Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar HPLC biomarkera utleniania DNA, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych

26.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52697

⸱

1 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest wykrycie markera utleniania DNA, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxo-dGuo) przez HPLC-ED, w DNA z hodowanych komórek lub tkanek zwierzęcych.

Streszczenie

Stres oksydacyjny jest związany z wieloma procesami fizjologicznymi i patologicznymi, a także metabolizmem ksenobiotyków, co prowadzi do utleniania biomakromolekuł, w tym DNA. Dlatego skuteczne wykrywanie utleniania DNA jest ważne dla różnych dyscyplin badawczych, w tym medycyny i toksykologii. Powszechnym biomarkerem DNA uszkodzonego oksydacyjnie jest 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-okso-dGuo; często błędnie określana jako 8-hydroksy-2'-deoksyguanozyna (8-OH-dGuo lub 8-oxo-dG)). Opisano kilka protokołów pomiaru 8-oxo-dGuo metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ED). Stosowano je jednak głównie do oczyszczonego DNA poddanego działaniu prooksydantów. Ponadto, ze względu na różnice metodologiczne między laboratoriami, głównie wynikające z różnic w sprzęcie analitycznym, przyjęcie opublikowanych metod wykrywania 8-oxo-dGuo za pomocą HPLC-ED wymaga starannej optymalizacji przez każde laboratorium. Brakuje kompleksowego protokołu, opisującego taki proces optymalizacji. Tutaj opisano szczegółowy protokół wykrywania 8-oxo-dGuo za pomocą HPLC-ED, w DNA z hodowanych komórek lub tkanek zwierzęcych. Ilustruje on, w jaki sposób można łatwo i szybko zoptymalizować przygotowanie próbki DNA, aby zminimalizować niepożądane utlenianie DNA, które może wystąpić podczas przygotowywania próbki. Protokół ten pokazuje, jak wykryć 8-oxo-dGuo w hodowanych ludzkich komórkach gruczolakoraka pęcherzyków płucnych (tj. komórkach A549) traktowanych środkiem utleniającym KBrO3 oraz w śledzionie myszy narażonych na wielopierścieniowy węglowodór aromatyczny dibenzo(def,p)chryzen (DBC, wcześniej znany jako dibenzo(a,l)piren, DalP). Ogólnie rzecz biorąc, praca ta ilustruje, w jaki sposób metodologia HPLC-ED może być łatwo zoptymalizowana pod kątem wykrywania 8-oxo-dGuo w próbkach biologicznych.

Wprowadzenie

Reaktywne formy tlenu (ROS), których poziom w stanie stacjonarnym może wzrastać podczas wielu stanów patologicznych i ksenotoksycznego metabolizmu, przyczyniają się do zwiększonej częstotliwości uszkodzeń oksydacyjnych DNA. Wśród kilku możliwych produktów utleniania zasad nukleotydowych, oksydacyjne uszkodzenie DNA można łatwo zmierzyć za pomocą stabilnego markera 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-okso-dGuo), który jest jedną z utlenionych form 2'-deoksyguanozyny (dGuo)1. 8-oxo-dGuo jest najliczniejszą zmianą DNA2 i dlatego została zbadana bardziej szczegółowo jako biomarker utleniania DNA, pomimo istnienia wielu produktów utleniania DNA 3. U ludzi uszkodzenie to można naprawić poprzez naprawę przez wycięcie zasady przez glikozylazę 8-oksoguaninową 1 (hOGG1)4. Jeśli nie zostanie naprawiony, 8-oxo-dGuo może przyczyniać się do powstawania mutacji substytucji par zasad (tj. transwersji G do T)4. Co ważne, 8-oxo-dGuo jest uznanym markerem uszkodzenia DNA w odniesieniu do inicjacji i promocji kancerogenezy2. Dlatego dokładna kwantyfikacja 8-oxo-dGuo jest użytecznym i pożądanym biomarkerem oksydacyjnego uszkodzenia DNA5.

