Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

20K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52657

⸱

13 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Palo Alto Institute for Research and Education, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, 3Laboratory of Immunology and Vascular Biology, Department of Pathology, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę szczegółowej oceny podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza w modelu guza myszy. Komórki czerniaka B16 z ekspresją chemeryny wszczepiono podskórnie myszom syngenicznym. Komórki z mikrośrodowiska guza zostały następnie wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwoliło na szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów.

Streszczenie

Wyspecjalizowane komórki odpornościowe, które infiltrują mikrośrodowisko guza, regulują wzrost i przetrwanie nowotworów. Komórki nowotworowe muszą unikać lub obalać przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne, aby przetrwać i rozwijać się. Guzy wykorzystują wiele różnych mechanizmów "ucieczki" immunologicznej, w tym rekrutację tolerogennego DC, immunosupresyjnych regulatorowych limfocytów T (Treg) i komórek supresorowych pochodzenia szpikowego (MDSC), które hamują cytotoksyczne odpowiedzi przeciwnowotworowe. I odwrotnie, przeciwnowotworowe efektorowe komórki odpornościowe mogą spowolnić wzrost i ekspansję nowotworów złośliwych: immunostymulujące komórki dendrytyczne, komórki NK posiadające wrodzoną odporność przeciwnowotworową i cytotoksyczne limfocyty T mogą uczestniczyć w supresji guza. Równowaga między leukocytami pro- i przeciwnowotworowymi ostatecznie determinuje zachowanie i los transformowanych komórek; Potwierdziło to wiele badań klinicznych na ludziach. W związku z tym coraz ważniejsza staje się szczegółowa analiza podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza. W tym miejscu opisujemy metodę analizy naciekających podzbiorów leukocytów obecnych w mikrośrodowisku guza w mysim modelu guza. Mysie komórki nowotworowe czerniaka B16 inokulowano podskórnie myszom C57BL/6. W określonym czasie guzy i otaczająca je skóra zostały wycięte en bloc i przetworzone na zawiesiny jednokomórkowe, które następnie wybarwiono do wielokolorowej cytometrii przepływowej. Korzystając z różnych markerów podzbioru leukocytów, byliśmy w stanie porównać względne procenty naciekających podzbiorów leukocytów między guzami kontrolnymi i wykazującymi ekspresję chemeryny. Badacze mogą użyć takiego narzędzia do badania obecności immunologicznej w mikrośrodowisku guza, a w połączeniu z tradycyjnymi pomiarami wielkości suwmiarki wzrostu guza, potencjalnie pozwoli im wyjaśnić wpływ zmian w składzie immunologicznym na wzrost guza. Taką technikę można zastosować do dowolnego modelu guza, w którym guz i jego mikrośrodowisko mogą być wycięte i przetworzone.

Wprowadzenie

Równowaga między wzrostem i promocją guza a regresją jest częściowo zależna od równowagi pro- i anty-nowotworowych leukocytów naciekających obecne w mikrośrodowisku1,2. W celu zbadania mikrośrodowiska guza (TME) i specyficznej identyfikacji naciekających subpopulacji leukocytów, opracowaliśmy metodę oceny guzów podskórnych w mysim modelu guza. Znaczenie badania mikrośrodowiska guza jest dobrze znane i poparte w literaturze. Liczne badania wykazały, że równowaga pro- i przeciwnowotworowych naciekających komórek odpornościowych może wpływać na wyniki wzrostu guza, nie tylko w badaniach na myszach, ale także na ludziach (przegląd w3,4). Na przykład Curiel i wsp. wykazali, że pogorszenie wyników klinicznych u pacjentek z rakiem jajnika było skorelowane z obecnością rosnącego odsetka naciekających nowotwór regulatorowych limfocytów T CD4 + (Treg)5. Nasza własna praca wykazała również wpływ nowego chemoatraktantu leukocytów na stosunek podzbiorów leukocytów w mysim czerniaku model6, co również korelowało ze zmniejszonym wzrostem guza. W związku z tym szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów w obrębie guza są obecnie szerzej rozpoznawane i coraz ważniejsze.

