Artykuł metodologiczny

Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości węzłów chłonnych szyjnych myszy

21.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52718

⸱

25 lipca 2015

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Anatomy, West Virginia University, 2Animal Models and Imaging Facility, West Virginia University, 3Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie ultradźwięków o wysokiej częstotliwości (HFUS) do obrazowania węzłów chłonnych szyjnych myszy. Technika ta optymalizuje wizualizację i kwantyfikację morfologii, objętości i przepływu krwi węzłów chłonnych szyjnych. Przedstawiono również biopsję węzłów chłonnych szyjnych pod kontrolą obrazu oraz przetwarzanie tkanki limfatycznej do oceny histologicznej.

Streszczenie

Ultradźwięki wysokiej częstotliwości (HFUS) są szeroko stosowane jako nieinwazyjna metoda obrazowania wewnętrznych struktur anatomicznych w eksperymentalnych układach małych zwierząt. HFUS ma zdolność wykrywania struktur o wielkości zaledwie 30 μm, co zostało wykorzystane do wizualizacji powierzchownych węzłów chłonnych u gryzoni w trybie jasności (B). Połączenie Power Doppler z obrazowaniem w trybie B pozwala na pomiar przepływu krwi w krążeniu w węzłach chłonnych i innych narządach. Podczas gdy HFUS został wykorzystany do obrazowania węzłów chłonnych w wielu systemach modeli mysich, szczegółowy protokół opisujący obrazowanie HFUS i charakterystykę węzłów chłonnych szyjnych u myszy nie został zgłoszony. Tutaj pokazujemy, że HFUS można dostosować do wykrywania i charakteryzowania węzłów chłonnych szyjnych u myszy. Połączone obrazowanie dopplerowskie w trybie B i mocy może być stosowane do wykrywania wzrostu przepływu krwi w immunologicznie powiększonych węzłach szyjnych. Opisano również zastosowanie obrazowania w trybie B do przeprowadzania biopsji cienkoigłowych węzłów chłonnych szyjnych w celu pobrania tkanki limfatycznej do analizy histologicznej. Na koniec opisano kroki wspomagane oprogramowaniem w celu obliczenia zmian objętości węzłów chłonnych i wizualizacji zmian w morfologii węzłów chłonnych po rekonstrukcji obrazu. Możliwość wizualnego monitorowania zmian w biologii węzłów chłonnych szyjnych w czasie zapewnia prostą i skuteczną technikę nieinwazyjnego monitorowania zmian w węzłach chłonnych szyjnych w przedklinicznych mysich modelach choroby jamy ustnej.

Wprowadzenie

Drenaż limfatyczny śródmiąższowego płynu tkankowego jest główną metodą rozprzestrzeniania się zakaźnych mikroorganizmów i nowotworów powstających w okolicy ustnej i szczękowo-twarzowej1,2. Ocena kliniczna węzłów chłonnych szyjnych jest powszechną praktyką diagnostyczną stosowaną w celu określenia obecności lub progresji chorób wywodzących się z jamy ustnej. Podkreśla to znaczenie pobierania węzłów chłonnych szyjnych jako cennych miejsc anatomicznych w diagnostyce chorób jamy ustnej3. Kilka specjalistycznych metodologii obrazowania jest klinicznie wykorzystywanych do identyfikacji chorych węzłów chłonnych szyjnych. Należą do nich pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa (CT) i rezonans magnetyczny (MR). Chociaż metody te są bardzo cenne, wszystkie te wymagają intensywnego przygotowania pacjenta, wysoce specjalistycznego sprzętu i/lub infuzji chemicznej do krążenia, aby umożliwić lub usprawnić proces obrazowania.

Obrazowanie ultrasonograficzne (ultradźwięki; US) jest powszechnie stosowaną techniką stosowaną do obrazowania węzłów chłonnych szyjnych z powiększeniem węzłów chłonnych z powodu infekcji lub zajęcia przerzutów4-6. USG jest często łączony z obrazowaniem PET-CT i MR w celu zapewnienia kompleksowego przedstawienia stanu węzłów chłonnych pacjenta, pomagając określić stopień zaawansowania guza i konieczność wycięcia chirurgicznego7. Nieinwazyjny charakter USG ma również nieodłączne zalety w porównaniu z innymi metodami obrazowania, w tym łatwość użycia, niski koszt, minimalny dyskomfort pacjenta i przygotowanie. Powierzchowne podskórne umiejscowienie większości węzłów chłonnych szyjnych pozwala USG na prowadzenie minimalnie inwazyjnych biopsji aspiracyjnych cienkoigłowych ze zwiększoną precyzją, poprawiając dokładność diagnostyczną8.