W literaturze panuje powszechne zamieszanie co do prawidłowych nazw dla uszkodzonych oksydacyjnie form 2-deoksyguanozyny, a ponadto poprawnej nazwy związku (związków) rutynowo mierzonego jako biomarker oksydacyjnego uszkodzenia DNA6. 6,8-diketo i 6-enol,8-keto tautomeryczne formy 8-oxo-dGuo (pokazane na rysunku 1) są dwoma najważniejszymi tautomerami omawianymi w literaturze5,7. Forma 6,8-diketo jest najbardziej znaną formą o fizjologicznym pH 7,4 i jest najbardziej widocznym produktem utleniania DNA7. Dlatego 8-oxo-dGuo, a nie 8-hydroksy-dGuo, jest najbardziej odpowiednią nazwą dla tego produktu utleniania6. Ważne jest również, aby zauważyć, że 2-deoksyguanozyna (dGuo), a nie guanina nukleotydowa (Gua) lub guanozyna rybonukleozydowa (Guo), odpowiednio, jest wykrywana przez większość metod6.

Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe 8-oxo-dGuo jest wyzwaniem ze względu na: i) zmienność trawienia próbki DNA, ii) przypadkowe utlenianie dGuo do 8-oxo-dGuo, które może wystąpić podczas przygotowywania próbki, oraz iii) potrzebę skutecznej walidacji analitycznej metody HPLC-ED8. W tym protokole dążyliśmy do osiągnięcia i) poprzez zapewnienie warunków sprzyjających całkowitemu trawieniu DNA oraz ii) poprzez włączenie chelatora metalu i roztworów traktowanych chelatorem oraz specjalnego odczynnika izolującego DNA, podczas gdy iii) tylko częściowo rozwiązano problem poprzez włączenie kontroli pozytywnych, a tym samym zapewnienie, że metoda jest w stanie wykryć 8-oxo-dGuo w próbkach biologicznych. Dalsza walidacja wykracza poza zakres tego dokumentu. Jesteśmy jednak przekonani, że protokół ten pomoże potencjalnym użytkownikom określić zakres, w jakim muszą formalnie zweryfikować protokół, w zależności od ich celów. Wykaz kroków wymaganych do formalnej walidacji metody znajduje się w dalszej części. W trakcie opracowywania i wdrażania metody wykrywania 8-oxo-dGuo dokonano przeglądu i konsolidacji opublikowanych metod. W związku z tym metoda ta eliminuje potrzebę zbierania informacji z kilku opublikowanych źródeł, w których często brakuje ważnych szczegółów eksperymentalnych, a jednocześnie zapewnia szybkie i proste środki testowania, jeśli metoda wykrywania i oznaczania ilościowego 8-oxo-dGuo została przyjęta z powodzeniem. Ta zaadaptowana metoda została wykorzystana do pomyślnej analizy próbek DNA z hodowanych komórek i tkanek mysich. Ten artykuł wideo pomoże innym grupom w ustaleniu skutecznej metody wiarygodnego wykrywania i oznaczania ilościowego 8-oxo-dGuo za pomocą HPLC-ED.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Upewnij się, że cała hodowla zwierząt, trzymanie, obchodzenie się z nimi i eksperymentowanie są zgodne z lokalnymi zasadami i przepisami oraz że protokoły eksperymentów są zatwierdzone przed rozpoczęciem jakichkolwiek badań. W opisanych eksperymentach opieka, obchodzenie się i leczenie zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Health Canada. Zapoznaj się z "Tabelą odczynników", aby uzyskać informacje o dostawcach.

