1,250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-160
Końcówki do pipet Matrix TallTip o przedłużonej długości, 250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-152
MicroAmp Opyczna 384-dołkowa płytka reakcyjna z biosystemami stosowanymi za pomocą kodów kreskowych(Foster City, CA, USA)4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate AppliedBiosystems (Foster City, CA, USA)N8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4311971Folia samoprzylepna używana do uszczelniania płytki przed przebiegiem qRT-PCR 
Arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel 2010Microsoft (Redmond, WA, Stany Zjednoczone) Język programowania Office 2010Visual Basic 
MixMate Vortex MixerEppendorf (Westbury, NY, USA)5353 000.0142-wymiarowy aparat wirowy z płytką
Molekularne sondy ostrzegawczeFBR (Silver Spring, MD, USA)zamówienie
, bezlodowy system przechowywania w chłodni na 96-dołkowe płytki i probówki PCREppendorf (Westbury, NY, USA)Z606634-1EA
Suszarka płytkowa (kolektor)Produkcja projektów mechanicznych i elektrycznych, Biuro Usług Badawczych NIH (Bethesda, MD, USA)Zestawy
FBR (Silver Spring, MD, USA)Na zamówienie
pUC57 plazmidowe DNAGenescript (Piscataway, NJ, USA)SD1176
1,5 ml probówki do mikrofuge bez rnazyTechnologies (Grand Island, NY, USA)AM12400
DNaza wolna od RNaz Zestaw (50)Qiagen (Walencja, CA, USA)79254
RNase H NewEngland Biolabs (Ipswitch, MA, USA)M0297L
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen (Walencja, CA, USA)74106
Końcówki do robotów (wstępnie sterylizowane końcówki do pipet z przezroczystą końcówką)Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)800350-S
Roztwór DNA plemników łososiaInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)15632-011
SoftLinx Version VHudson Robotics (Springfield, NJ, USA)Oprogramowanie na zamówienie doprogramowania kroków pipetowania
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), bez AmpErase UNGLife Technologies (Grand Island, NY, USA)4352042
ABgene Adhesive Plate Seals   Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)AB0580
Ubiquitin C (UBC)Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Hs01871556_s1Human HKG Zestaw starterów/sond
Zestaw do syntezy Verso cDNAThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4453536
Water-Ultra Pure QualityBiological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)351-029-101
Zipvap 384 (element grzejny suszarki płytowej)Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)384-109A Suszarka płytowa
Chłodnica PCR na niestandardowe podkładów na zamówienie Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yan, N., Chen, Z. J. Intrinsic antiviral immunity. Nature. 13, 214-222 (2012).
  2. Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
  3. Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
  4. Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
  5. Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
  6. Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
  7. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
  8. Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
  9. Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
  10. Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
  11. Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
  12. Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
  13. Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
  14. Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
  15. Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
  16. Heathcote, J., Main, J. Treatment of hepatitis C. Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).
  17. Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
  18. Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
  19. Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
  20. Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
  21. Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
  22. Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
  23. Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
  24. Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
  25. Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
  26. Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933(2009).
  27. Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
  28. Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
  29. Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
  30. Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja podtyp w interferonusondy LNA Locked Nucleic Acidsondy Molecular Beaconformat p ytki 384 do kowejzautomatyzowane pipetowanie wielokana oweprotok suszenia p ytekanaliza interferon w typu Ianaliza interferon w typu IIIprofilowanie ekspresji gen w

Powiązane artykuły