Artykuł metodologiczny

Pożywka kondycjonowana z kością: przygotowanie i test biologiczny

DOI:

10.3791/52707

⸱

8 lipca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Surgery and Stomatology, School of Dental Medicine, University of Bern, 2Laboratory of Oral Cell Biology, School of Dental Medicine, University of Bern, 3Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Dental Medicine, Universitat Internacional de Catalunya, 4Robert K. Schenk Laboratory of Oral Histology, School of Dental Medicine, University of Bern, 5Department of Cranio Maxillofacial Surgery, Inselspital, University of Bern, 6Department of Implant Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Santa Catarina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj, jak przygotować podłoże kondycjonowane z kością (BCM) i przetestować jego aktywność in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologiczne przeszczepy kostne są szeroko stosowane w chirurgii szczękowo-twarzowej, ortopedii i traumatologii. Autologiczne przeszczepy kostne nie tylko zastępują brakujące kości, ale także wspomagają złożony proces regeneracji kości. To korzystne zachowanie autoprzeszczepów przypisuje się trzem cechom: przewodnictwu kostnemu, osteogenności i osteoindukcyjności. Jest jednak inny aspekt: przeszczepy kostne uwalniają niezliczone cząsteczki, w tym czynniki wzrostu, które mogą celować w komórki mezenchymalne zaangażowane w regenerację kości. Właściwości parakrynne przeszczepów kostnych można badać in vitro przy użyciu podłoża kondycjonowanego kością (BCM). W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przygotowania pożywki kondycjonowanej przez kość z rodzimej kości korowej świni oraz kości poddanej obróbce termicznej lub demineralizacji. Komórki mogą być bezpośrednio wystawione na działanie BCM lub wysiane na biomateriały, takie jak błony kolagenowe, wcześniej nasączone BCM. Podajemy przykłady testów biologicznych in vitro z komórkami mezenchymalnymi dotyczących ekspresji genów regulowanych przez TGF-β. Przedstawione protokoły powinny zachęcać do dalszego odkrywania parakrynnego działania przeszczepów kostnych podczas regeneracji kości oraz otworzyć drogę do badań translacyjnych w szeroko pojętej dziedzinie chirurgii rekonstrukcyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologiczna kość jest powszechnie stosowana do wypełniania defektów, które powstały w wyniku wad rozwojowych, chirurgii resekcyjnej, chirurgii urazów rekonstrukcyjnych i przed wszczepieniem implantu 1,2. Zrozumienie biologicznych zasad tego, w jaki sposób przeszczepy kostne wspierają proces konsolidacji przeszczepów, jest nie tylko kluczem do zrozumienia, dlaczego autoprzeszczepy są uważane za złoty standard w chirurgii rekonstrukcyjnej, ale jest również bioniczne dla ulepszonego projektowania substytutów kości 3. Mimo to konsolidacja przeszczepu jest szybsza w przypadku kości autologicznej w porównaniu z substytutami kości 4,5. Dlatego konieczne jest ujawnienie mechanizmów molekularnych i komórkowych, które sprawiają, że autologiczna kość jest tak skuteczna we wspomaganiu regeneracji kości.

Istnieją trzy podręcznikowe cechy autoprzeszczepów, które są uważane za wspierające proces konsolidacji 6,7. Po pierwsze, kość autologiczna jest osteokondukcyjna, zapewniając wskazówki dla nowo powstałej kości, aby wrastać w ubytek. Po drugie, kość autologiczna jest kościonetna, co oznacza, że zawiera komórki mezenchymalne, które mogą różnicować się w osteoblasty 8. Po trzecie, kość autologiczna jest kościochłonna, ponieważ czynniki wzrostu, takie jak białka morfogenetyczne kości zanurzone w macierzy, mogą inicjować proces tworzenia kości śródchrzęstnej lub nawet śródbłoniastej 9. Jest jeszcze jeden aspekt: świeżo przygotowane wióry kostne pełnią funkcję parakrynną na podstawie obserwacji in vitro z "pożywką kondycjonowaną przez kość" 10-15. Należy również wspomnieć o wpływie mielopoezy 16. Podobny termin "zdemineralizowane podłoże kondycjonowane macierzą kostną" został ukuty już w 1996 roku i wspiera ogólną koncepcję parakrynnej funkcji kości, nawet gdy jest przetwarzana przez demineralizację 17. Dla naszych celów BCM może być przygotowany ze świeżych żuchw świni 10,11. Analizy proteomiczne BCM ujawniły złożony skład, w tym czynniki wzrostu i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej 10, poszerzając również istniejącą wiedzę na temat proteasomu całej kości 18,19. W związku z tym BCM powinien odzwierciedlać uwolnioną aktywność różnych modyfikacji przeszczepów kostnych in vitro.