1. Pobieranie próbek biologicznych

  1. Komórki lub tkanki zwierzęce
    1. Hodować ludzkie komórki gruczolakoraka pęcherzyków płucnych A549 w pożywce F12-K zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
    2. Komórki nasienne w ilości około 1 miliona komórek na 10-centymetrową płytkę. W każdym eksperymencie należy użyć zestawu łącznie 12 płytek (trzy płytki na jedną kontrpróbę biologiczną x cztery dawki), aby zapewnić wystarczającą ilość DNA (80 μg) do trawienia enzymatycznego i analizy HPLC.
    3. Gdy gęstość komórek staje się większa niż około 70% powierzchni płytki, usuń pożywkę i umyj komórki dwukrotnie 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4.
    4. W przypadku hodowanych komórek zwierzęcych należy użyć KBrO3 jako kontroli pozytywnej.
      UWAGA: W literaturze opisano dodatnią liniową zależność między stężeniem KBrO3 a częstością występowania 8-okso-dGuo9.
    5. Rozpuścić KBrO3 w PBS. Upewnij się, że końcowe stężenie w pożywce do hodowli komórkowej jest większe niż 1 mM, aby uzyskać statystycznie istotny wzrost 8-okso-dGuo w stosunku do komórek nienarażonych. Dodać takie samo stężenie KBrO3 do każdej płytki z serii (np. 12 płytek 10-cm).
    6. Inkubować płytki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Wyjąć podłoże i przemyć je raz PBS.
    7. Dodać 1 ml roztworu trypsyny (stężenie podstawowe 2,5 g/ml) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
    8. Przemyć 4 ml PBS, zebrać komórki z każdego zestawu do jednej stożkowej probówki wirówkowej z polistyrenu o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Usunąć PBS i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy. Sztuczne utlenianie DNA może być dodatkowo zminimalizowane przez izolację jądrową, jak opisano w innym miejscu10.
  2. Chusteczki higieniczne
    1. Dozować zwierzętom zgodnie z wymaganiami. W ramach tego protokołu dorośli (w wieku 9 tygodni) leczą samców myszy Muta przez zgłębnik doustny codziennie przez trzy kolejne dni z 20 mg DBC/kg masy ciała dziennie rozpuszczonej w oliwie z oliwek.
      UWAGA: To transgeniczne zwierzę zawiera zmodyfikowany λ-bakteriofag i gen reporterowy mutacji lacZ z E. coli11 jest używany do testów mutacji transgenicznych gryzoni12.
    2. Przeprowadzić sekcję zwłok na zwierzętach, np. znieczulić myszy za pomocą izofluranu, a następnie poddać eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie otwarcie jamy klatki piersiowej. Natychmiast błyskawicznie zamroź tkanki w ciekłym azocie. Przechowywać tkanki w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
      UWAGA: Czas eutanazji po leczeniu może być kolejną ważną zmienną (na przykład utlenianie DNA było maksymalne po 72 godzinach od ekspozycji na hałas w mózgu i wątrobie szczura13).

2. Ekstrakcja DNA, wytrącanie i płukanie (dla tkanek przejdź bezpośrednio do 2.2)

  1. Homogenizować zebrane komórki w stożkowej probówce wirówkowej z polistyrenu o pojemności 50 ml z 1 ml środka izolującego DNA, takiego jak DNAzol. Użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby rozproszyć osad komórkowy, aż roztwór będzie jednorodny. Przenieść homogenat do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować na lodzie przez 10-20 min. Przejdź do punktu 2.3.
  2. Homogenizować 15-20 mg tkanki w ręcznym homogenizatorze ze szkła nieprzywierającego o pojemności 1 ml zawierającym 500 μl środka izolującego DNA. Delikatnie podnieś i opuść homogenizator przez około 1 minutę; Bardziej miękkie tkanki będą wymagały mniej czasu. Delikatna obróbka zapewnia mniejsze ścinanie DNA. Przechowuj homogenat na lodzie przez około 10-20 minut.
  3. Osadzać homogenat przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i w temperaturze 4 °C w stożkowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  4. Ostrożnie przenieść powstały supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć kontaktu z osadem.
  5. Wytrącić DNA z homogenatu, dodając 0,5 ml 100% EtOH na 1 ml homogenatu. Odwróć probówki 10 razy, aby upewnić się, że odczynnik izolujący i EtOH są wystarczająco wymieszane.
  6. W tym momencie osad DNA jest lepki, należy go nawinąć na plastikową końcówkę pipety (np. o maksymalnej pojemności 200 μl), a następnie przenieść do nowej stożkowej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Można zastosować szybkie wirowanie w celu usunięcia pozostałego lizatu z wyizolowanego DNA.
    (Mycie DNA i solubilizacja)
  7. Dodać 1 ml 75% EtOH do wyizolowanego DNA. Dokładnie zawieś osad DNA, odwracając probówki 10 razy.
  8. Ostrożnie zdekantować etanol z probówki. Upewnij się, że osadek DNA przylega do boku probówki. Przechowuj probówki pionowo przez 1-2 minuty i użyj pipety, aby usunąć nadmiar EtOH z dna probówki.
  9. Powtórzyć płukanie DNA jeszcze raz i albo przechowywać próbkę w EtOH w temperaturze -20 °C (stabilnej przez kilka miesięcy), albo natychmiast przystąpić do trawienia.
  10. Rozpuścić DNA w buforze do wytrawiania (opisanym poniżej), a następnie określić ilościowo przy użyciu standardowych metod spektroskopowych (tj. absorbancji przy 260 nm przy użyciu spektrofotometru NanoDrop).