Istnieje wiele sposobów oceny mikrośrodowiska guza pod kątem infiltracji leukocytów; na przykład grupy zaprojektowały transgeniczne myszy do ekspresji różnych białek fluorescencyjnych w celu zobrazowania TME7, klasycznej immunohistochemii i immunofluorescencji zachowanych sekcji8, w tym różnych metod obrazowania, takich jak MRI, PET, mikroskopia konfokalna9-11 - niektóre z możliwością monitorowania śródżyłowego10,12. Mogą być one stosowane z różnymi środkami do obrazowania molekularnego, takimi jak nanocząstki13 lub nowe środki kontrastowe14, które znakują komórki odpornościowe. Nasza metoda jest podejściem opartym na cytometrii przepływowej i ma kilka zalet. Po pierwsze, można pobrać próbki z całego mikrośrodowiska guza; W momencie analizy cały guz podskórny i otaczające go obrzeża są chirurgicznie wycinane w celu przetworzenia. Eliminuje to wszelkie potencjalne odchylenia w próbkowaniu w obrębie pojedynczego guza i daje bardziej "globalną" analizę guza jako całości. Po drugie, zastosowanie wielokolorowej cytometrii przepływowej do analizy podzbiorów leukocytów pozwala nam dokładniej ocenić fenotyp naciekających leukocytów. W zależności od liczby użytych kolorów można zidentyfikować bardzo konkretne podzbiory. Jest to ważne, ponieważ istnieje kilka podzbiorów leukocytów w obrębie określonego typu komórek - lub nawet w ogólnej klasyfikacji podtypów - które mają różne funkcje, które są potencjalnie istotne w określaniu losu guza. Na przykład plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) są zaangażowane w odporność przeciwnowotworową15. Wykazano jednak, że podzbiór pDC CCR9 + jest tolerogenny16, a przesunięcie równowagi takiego podzbioru może mieć wpływ na wzrost guza.

Nasza metoda jest odpowiednia dla guzów podskórnych lub innych, które mogą być wycięte en bloc. W naszych rękach guzy były jednolicie wycinane w czasie eutanazji. Można sobie jednak wyobrazić, jak to miało miejsce w niektórych badaniach, że guz podskórny mógłby zostać całkowicie wycięty z zamknięciem otaczającej skóry podczas operacji przeżycia17, co pozwala na dodatkową ocenę zwierzęcia. Następnie przeprowadza się analizę wyciętego guza. Tak więc wyniki reprezentują pojedynczy punkt czasowy w rozwoju guza. Chociaż pozwala to na szczegółowe spojrzenie w mikrośrodowisko, jest to również statyczny obraz tego, co bez wątpienia jest procesem dynamicznym. Jednak wyizolowane leukocyty (np. poprzez separację magnetyczną lub gradient gęstości) mogą być następnie analizowane oddzielnie od nabłonka guza i zrębu lub wykorzystywane w innych, funkcjonalnych testach w celu dalszego określenia ich fenotypu, jak opisano wcześniej18. Metoda ta byłaby zatem przydatna dla wszystkich badaczy zainteresowanych zrozumieniem składu leukocytów w mikrośrodowisku guza w danym punkcie czasowym, czy to w warunkach naturalnego przebiegu choroby, czy po określonych zaburzeniach terapeutycznych. Chociaż nie zostało to przez nas wykonane, warianty tej procedury mogą być również potencjalnie wykorzystane do analizy określonych części guza w izolacji. Na przykład, biorąc pod uwagę rozmiar guza, strefa obwodowa (strefy) może zostać wypreparowana z dala od centralnego, prawdopodobnie martwiczego rdzenia guza, aby dać badaczowi bardziej przestrzennie posegregowany obraz mikrośrodowiska guza.

W rozwijającej się dziedzinie immunologii nowotworów, bez wątpienia będzie wykładniczo rosła liczba badań oceniających nowe czynniki immunomodulujące w mysich modelach nowotworów. Kilka doniesień podkreśliło różnice w specyficznej funkcji leukocytów w obrębie guza w porównaniu ze środowiskiem obwodowym. Na przykład Shafer-Weaver i in. wykazali w modelu mysim, że specyficzne dla antygenu komórki efektorowe T CD8 +, choć aktywne na obrzeżach, zostały przekształcone w komórki supresorowe T CD8 + po przedostaniu się do mikrośrodowiska guza19. Było to częściowo spowodowane TGFβ, ale prawdopodobnie w grę wchodzą również inne czynniki. Tak więc ocena podzbiorów leukocytów – liczb i stosunków, a także statusu funkcjonalnego – w samym guzie zapewni dokładniejsze odwzorowanie wpływu określonej immunomodulacji na los guza.

Nasza technika pozwala na szczegółową analizę guza i daje badaczowi możliwość dokładniejszego zidentyfikowania zmian w populacjach leukocytów niż poprzednie podejścia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Stanford, Palo Alto VA HCS i National Institutes of Health Institutional AnimalCare and Use Committee.