Co się dzieje, gdy komórki mezenchymalne, na przykład te wyizolowane z wiórów kostnych lub z tkanek miękkich jamy ustnej, są narażone na działanie BCM? In vitro BCM zmniejsza różnicowanie osteogenne i adipogenne oraz wywołuje silny wzrost ekspresji IL11 11. Mikromacierz obejmująca cały genom ujawniła, że więcej genów ulega zróżnicowanej ekspresji w komórkach mezenchymalnych w odpowiedzi na BCM. Wśród tych genów są adrenomedullina (ADM), IL11, IL33, oksydaza NADPH 4 (NOX4), proteoglikan 4 (PRG4 lub lubrycyna) i pentraksyna 3 (PTX3) 15. BCM uzyskany z autoklawowanych chipów kostnych nie zmienił ekspresji odpowiednich genów 14. BCM z wiórów kostnych, które zostały poddane pasteryzacji i zamrażaniu, był w stanie zmienić ekspresję genów 14. Również kondycjonowane podłoże zdemineralizowanej macierzy kostnej (DBM-CM) zmienia ekspresję genów regulowanych przez TGF-β 20. Co ciekawe, błony barierowe kolagenu używane do ochrony wiórów kostnych przed otaczającą tkanką miękką 21,22 adsorbowały te części BCM, które są odpowiedzialne za zmiany w ekspresji genów 23. Badania BCM można rozszerzyć na inne typy komórek biorące udział w regeneracji kości, takie jak osteoklasty resorbujące kości i komórki śródbłonka, by wymienić tylko kilka. Ogólnie rzecz biorąc, zgromadzone dane z badań in vitro stanowią podstawę naukową do zaprojektowania badania przedklinicznego.

Obecny protokół jest dwojaki: Po pierwsze, pokazuje, jak przygotować BCM. Po drugie, pokazuje, jak badać jego aktywność biologiczną w oparciu o komórki mezenchymalne in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie BCM

  1. Zaopatrz się w żuchwy wieprzowe od lokalnego rzeźnika tak świeże, jak to możliwe. Umieść żuchwy na twardej powierzchni i zwolnij klapę o pełnej grubości, zwracając szczególną uwagę, aby nie pozostawić żadnej tkanki miękkiej lub okostnej przyczepionej do kości. Praca w czystym środowisku bez konieczności pracy pod okapem przepływowym.
  2. Po zwolnieniu płata o pełnej grubości użyj skrobaka do kości, aby zebrać wióry kostne od strony policzkowej. Należy pamiętać, że skrobak do kości musi być ostry. Trzymaj mocno skrobak do kości i długimi ruchami zbierz kość. Wyrzuć kawałki kości mniejsze niż 1 mm.
    1. Aby utrzymać natywne wióry kostne, umieść je bezpośrednio w plastikowych naczyniach o średnicy 10 cm z pożywką Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) uzupełnioną 1% antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi, nie dopuszczając do ich wyschnięcia.
    2. Aby ocenić wpływ obróbki termicznej, należy poddać wióry kostne pasteryzacji przez 30 minut w temperaturze 80 °C lub autoklawowi przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
    3. Aby ocenić wpływ demineralizacji, należy wstrząsać wiórami kostnymi w 1 M HCL przez 4-6 godzin w temperaturze 4 °C i kilkakrotnie przemywać pożywką hodowlaną, aż pH będzie neutralne.
  3. Umieść łącznie 5 g wiórów kostnych na 10 ml świeżego DMEM uzupełnionego 1% antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi w nowym plastikowym naczyniu.
  4. Umieść plastikowe naczynia w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C na 24 godziny. Następnie zbierz BCM. Odwirować BCM przy 200 x g przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, przefiltrować go do sterylnego (0,2 nm) i utrzymać podwielokrotności zamrożone w temperaturze -80 °C.
  5. Rozmrażaj bulion BCM bezpośrednio przed użyciem i unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  6. We wskazanych eksperymentach należy namoczyć błony kolagenowe za pomocą BCM lub pożywki bez surowicy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Energicznie przemyć membrany PBS i umieścić je w 96-dołkowych płytkach. Mokre błony są obsiane komórkami.
  7. Proces przygotowania BCM podsumowano na rysunku 1.