3. Trawienie enzymatyczne

  1. Przygotować "bufor do wytrawiania" przez połączenie odpowiednich objętości (w zależności od liczby próbek do roztrawienia) 50 mM monozasadowego fosforanu Na (zawierającego 2,0 mM KCl, 1,0 mM desferalu (DFO) i 200 mM MgCl2) z 50 mM dwuzasadowym fosforanem Na (zawierającym również 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO i 200 mM MgCl2). Każda próbka wymaga 4,0 μl jednozasadowego i 17,0 μl dwuzasadowego roztworu fosforanu.
  2. Usuń resztki EtOH z dna probówki i susz próbki na powietrzu przez około 5 minut. Upewnij się, że DNA nie wyschnie całkowicie.
  3. Rozpuścić 80 μg wyekstrahowanego DNA w 21,0 μl buforu wytrawiającego, dodać 1 jednostkę DNazy I rozpuszczonej w 2,0 μl buforu wytrawiającego.
  4. Lekko zmieszać w celu uzyskania dokładnego wymieszania i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Pod koniec okresu inkubacji dodać 216,4 μl dwuzasadowego roztworu fosforanu 50 mM Na zawierającego 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO i 200 mM MgCl2.
  6. Przygotować "bufor wytrawiający 2" łącząc jedną objętość buforu wytrawiającego z dziewięcioma objętościami dwuzasadowego 50 mM fosforanu Na (z 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO i 200 mM MgCl2).
  7. Dodać 0,025 jednostki enzymu fosfodiesterazy (PDE) I w 16,3 μl buforu wytrawiającego-2. Pipetować w górę i w dół przez kilka sekund, a następnie lekko wirować, aby uzyskać dokładne wymieszanie i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
  8. Dodać 0,4 jednostki fosfatazy alkalicznej (AP) do 8,0 μl buforu wytrawiającego-2. Pipetować w górę i w dół przez kilka sekund, następnie lekko wirować, aby uzyskać dokładne wymieszanie i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać 33,0 μl MeOH klasy HPLC.
  9. Przeprowadź strawione próbki DNA na HPLC, jak opisano poniżej, natychmiast lub przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia, aby zminimalizować utlenianie. UWAGA: Sugerowane tutaj 1,5-godzinne etapy trawienia są oparte na takich odstępach sugerowanych gdzie indziej9 oraz na ustaleniach, że podobne protokoły osiągają pełne trawienie DNA9. W związku z tym założono, że jedynym czynnikiem ograniczającym osiągnięcie całkowitego trawienia jest czas, a hamowanie enzymów i niejednorodność próbki są nieistotne.