1. Przygotowanie do pobierania i przetwarzania próbek (wymagany czas: ~10-15 min)

  1. Zaszczepić mysie komórki czerniaka B16F0 (0,5-1 x 106) podskórnie na lub w pobliżu linii środkowej brzucha u samic myszy C57BL / 6, jak opisano wcześniej6. Alternatywnie, inokulować komórki nowotworowe w dodatkowych miejscach anatomicznych (np. bok, poduszeczka tłuszczowa sutka itp.
    UWAGA: Dowolna liczba guzów (implantowanych lub samoistnych) może być używana i oceniana za pomocą tego protokołu. Na przykład inne powszechnie stosowane nowotwory syngeniczne w C57BL / 6 obejmują linię okrężnicy MC38, raka płuc Lewisa (LLC) i linię TRAMP-C2 prostaty. Chociaż ludzkie ksenoprzeszczepy zaszczepione myszom z niedoborem odporności mogą być również oceniane w ten sposób, należy zauważyć, że profile leukocytów naciekających nowotwór będą koniecznie zmieniane zgodnie ze stanem niedoboru odporności myszy gospodarza.
    1. Należy użyć kompletnych pożywek (np. RPMI zawierających 10% FBS i dodatków) lub innego odpowiedniego buforu zawierającego białko (np. HBSS lub PBS +1% FBS lub 1% BCS). Schłodzić pożywkę lub bufor do temperatury 4 °C przed eutanazją.
  2. Ustaw probówki i filtry do wyciętych guzów; umieść je na lodzie.
    1. Użyj jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml na guz, który ma zostać wycięty. Włóż filtr zawiesinowy komórek 40-70 μm do każdego z nich. Alternatywnie można użyć stożkowych probówek o pojemności 15 ml z metalową siatką filtracyjną. Użyj tłoka strzykawki o pojemności 5 ml lub grubego wstrzykiwacza, aby utworzyć filtr w kształcie miseczki na górze probówki o pojemności 15 ml.
  3. Przygotuj narzędzia do resekcji i leczenia guza; użyj kleszczy chirurgicznych i drobnych nożyczek do wycięcia i leczenia guzów. Użyj 70% etanolu do czyszczenia narzędzi między resekcjami/próbkami guza. W przypadku większej liczby próbek (np. >10) zalecamy jednoczesne przetwarzanie próbek przez wielu badaczy, aby uniknąć znacznych różnic w czasie przetwarzania między próbkami guza.

2. Resekcja guza (wymagany czas: ~5 min/guz)

  1. Eutanazja myszy z guzem B16 odbywa się indywidualnie przy użyciu dwutlenku węgla lub innej zatwierdzonej metody.
  2. Zabezpiecz mysz na etapie chirurgicznym. Spryskaj obszar guza 70% etanolem i zetrzyj nadmiar; Pomaga to zapobiegać rozprzestrzenianiu się obecnych włosów. W przypadku myszy nienagich należy ogolić obszar skóry wokół guza przed resekcją w razie potrzeby.
  3. Za pomocą kleszczy i nożyczek wyciąć guz podskórny en bloc, w tym skórę leżącą i otaczającą. Ilość pobranej skóry "marginesowej" może być różna, ale zazwyczaj należy wyciąć 2-3 mm skóry wokół guza.
    1. W tym momencie zważ wycięte guzy (+/- otaczające skórę). Umieść wycięty wycinek skóry/guza w filtrze zabezpieczonym w plastikowej stożkowej rurce.

3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki guza (wymagany czas: ~5-7 min/guz)

