Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom. Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podobnie jak w przypadku zdrowych tkanek, wiele nowotworów krwi i litych jest obecnie uważanych za zorganizowane hierarchicznie, z podzbiorem komórek rakowych podobnych do macierzystych, które same się odnawiają, dając początek bardziej zróżnicowanemu potomstwu. Zrozumienie i ukierunkowanie tych nowotworowych komórek macierzystych w raku piersi, które mogą mieć zwiększoną oporność na chemo- i promieniowanie w porównaniu z masą guza innego niż macierzysty, stało się ważnym obszarem badawczym. Markery, w tym aktywność CD44, CD24 i ALDH, można ocenić za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu prospektywnego wyizolowania komórek, które wykazują zwiększoną rakotwórczość po wszczepieniu myszom z obniżoną odpornością: test mammosfery stał się również szeroko stosowany ze względu na jego zdolność do retrospektywnej identyfikacji komórek tworzących kule, które rozwijają się z klonów podobnych do pojedynczych komórek macierzystych. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do odpowiedniego hodowania mammosfer z linii komórkowych lub pierwotnych próbek pacjentów, ich pasażowania oraz obliczeń w celu oszacowania wydajności formowania kul (SFE). Najpierw omówimy kluczowe kwestie i pułapki związane z właściwym planowaniem i interpretacją eksperymentów z mammosferą.
Wprowadzenie
Istnienie linii komórek nowotworowych, na czele z komórkami macierzystymi podobnymi do nowotworów macierzystych, znacznie wzbogaciło nasze zrozumienie heterogeniczności nowotworów. Podczas gdy pewna różnorodność fenotypowa nowotworów wynika z klonalnego wyrastania genetycznie odrębnych klonów, istotny składnik wydaje się wynikać z różnic epigenetycznych: komórki rakowe mogą przechodzić (czasami odwracalnie) między stanami macierzystymi, progenitorowymi i zróżnicowanymi poprzez aktywację lub represję określonych programów ekspresji genów 1-3. Może to odzwierciedlać wewnętrzne lub zewnętrzne czynniki komórki, odzwierciedlające program ekspresji genów obecnie wyrażany w komórce z wynikającą z tego sygnalizacją autokrynną w połączeniu z sygnalizacją parakrynną z sąsiedniego raka, komórek zrębowych lub odpornościowych dostarczających czynniki modulujące oraz warunków mikrośrodowiskowych, takich jak stopień niedotlenienia2,4,5.
Chociaż innowacyjne metody śledzenia linii produkcyjnej zwiększają naszą zdolność do badania domniemanych komórek macierzystych raka w ich niszy in vivo 6-8, testy formowania kulek pozostają popularnym i wygodnym podejściem do szacowania potencjału komórek raka piersi do zachowywania się jak komórki macierzyste, przynajmniej w stosowanych warunkach testowych. Jest często stosowany wraz z retrospektywnymi metodami oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych, poprzez ekspresję markerów błonowych CD44 i CD249 oraz poziomów aktywności enzymu ALDH (dehydrogenazy aldehydowej)10, markerów, które zaproponowano jako odpowiadające odpowiednio bardziej mezenchymalnym i nabłonkowym komórkom macierzystym raka11. Podejście do tworzenia kuli zostało po raz pierwszy opracowane jako test neurosfery, umożliwiający wzrost przypuszczalnych komórek macierzystych z pojedynczych klonów w nieprzylegających warunkach wolnych od surowicy z dodatkiem nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF)12, a następnie z pożytkiem zastosowano je do normalnych i nowotworowych tkanek piersi.
Tożsamość komórki założycielskiej tworzącej sferę, oraz mieszane typy komórek tworzące masę kuli, są istotne dla wniosków, które można wyciągnąć z testów formowania mammo- lub innych sfer. Długotrwałe komórki macierzyste w stanie spoczynku, o których sądzi się, że spoczywają w fazie G0, nie doświadczą precyzyjnej kombinacji czynników, które sprzyjałyby aktywacji in vivo. Zamiast tego test mammosfery umożliwia wzrost komórek albo gotowych do podziału mitotycznego, albo już dzielących13. Te komórki progenitorowe, choć nie są naprawdę spokojne, mogą być etapem komórki, który proliferuje z mitogenami EGF i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) stosowanymi w teście. Niemniej jednak zawierają one szereg aktywowanych szlaków sygnałowych związanych z komórkami macierzystymi14. Ponadto szybkość ich powstawania odnosi się do rakotwórczości tkanki, z której zostały pobrane, mierzonej ich siłą działania w testach o ograniczonym rozcieńczeniu w ksenoprzeszczepach myszy2,15,16.
Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły izolowania pojedynczych komórek i generowania pierwotnych mammosfer zarówno z ludzkich linii komórkowych raka piersi, jak i klinicznych próbek guzów piersi. Opisujemy również, jak wykonywać seryjne przejścia pierwotnych mammosfer w celu oceny samoodnawiania się oraz jak obliczać wydajność formowania kul, która umożliwia porównanie między różnymi gęstościami wysiewu (patrz schemat na rysunku 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższe procedury zostały etycznie zatwierdzone przez Imperial College w Londynie.