4. Przebieg HPLC: Przygotowanie fazy mobilnej, konfiguracja i konserwacja oprzyrządowania

  1. Do przygotowania wszystkich roztworów buforowych należy użyć ultraczystej wody i potraktować je żywicą o wysokiej sile wiązania (np. Chelex 100: kopolimer styrenu diwinylobenzenu z jonami iminodioctanu, które chelatują metale przejściowe o wysokim powinowactwie), aby zminimalizować zanieczyszczenie metalami i utlenianie DNA podczas przygotowywania próbki.
  2. Przygotować 250 mM buforu fosforanowego Na, pH 6,2. Stosować stosunek 1 : 3,6957 dwuzasadowego fosforanu sodu (FW = 177,99 g/mol) do jednozasadowego fosforanu sodu (FW = 119,98 g/mol).
    Przykład: Dlatego dla 3 l roztworu podstawowego połączyć 70,81 g monobasic i 28,43 g proszku dwuzasadowego, dodać wodę do np. 2,8 l i sprawdzić, czy pH roztworu wynosi 6,2. Dostosować pH za pomocą 250 mM mono- lub dwuzasadowych roztworów fosforanu sodu, przygotowanych oddzielnie, a nie za pomocą stężonych kwasów lub zasad. Dodać 2,24 g KCl, aby uzyskać stężenie 10 mM KCl.
  3. Przygotować fazę ruchomą w trzech butelkach, o pojemności co najmniej 1 l każda, zawierających: rozpuszczalnik B – metanol klasy HPLC, rozpuszczalnik – woda ultraczysta B i rozpuszczalnik C – bufor fosforanowy z kroku 4.2. Włóż rurkę doprowadzającą fazę ruchomą HPLC do butelek; Pozostałe probówki należy również zanurzyć w jednej z butelek (np. roztwór C) i zalać, nawet jeśli nie są potrzebne do mieszania.
  4. Podczas cyklu należy wymieszać roztwory fazy ruchomej jako 6% rozpuszczalnika A, 74% rozpuszczalnika B i 20% rozpuszczalnika C, aby uzyskać końcowy roztwór 50 mM buforu fosforanu sodu (pH 6,2) z 2,0 mM KCl i 6% MeOH.
  5. Odłączyć elektrodę od detektora elektrochemicznego, zdemontować ją i wyczyścić elektrody odniesienia i robocze roztworami do czyszczenia elektrod i tarczami polerskimi zalecanymi przez producenta. Oczyszczone powierzchnie spłucz ultraczystą wodą, delikatnie wytrzyj wodę i upewnij się, że detektor jest suchy przed włączeniem systemu.
  6. Ponownie zmontuj detektor i podłącz wlot fazy ruchomej do elektrody. Włącz przepływ i pozwól, aby faza ruchoma wypełniła elektrodę przed podłączeniem rurki fazy ruchomej wylotowej. Zainstaluj nową kolumnę przed rozpoczęciem optymalizacji. Upewnij się, że instalacja odbywa się we właściwym kierunku i jest zgodna ze wszystkimi zaleceniami producenta.
  7. Włącz oprzyrządowanie HLPC na długo przed (np. 1 godziną) analiz próbek, aby umożliwić równowagę i zmniejszyć szum linii podstawowej. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sugerowanymi ustawieniami; Limit ciśnienia wstecznego powinien być ustawiony na 3,000 psi, aby uniknąć uszkodzenia kolumny. Włącz odgazowywacz. Kontynuuj zalewanie pomp i ustawianie gradientu rozpuszczalnika.
  8. Zalać pompy na sucho zgodnie z instrukcjami producenta. Zrób to, aby zwilżyć przewody, gdy wymieniona została faza ruchoma lub wlot rurki jest wystawiony na działanie powietrza.
  9. Zlokalizuj krążek zasysający i włóż do niego plastikową strzykawkę o pojemności 10-15 ml. Upewnij się, że strzykawka jest całkowicie włożona przed otwarciem linii. Aby otworzyć przewody, wystarczy obrócić tarczę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o jeden obrót.