2. Testy biologiczne na podstawie komórek mezenchymalnych

  1. Wysiewaj ludzkie komórki mezenchymalne (na przykład komórki kostne, fibroblasty więzadeł dziąseł i przyzębia) na 12-dołkową płytkę o stężeniu 30 000 komórek/cm2. Do wysiewu komórek należy użyć pożywki wzrostowej składającej się z DMEM, 10% płodowej surowicy cielęcej i antybiotyków. Pozwól komórkom przymocować się do płytki O/N.
  2. Odrzucić pożywkę hodowlaną i przemyć komórki wstępnie ogrzanym PBS w temperaturze 37 °C. Stymulować komórki poprzez dodanie wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej bez surowicy z 20% BCM lub bez niej. Umieścić komórki w wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.
  3. Wyrzuć pożywkę hodowlaną, przepłucz komórki wstępnie podgrzanym PBS i wyekstrahuj RNA zgodnie z preferowanym protokołem.
  4. Dostosuj stężenie RNA, aby uzyskać taką samą ilość RNA w każdej próbce. Przygotować cDNA i przeprowadzić qRT-PCR w celu analizy wybranych genów przy użyciu starterów pokazanych w tabeli 1.
    UWAGA: Są to rozcieńczenia każdego składnika: 2x SYBR Green, 20x starter do przodu, 20x starter reverse, 5x sterylna woda DD, 5x cDNA. qRT-PCR wykonuje się w 40 cyklach w temperaturze 95 °C 15 sekund i 60 °C 1 min.
  5. Obliczyć względne poziomy ekspresji, normalizując do genu porządkowego GAPDH przy użyciu metody Δ(ΔCt), gdzie ΔCT jest celem CT - CT GAPDH, a Δ(ΔCT) jest stymulowany ΔCT - kontrola ΔCT.
  6. Po tej kontroli jakości dodaj BCM do pożywki hodowlanej, aby stymulować wszystkie typy komórek, w tym komórki mezenchymalne, komórki krwiotwórcze lub komórki śródbłonka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podłoże kondycjonowane z kości jest przygotowywane ze świeżych wiórów kostnych wieprzowych. Ogólny zarys procesu przygotowania BCM i stosowania biomateriałów w połączeniu z BCM przedstawiono odpowiednio na rysunku 1 i rysunku 2. Podczas przygotowania BCM ważne jest, aby uzyskać duże wióry kostne długimi ruchami, ponieważ krótkie ruchy lub bardzo małe wióry kostne mogą wpływać na jakość końcowego BCM. Jakość BCM można kontrolować, analizując ekspresję genów docelowych genów BCM: ADM, PTX3...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pożywka kondycjonowana kością odzwierciedla uwolnioną aktywność przeszczepów kostnych we wczesnych stadiach regeneracji kości. Opisany tutaj protokół można dostosować do badania odpowiedzi różnych typów komórek biorących udział w regeneracji kości. Ponadto protokół może być stosowany do przygotowania kondycjonowanego podłoża z przetworzonej kości lub wypełniaczy kostnych. Metody są łatwe do wykonania i opierają się na prostej koncepcji: czynniki uwalniane z różnych natywnych i przetworzonych kości. Zrozumienie, w jaki sp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Jordi Caballé-Serrano otrzymał stypendium Fundacji Badań i Edukacji Stomatologicznej w Bazylei w Szwajcarii.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Catherine Solioz za jej umiejętną pomoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żuchwy świniLokalny bucher
Skrobakdo kości Hu-FriedyPPBUSE2/36
Antybiotyki i AntymikotykiAll life Technologies15240-062
Membrany kolagenowe (Bio-Gide)Geistlich
Surowica cielęca płoduInvitrogen Corporation16030074
DMEMInvitrogen Corporation21885-025

Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości		11828665001
Najpierw transkryptor Zestaw do syntezy nici cDNARoche4379012001
StarteryMicrosynth
SYBR Green (dla Q-RT-PCR)Roche4673484001
PBSRoche11666789001
Roche

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
  2. Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
  3. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
  4. Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
  5. Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
  6. Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
  7. Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
  8. Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
  9. Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
  10. Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
  11. Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
  12. Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
  13. Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
  14. Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
  15. Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
  16. Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
  17. Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
  18. Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
  19. Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
  20. Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
  21. Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bone Conditioned MediumBone GraftsMesenchymal CellsGene Expression AnalysisQuantitative Real time PCRCollagen MembranesTGF beta SignalingBone RegenerationIn Vitro BioassayParacrine Effects

Powiązane artykuły