1. Generowanie pierwotnych mammosfer z linii komórkowych ludzkiego raka piersi
UWAGA: Wykonaj następujące kroki pod sterylnym kapturem hodowlanym.
- Przygotować pożywkę Mammosphere zawierającą DMEM/F12 uzupełnioną o 2 mM L-glutaminę, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny. Przygotować kompletną pożywkę bezpośrednio przed użyciem, dodając 20 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinowany ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF; R&D Systems) oraz 1x suplement B27.
- Odessać pożywkę z kolby zawierającej przylegające komórki MCF-7 lub MDA-MB-231 (lub wybraną linię komórkową raka piersi; 70-80% konfluencji), przemyć dwukrotnie w 1x PBS i trypsynizować komórki.
- Odwirować komórki w temperaturze 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1-5 ml pożywki mammosferowej. Pipetować w górę i w dół, a w razie potrzeby użyć filtra siatkowego o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Użyj hemocytometru, aby upewnić się, że utworzyła się zawiesina pojedynczej komórki (jeśli nie, użyj igły 25 G, aby strzykawką zawiesinę komórek do 3 razy).
- W razie potrzeby wyizolować podzbiór komórkowy CD44 + CD24- za pomocą FACS przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-CD24-fikoerytryny (PE) i izotiocyjanianu anty-CD44-fluoresceiny (FITC)9. Alternatywnie, wyizoluj taką populację za pomocą systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) z mikrogranulkami połączonymi anty-CD44 i anty-CD24-biotyną zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadź selekcję pozytywną za pomocą kolumn LS i selekcję negatywną za pomocą kolumn LD i potwierdź fenotypy wszystkich izolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej17.
- Oblicz liczbę żywotnych komórek na ml za pomocą błękitu trypanowego.
UWAGA: Żywotność komórek oblicza się jako liczbę żywotnych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę komórek w siatkach na hemocytometrze. Komórki, które pobierają błękit trypanowy, są uważane za niezdolne do życia. Poniższa procedura służy do dokładnego określenia proporcji żywotnych komórek.- Przygotować 0,4% roztwór błękitu trypanowego w PBS. Dodać 0,1 ml roztworu podstawowego błękitu trypanowego do 1 ml komórek. Załaduj hemocytometr i zbadaj natychmiast pod mikroskopem w małym powiększeniu. Policz łączną liczbę komórek i liczbę niebieskich komórek barwiących.
Żywe komórki = [1.00 – (Liczba niebieskich komórek ÷ Liczba wszystkich komórek)] × 100. - Aby obliczyć liczbę żywotnych komórek na ml hodowli, skorzystaj z poniższego wzoru. Należy pamiętać o skorygowaniu współczynnika rozcieńczenia.
Liczba komórek zdolnych do życia × 104 × 1,1 = komórki/ml hodowli
- Przygotować 0,4% roztwór błękitu trypanowego w PBS. Dodać 0,1 ml roztworu podstawowego błękitu trypanowego do 1 ml komórek. Załaduj hemocytometr i zbadaj natychmiast pod mikroskopem w małym powiększeniu. Policz łączną liczbę komórek i liczbę niebieskich komórek barwiących.
- Ponownie zawiesić wcześniej określoną ilość komórek w 2 ml kompletnej pożywki mammosfery w każdym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności. Gęstość wysiewu wynosi zwykle 500-4,000 komórek/cm2 komórki na studzienkę. Opcjonalnie należy użyć 24-dołkowych płytek o niskim natężeniu podczas wysiewu komórek o tej samej gęstości w 0,5 ml pożywki.
UWAGA: Zalecamy optymalizację gęstości wysiewu i czasu hodowli dla każdej interesującej nas linii komórkowej. - Inkubować 6-dołkowe płytki o bardzo niskim przyczepie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5-10 dni (w zależności od linii komórkowej i wielkości mammosfery) bez naruszania płytek, szczególnie w fazie wzrostu pierwszych 5 dni.
2. Generowanie pierwotnych mammosfer z próbek klinicznych ludzkiego raka piersi
UWAGA: Ludzka tkanka raka piersi może być pobrana od pacjentek poddawanych operacji usunięcia guzów piersi. Przechowywać tkankę na lodzie do 24 godzin w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml w pożywkach hodowlanych zawierających 100 j./ml penicyliny i 100 j./ml streptomycyny. Wykonaj następujące czynności pod sterylnym kapturem hodowlanym.
- Przenieść próbkę na 100-milimetrową szalkę Petriego z tkanką o małej objętości podłoża. Usuń tkankę tłuszczową za pomocą sterylnych nożyczek, skwinu i pęsety.
- Dodać 2-3 ml DMEM/F12 i zmielić próbkę na1 mm 3 kawałki za pomocą sterylnego skletu lub żyletki, aż nie pozostaną żadne duże kawałki.