  10. Rozpocznij prime z odpowiednim wyborem interfejsu HPLC. Delikatnie pociągnąć strzykawkę, aby pobrać płyn do przewodów. Gdy płyn przepływa, liczba pierwsza jest kompletna; Poczekaj, aż program zakończy przebieg. Powtórz dla wszystkich linii (zwykle czterech, w zależności od instrumentu).
  11. Alternatywnie, zagruntować na mokro, gdy linie są już zwilżone wcześniejszym suchym gruntem (patrz poniżej).
    UWAGA: Gdy między użyciami upłynęło dużo czasu (np. 2 tygodnie lub dłużej), zaleca się suche przygotowanie gruntu.
  12. Zmienić skład składników rozpuszczalnika fazy ruchomej na 25% każdy za pomocą interfejsu użytkownika HPLC. Z interfejsu wybierz opcję "Funkcja bezpośrednia", a następnie wybierz opcję "Wet Prime". Spowoduje to zagruntowanie wszystkich linii w tym samym czasie.
  13. Upewnij się, że całe powietrze zostało usunięte z systemu, obserwując mokrą linię zalewu, gdy wchodzi do pojemnika na odpady. Po dobrym zagruntowaniu upewnij się, że w linii nie pozostały żadne bąbelki. Jeśli bąbelki utrzymują się, powtórz gruntowanie.
  14. Po zalaniu pompy rozpocznij przesuwanie fazy ruchomej HPLC. Użyj interfejsu HPLC, aby ręcznie zmienić skład fazy ruchomej na 6% metanolu (rozpuszczalnik A) i 94% wody (rozpuszczalnik B) i wybrać natężenie przepływu 0,9 ml/min. Odczekaj 5 minut, aby usunąć metanol z etapu czyszczenia kolumny.
  15. Po 5 minutach zmień skład na 6% metanolu (rozpuszczalnik A), 74% wody (rozpuszczalnik B), 20% bufor (rozpuszczalnik C), zwiększ natężenie przepływu do 1,0 ml/min. Ustaw inne parametry zgodnie z podsumowaniem w tabeli 1 i ustaw limit ciśnienia wstecznego na 3,000 psi, aby uniknąć uszkodzenia kolumny.
    UWAGA: Potencjalne problemy z konfiguracją HPLC obejmują dryfującą linię bazową, podzielony szczyt i zmniejszoną intensywność sygnału. Można je zwykle przezwyciężyć poprzez czyszczenie kolumny po każdym użyciu, częste czyszczenie elektrod i upewnienie się, że roztwory buforowe są wolne od zanieczyszczeń (np. cząstek stałych lub rozwoju mikroorganizmów).
  16. Uruchom fazę mobilną na około 1-1,5 godziny, aby uzyskać stabilny sygnał podstawowy.
  17. Korzystając z interfejsu oprogramowania przyrządu, wybierz parametry zgodnie z tabelą 1 i ustaw czas pracy na 15 minut. Wstrzyknąć próbkę. Należy wydłużyć czas pracy dla złożonych próbek (określić to empirycznie, obserwując obecność lub brak pików powyżej 15-minutowego interwału).
    UWAGA: Oprogramowanie urządzenia umożliwia programowanie warunków pracy próbki i ustawianie automatycznego próbkowania.
  18. Po zakończeniu przebiegów wyłącz komórkę detektora za pomocą interfejsu detektora. Ważne jest, aby postępować zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi wyłączania detektora, ponieważ niewłaściwa obsługa i wyłączenie może spowodować uszkodzenie przyrządu. NIE wyłączaj ogniwa, przełączając tylną część detektora, ponieważ może to spowodować uszkodzenie instrumentu.
  19. Ręcznie zmień skład fazy ruchomej na 6% metanolu i 94% wody. Bieg przez 5 minut.
  20. Ręcznie zmniejsz natężenie przepływu do 0,7 ml/min, natychmiast zmień skład na 50% MeOH i 50% wody. Biegnij przez co najmniej 20 minut. Niewykonanie tego kroku przez zalecany czas może spowodować uszkodzenie kolumny i detektora. Wyłącz przepływ, a następnie wyłącz odgazowywacz.