  1. Użyj kleszczy i nożyczek, aby zmielić guz i nadmiernie przylegającą/otaczającą skórę. Zmiel próbkę nożyczkami, aż wszystkie duże skrawki tkanki zostaną przetworzone na odcinki o średnicy 1-2 mm.
    UWAGA: Zazwyczaj przetwarzane są całe guzy; Alternatywnie, w przypadku większych guzów, reprezentatywne odcinki guzów można zmielić i przetworzyć.
  2. Za pomocą tłoka z jednorazowej strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml mechanicznie zdezagregować zmieloną tkankę nowotworową na zabezpieczonym filtrze.
  3. Za pomocą pipetora przemyj przetworzoną tkankę nowotworową 5-10 ml zimnej pożywki lub buforu. Spowoduje to przepłukanie pojedynczych komórek przez filtr.
  4. Powtórz powyższe dwa kroki kilka razy, upewniając się, że całkowita liczba i objętość popłuczyn jest w przybliżeniu taka sama dla guzów o podobnej wielkości.
    1. Po umyciu przetworzonej tkanki nowotworowej należy zaobserwować, że w filtrze należy pozostawić małe fragmenty skóry i/lub innej tkanki łącznej.
    2. Alternatywnie, w przypadku nowotworów, w których sama mechaniczna dezagregacja może nie być wystarczająca, przed procedurą mielenia można przeprowadzić trawienie za pomocą kolagenazy i/lub innych enzymów. Pozwoli to na dokładniejsze zawieszenie pojedynczych komórek. Należy jednak zauważyć, że takie protokoły trawienia mogą wpływać na powierzchniową ekspresję antygenu20, dlatego należy zachować ostrożność przy interpretacji tych wyników.
  5. Umyć i granulować komórki, dodając pożywkę/bufor i odwirowując w temperaturze 4 °C 500 x g przez 5 minut.

4. Barwienie FACS zawiesiny pojedynczej komórki (wymagany czas: ~30-60 min)

  1. Zawieś komórki w lodowatym buforze FACS (PBS + 1% FBS).
  2. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemacytometru lub automatycznego licznika komórek.
  3. Określ całkowitą wydajność żywotnych komórek na objętość. Dane te można wykorzystać do ekstrapolacji bezwzględnej liczby leukocytów naciekających nowotwór w połączeniu z danymi FACS.
  4. Określ liczbę komórek, które mają być barwione i analizowane przez FACS. Będzie na to miało wpływ kilka czynników (np. rodzaj histologii guza, wiek i wielkość guza, średni odsetek naciekających leukocytów itp.).
    UWAGA: W czerniaku B16 znaleźliśmy niski odsetek leukocytów naciekających nowotwór (TIL; zwykle <5%) w porównaniu z komórkami nowotworowymi. W związku z tym co najmniej 1 x 106 całkowitych komórek nowotworowych (guz + naciekające leukocyty) zwykle pobierano za pomocą FACS do analizy.
    1. Korzystając z danych zliczania barwionych trypanem, oblicz objętość komórek do barwienia dla FACS. Na przykład, jeśli TIL zazwyczaj stanowią 5% wszystkich komórek nowotworowych (wiele komórek nowotworowych będzie martwych po barwieniu trypanem), należy to uwzględnić w całkowitej liczbie zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych do barwienia.
    2. W przypadku mniej powszechnych podzbiorów leukocytów, np. CCR9 + pDC), należy użyć większej liczby całkowitych komórek nowotworowych (np. 2-3 x 106) do barwienia FACS, biorąc pod uwagę stosunkowo niską częstotliwość tych komórek w zawiesinie pojedynczej komórki.
  5. Wybarwić zawiesinę pojedynczej komórki guza na FACS.
    1. W przypadku dyskryminacji żywej / martwej można użyć trwałej plamy lub nietrwałej plamy (np. jodku propidyny). Jeśli komórki są barwione bez rozróżnienia na żywe/martwe, należy zachować ostrożność ze względu na możliwość niespecyficznego wiązania przeciwciał.
    2. Wybarwić zawiesinę komórek dla określonych podzbiorów leukocytów przy użyciu standardowego protokołu barwienia FACS. Blokuj komórki w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciał z PBS / FBS zawierającym 1% surowicę szczura i blok Fc (anty-CD16 / 32) przez 10 minut przed barwieniem przeciwciałami specyficznymi dla antygenu. Uwzględnij odpowiednie przeciwciała kontrolne izotypu, aby upewnić się, że barwienie jest specyficzne.
    3. W tym momencie, po zakończeniu barwienia FACS, utrwal próbki 4% formaldehydem lub innym podobnym środkiem utrwalającym. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności (aby uniknąć wygaszania fluoroforów) do czasu pobrania i analizy.
      UWAGA: Przechowywanie utrwalonych próbek przez długi czas może spowodować zmianę sygnału i intensywności fluoroforów21.
    4. Pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego. Optymalne ustawienia cytometru przepływowego będą się różnić w zależności od typu przyrządu i konfiguracji lasera/detektora.
      UWAGA: Ponadto mogą występować różnice między eksperymentami, nawet jeśli używasz tej samej maszyny. W związku z tym należy przeprowadzić odpowiednią konfigurację maszyny (np. za pomocą koralików kalibracyjnych), aby zapewnić odpowiednie ustawienie kompensacji przed pobraniem i analizą FACS każdego eksperymentu.
  6. Analiza podzbiorów leukoctye
    1. Korzystanie z oprogramowania do analizy danych FACS w celu analizy danych. W przypadku żywej/martwej plamy zacznij od bramkowania martwych komórek. Użyj przeciwciała przeciwko markerowi specyficznemu dla leukocytów (np. anty-CD45) w celu identyfikacji leukocytów w żywych komórkach.
      1. Następnie użyj różnych schematów bramkowania, aby zidentyfikować określone podzbiory, w zależności od protokołu barwienia. Na przykład, aby zidentyfikować limfocyty T CD4 +, wybierz regionlo SSC z populacji CD45 + i wybierz komórki CD19-CD3 +; z tego limfocyty T CD4 + można zidentyfikować22.
    2. Analizuj dane i prezentuj je na wiele różnych sposobów, aby zapewnić spójność i identyfikować wzorce lub trendy (np. używaj liczb całkowitych, procentów lub współczynników do ilościowego określania podzbiorów).
      UWAGA: Na przykład przyjrzeliśmy się całkowitej liczbie żywych komórek CD45 + jako procentowi wszystkich zebranych komórek nowotworowych (ryc. 1). Dodatkowo następnie obliczyliśmy procent każdego podzbioru leukocytów (np. Limfocyty T CD4 +) w guzie i porównaliśmy je jako proporcje między grupą kontrolną a grupą testową (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasze wyniki wykazały, że wymuszona nadekspresja chemeryny w mysich guzach B16 zwiększyła odsetek leukocytów naciekających guz (TILs). Ponadto zidentyfikowano zmiany w stosunku podgrup leukocytów obecnych w mikrośrodowisku guza powiązane z ekspresją chemeryny. Przedruk za zgodą Pachynski et al.6.