- Zawiesić fragmenty tkanek we wstępnie podgrzanym 10 ml DMEM zawierającym enzymy proteolityczne (3 000 U/ml kolagenazy i 1 000 U/ml hialuronidazy) i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce obrotowej, aż wszystkie fragmenty tkanki zostaną strawione. Zazwyczaj całkowite trawienie trwa od 1 do 3 godzin. Dostosuj czas trawienia do patologicznych cech nowotworów. (Na przykład gruczolakorak piersi jest zwykle trudniejszy do strawienia w porównaniu z rakiem śluzowym, który jest bardziej kruchy i wymaga krótszego czasu trawienia). Oceniaj stopień trawienia co 1/2 godziny, obserwując 20 μl zawiesiny pod hemocytometrem.
- Pozostawić fragmenty do osadzenia się na 5 minut, następnie przenieść supernatant do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1-5 ml pożywki mammosferowej.
- Postępuj zgodnie z krokami 1.1-1.4 opisanymi powyżej, aby linie komórkowe otrzymały i pokryły zawiesiny pojedynczych komórek. Przepuścić komórki przez strzykawkę 25 G maksymalnie 2 razy, jeśli to konieczne, aby ograniczyć uszkodzenia komórek.
3. Obliczanie wydajności formowania mammosfery (%)
- Po okresie hodowli policz średnicę mammosfer (większych niż 40 μm) pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu. Zobrazuj cyfrowo 5 losowych pól za pomocą kamery cyfrowej na mikroskopie świetlnym i określ rozmiar mammosfery za pomocą oprogramowania do akwizycji. Użyj dowolnego oprogramowania do analizy obrazu.
- Obliczać Wydajność formowania mammosfery (MFE%) za pomocą następującego równania:
MFE (%) = (# komórek zasianych na studzienkę) / (# komórek zasianych na studzienkę) x 100
4. Seryjne przechodzenie mammosfer do oceny samoodnawiania
- Odpipetować pożywkę zawierającą mammosfery z każdej studzienki do probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienki PBS i dodaj do zebranej pożywki. Wirować przy 115 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl wstępnie podgrzanego 0,5% trypsyny/0,2% EDTA. Inkubować przez 2-3 minuty.
- Dodaj 500 μl FCS, aby zneutralizować trypsynę. Wirować przy 500 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl pożywki mammosfery, pipetując w górę i w dół do zdezagregowanych kulek.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ, czy komórki są w zawiesinie pojedynczej komórki. Jeśli nie, należy przepuścić przez strzykawkę 25 G do 3 razy, aby uzyskać pojedyncze komórki. Wysiewaj komórki na nową, 6-dołkową płytkę o bardzo niskim przyczepie o tej samej gęstości, co w pokoleniu pierwotnym.
- Po 5-10 dniach policz kule >40 μm i oblicz wydajność formowania kuli, korzystając ze wzoru podanego wcześniej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Różne próbki lub próbki poddane różnym działaniom mogą różnić się liczbą mammosfer o średnicy >40 µm, które powstają po normalizacji względem początkowej liczby wysianych komórek. Oblicz efektywność tworzenia mammosfer (MFE) dla każdej grupy traktowanej, hodując je w trzech powtórzeniach. Pozwala to na porównanie eksperymentów o różnych gęstościach wysiewu. Dane najlepiej przedstawić na wykresie słupkowym, najlepiej z kontrolami pozytywną i negatywną, z zaznaczeniem odchylenia standardowego dla trzech powtórzeń. Komór...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Skuteczna ocena mammosfer pierwotnych i wtórnych opiera się na posiewaniu komórek w wystarczająco niskiej gęstości, aby mammosfery tworzyły się z pojedynczych klonów, przy minimalnej agregacji sfer. Jednak przy zbyt niskich gęstościach może powstać zbyt mało mammosfer, aby statystycznie odróżnić efekty leczenia. Gęstość wysiewu powinna być zoptymalizowana dla każdej użytej linii komórkowej, ponieważ mogą się one znacznie różnić pod względem wydajności tworzenia sfery (te wykazujące niską ekspresję E-kadheryny mogą tworzy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów, który mógłby być postrzegany jako przesądzający o bezstronności tego artykułu.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez Imperial BRC, National Institute for Health Research i Action Against Cancer, ze szczególnym uwzględnieniem Hilary Craft i Sir Douglasa Myersa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamina | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicylina & Streptomycyna | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Rekombinowany ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) | R& Systemy D | 233-FB-025 | |
| 1x suplement B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0,5% trypsyna/0,2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Surowica cielęca płodu | First Link UK | 02-00-850 | |
| Błękit trypanowy | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Płytki 6-dołkowe o niskim nasadce | Corning | CLS3814 | |
| Kolagenaza typ 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hialuronidaza | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterylne żyletki | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterylny skalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterylne mikropreparowanie nożyczki | Sigma Aldrich | S3146 |
Bibliografia
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209(2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281(2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