5. Przygotowanie standardów

  1. Przygotować bufor fazy ruchomej zgodnie z opisem w krokach 4.1–4.3 powyżej. Ważne jest, aby do przygotowania wzorców używać fazy ruchomej HPLC, aby uniknąć pików wynikających z mieszania różnych roztworów po wstrzyknięciu próbki.
  2. Przed użyciem rozcieńczyć ten roztwór raz na pięć ultraczystą wodą, a końcowy roztwór musi zawierać 6% MeOH.
  3. dGuo Standard
    UWAGA: Wysoki potencjał utleniania wymagany do wykrywania dGuo może zwiększać ryzyko pomiaru zakłócających związków elektroaktywnych. Można to zweryfikować, na przykład, poprzez standardową krzywą detekcji UV dGuo przy 260 nm i porównanie jej z krzywą standardową utworzoną za pomocą detekcji EC. Jeśli oba są dobrze wyrównane (np. rysunek uzupełniający 1) i uwzględniono efekty matrycy próbki, można przystąpić do detekcji dGuo za pomocą UV przy 260 nm, a nie detekcji EC.
    1. Odmierz 1,0 mg dGuo w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1,0 ml MeOH klasy HPLC.
    2. Wiruj z dużą prędkością, aż dGuo całkowicie się rozpuści. Jest to stado podstawowe; przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
    3. Aby wytworzyć wtórny materiał dGuo (0,5 mM), należy rozcieńczyć 143 μl pierwotnego materiału dGuo w 857 μl fazy ruchomej HPLC. Przechowywać na lodzie do czasu użycia i codziennie przygotowywać świeże.
    4. Dokonać dalszych rozcieńczeń, aby utworzyć krzywą standardową (np. Tabela 2). Przechowuj roztwory na lodzie i codziennie przygotowuj świeże. Uruchamiaj wzorce szeregowo z próbkami eksperymentalnymi.
    5. Przed uruchomieniem zmień napięcie detektora, używając najwyższego stężenia kolby, aby znaleźć optymalne napięcie.
  4. 8-oxo-dGuo Standardowy
    1. Odmierz 1,0 mg 8-oxo-dGuo w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 0,1 ml MeOH klasy HPLC. Wirować z dużą prędkością, aż 8-oxo-dGuo całkowicie się rozpuści. Jest to podstawowe stado 8-oxo-dGuo. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
    2. W osobnej probówce połącz 2,9 μl podstawowego materiału i 997,1 μl mobilnego bufora fazowego HPLC, wir. Jest to zapas wtórny (10 000 nM).
    3. Aby stworzyć rozwiązanie robocze dla krzywej wzorcowej (250 nM), należy połączyć 24,4 μl materiału wtórnego i 975,6 μl ruchomego bufora fazowego.
    4. Wykonać dalsze rozcieńczenia, aby uzyskać roztwory wymagane do utworzenia krzywej wzorcowej (np. Tabela 3). Przechowuj roztwory na lodzie i codziennie przygotowuj świeże. Uruchom wzorce z próbkami eksperymentalnymi.
  5. Kwantyfikacji
    1. Zintegrować obszar pod krzywą zarówno dla 8-oxo-dGuo, jak i dGuo za pomocą standardowego oprogramowania (jako część interfejsu HPLC-komputer; patrz rysunek uzupełniający 2A).
    2. Skonstruuj krzywą wzorcową (znane stężenie każdego analitu w funkcji powierzchni pod krzywą (rysunek uzupełniający 2B). Korzystając z równania krzywej standardowej, oblicz stosunek dla 8-oxo-dGuo/dGuo dla każdej próbki.

6. Elektroforeza w żelu agarozowym

UWAGA: Elektroforeza w żelu agarozowym może być przeprowadzona w celu sprawdzenia kompletności trawienia DNA.