Rysunek 1 pokazuje, że w guzach wykazujących ekspresję chemeryny nastąpił istotny wzrost całkowitej liczby komórek CD45+ (TILs) w porównaniu z grupą kontrolną, co ok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przeprowadzenie szczegółowej analizy mikrośrodowiska guza ma kluczowe znaczenie dla określenia mechanizmów i skutków immunomodulacji. Wraz z rosnącą obecnością immunoterapeutyków w sferze klinicznej ludzi, zrozumienie wpływu tych środków na leukocyty naciekające guz staje się niezbędne do zdefiniowania ich mechanizmu działania. U ludzi często występują trudności kliniczne i/lub logistyczne w pozyskiwaniu i analizowaniu tkanki nowotworowej do analizy podzbioru leukocytów, a zatem często przeprowadza się analizę obwodowej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty R01-CA169354 i R01-047822 od National Institutes of Health oraz nagrodę za zasługi od Departamentu ds. Weteranów (ECB). RKP był wspierany przez NIH T32 CA009287-30A1, ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship oraz American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ był wspierany przez NIH grant AI079320. JM był wspierany przez stypendia z grantu szkoleniowego NIH T-32 T32-AI07290-25, T32-AI07290-24 oraz stypendium podoktorskiego American Cancer Society PF-12-052-01-CSM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMICellgro10-040http://cellgro.com; keep on ice
FBSCellgro35-011-CVhttp://cellgro.com
50 ml probówki stożkoweFalcon14-432-22fischersci.com
40 μ m filtrFalcon08-771-1fischersci.com
strzykawka 5 mlBD14-823-35fischersci.com
nożyczki/kleszcze chirurgiczneRobozRS-5910roboz.com
PBSCellgroMT-21-030-CMhttp://cellgro.com; keep on ice
trypan niebieskiHemacytometr fischersci.com CellgroMT-25-900-CI
Hausser Scientifice 02-671-54 fischersci.com
Żywa/martwa plamaLife TechnologiesL34957lieftechnologies.com
oprogramowanie FlowJoTreeStar, Incflowjo.com

Bibliografia

  1. Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  5. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  6. Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
  7. Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
  8. Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
  9. Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
  10. Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677(2013).
  11. Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
  12. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135(2013).
  13. Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
  14. Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034(2013).
  15. Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
  16. Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
  17. McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
  18. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952(2012).
  19. Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
  20. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  21. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
  22. Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94(2012).
  23. Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
  24. Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
  25. Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Leukocyty naciekaj ce guzanaliza cytometrycznakom rki czerniaka B16markery subpopulacji leukocyt wzawiesina pojedynczych kom rekwielobarwna cytometria przep ywowaanaliza mikro rodowiska guzaprofilowanie kom rek odporno ciowychguzy wykazuj ce ekspresj chemeryny
Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.