  1. Przygotować 50x bufor Tris-acetate-EDTA (TAE), rozpuszczając 242 g zasady Tris (FW = 121.14) w 750 ml ultraczystej wody. Dodać 57,1 ml lodowatego kwasu octowego i 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA całkowicie się rozpuści, gdy pH roztworu zostanie dostosowane do 8,0 za pomocą np. NaOH) i doda ultraczystą wodę do końcowej objętości 1 l. Przechowywać w temperaturze pokojowej, rozcieńczyć ten roztwór 50 razy przed użyciem.
  2. Odważyć 1 g agarozy i rozpuścić ją w 100 ml 1x bufor TAE, podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez 1-2 min. Nosić okulary ochronne i sprzęt ochronny, aby uniknąć kontaktu z wrzącą agarozą.
  3. Schłodzić roztwór do temperatury około 50 °C, dodać 5 μl bromku etydyny (uwaga: mutagen) i wlać go do aparatu do pracy w żelu agarozowym. Włóż grzebień.
  4. Poczekaj, aż roztwór stężeje, wlej bufor TAE na żel i załaduj próbki (objętość zależy od wielkości grzebienia; zazwyczaj ładuje się 10-20 μl próbki DNA, miesza się ją z 6-krotnym działającym barwnikiem w celu wizualizacji i ułatwienia ładowania).
  5. Uruchom żel do momentu, aż barwnik przesunie się o około 2/3 długości żelu (np. 45 minut przy napięciu 150 V). Wizualizuj pasma DNA w świetle UV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaobserwowano, że dGuo ma czas retencji wynoszący 4,7 min, podczas gdy 8-oxo-dGuo ma czas retencji około 6,4 min (Rycina 2A i B). Jak widać na Rycini 2C, wysokości pików dla tych dwóch analitów różnią się około 1000-krotnie. Woltamogramy dla 8-oxo-dGuo i dGuo uzyskano poprzez pomiar wzorców przy potencjale roboczym w zakresie od +0,2 do +1,1 V. Optymalny potencjał roboczy dla 8-oxo-dGuo określono jako +0,5 V, a dla dGuo jako +0,9 V (Rycina 3). Potencjały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż 8-oxo-dGuo został zgłoszony jako użyteczny biomarker utleniania DNA, jego wiarygodna kwantyfikacja może stanowić wyzwanie. Chociaż istnieje kilka opublikowanych metod, istnieje potrzeba kompleksowego, opisowego przeglądu protokołu, aby umożliwić naukowcom wdrożenie metody w swoich laboratoriach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy przegląd protokołu opartego na HPLC, który pozwoli nowym użytkownikom ustalić skuteczną metodę wykrywania i oznaczania ilościowego 8-oxo-dGuo.

Trzy główn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów ani konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) oraz Canadian Regulatory Strategy for Biotechnology (CRSB). Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320Niewłaściwie określany jako "8-hydroksy-2'-deoksyguanozyna"; patrz Rys. 1 i tekst, aby uzyskać szczegółowe informacje.
Fosfataza alkalicznaSigma-AldrichP5931Z E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Chelaty metali ciężkich
Mesylan desferoksaminySigma-AldrichD9533
wzorzec dGuoSigma-AldrichD7145
Dwuzasadowy fosforan soduSigma-AldrichS9390
DNA z nasienia łososiaSigma-AldrichD1626Sól sodowa
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, z trzustki bydła
DNAzolInvitrogen10503-27
Sól disodowa dwuwodnego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)Sigma-AldrichE4884Związek nie rozpuści się całkowicie, dopóki pH roztworu nie zostanie dostosowane do 8,0 (np. z pożywką NaOH)
F12-KATCC30-2004
Surowica bydlęcapłodu ATCC30-2020
Kolumna ochronnaSpecjalności chromatograficzneYBA 99S03 0204GCChroni kolumnę przed zanieczyszczeniem; może również prowadzić do wzrostu ciśnienia
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
Monozasadowy fosforan soduSigma-AldrichS9638
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiInvitrogen15190-250
Enzym fosfodiesterazy I Sigma-AldrichP3243Typ II z homogenizatora teflonowego jadu Crotalus adamaneus
Thomas Scientific7724T-1 lub 7724T-5 odpowiednio na 1 lub 5 mlObjętość (zdolność przechowywania) zależy od ilości próbki do przetworzenia.
TrypsinInvitrogen15050-065
Kolumna YMC-BASIC ze spoiwą sferyczną krzemionkąSpecjalności chromatograficzneYBA 99S03 1546WT

Bibliografia

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
  13. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  14. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  15. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  16. Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  17. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  18. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  19. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  20. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  21. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  22. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  23. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  24. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  25. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  26. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Detekcja elektrochemiczna HPLCpomiar 8-oxo-dGuoprzygotowanie próbek DNAanaliza hodowli komórkowychanaliza tkanek zwierzęcychwykrywanie stresu oksydacyjnegosporządzanie krzywej wzorcowejoptymalizacja fazy ruchomejoptymalizacja napięcia detektora
Pomiar HPLC biomarkera utleniania DNA, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.