Komercyjna wysoka częstotliwość (HF) US zapewnia szczegółową rozdzielczość wewnętrznych struktur anatomicznych do 30 μm9. Wykorzystując przetworniki w zakresie częstotliwości 22-70 MHz, HFUS został z łatwością zastosowany w różnych eksperymentalnych systemach gryzoni, aby umożliwić obrazowanie narządów wewnętrznych in vivo w czasie rzeczywistym. HFUS został przystosowany do wizualizacji powstawania guza w konwencjonalnym trybie jasności (B), a także z wieloma ogólnymi i specjalistycznymi środkami wzmacniającymi kontrast9. Korzystanie z Power Doppler z HFUS zapewnia możliwość monitorowania przepływu krwi w guzach myszy, umożliwiając kompleksową ocenę perfuzji angiogennej u żywych myszy10,11. HFUS został wykorzystany do wizualizacji chorych węzłów chłonnych myszy w głównej jamie ciała, wykazując równoległą użyteczność tej technologii w praktyce klinicznej. W szczególności zmiany zapalne i przerzutowe trzewnych węzłów chłonnych zaobserwowano w mysich modelach raka z guzami piersi12,13, trzustki14, jelita grubego15 i płuc16, a także włóknistych histocytomów17 i starzejącego się mysiego modelu nabytego wodonercza18. Przykłady te potwierdzają wartość HFUS jako potężnego narzędzia badawczego w zakresie powiększenia węzłów chłonnych wywołanych nowotworem w wielu różnych układach gryzoni.  

Opracowano kilka modeli zakażenia bakteryjnego19,20 oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC)21,22 w celu zbadania tych chorób w warunkach przedklinicznych. W przeciwieństwie do ludzi, myszy zawierają trzy węzły chłonne szyjne, które badają limfę z tkanek jamy ustnej (żuchwa, żuchwa podżuchwowa i ślinianka przyusznapowierzchowna 23). Niedawno informowaliśmy o zastosowaniu HFUS do mapowania lokalizacji i morfologii tych węzłów chłonnych, monitorowania zmian objętości węzłów chłonnych i przepływu krwi w mysim modelu HNSCC24 wywołanym przez czynnik rakotwórczy. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół stosowania HFUS do identyfikacji, obrazowania i analizy węzłów chłonnych szyjnych u żywych myszy. Protokół ten pokazuje również możliwość wykorzystania HFUS do przeprowadzania biopsji cienkoigłowej pod kontrolą obrazowania powiększonych węzłów chłonnych szyjki macicy, umożliwiając histologiczne monitorowanie zmian w zawartości węzłów chłonnych szyjnych i patologii w czasie u tego samego zwierzęcia. Protokół ten można łatwo dostosować, aby umożliwić szczegółowe badanie patologii węzłów chłonnych szyjnych wynikających z jakiejkolwiek inwazyjnej choroby jamy ustnej u myszy.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach przedstawione w tym protokole zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zachodniej Wirginii zgodnie z protokołami 11-0412 i 14-0514 oraz przeprowadzone zgodnie z zasadami i procedurami opisanymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Znieczulij pojedynczą mysz w komorze indukcyjnej za pomocą 3% izofluoranu zmieszanego z 1,5 l/min 100% tlenu. Wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej i umieścić w pozycji leżącej na platformie obrazowania podgrzanej do 40 °C i utrzymywanej w temperaturze 37-42 °C (rysunek 2A). Potwierdź znieczulenie przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  2. Umieść pysk myszy w stożku podłączonym do systemu znieczulającego. Zastosuj znieczulenie, aby utrzymać sedację w stanie ustalonym (1,5% izofluoranu zmieszanego z 1,5 l/min 100% tlenu).
  3. Nałóż smar do oczu na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu. Nałóż żel elektrodowy na elektrody i użyj taśmy, aby przymocować każdą z czterech łap do odpowiedniej elektrody. Elektrody będą przesyłać EKG zwierzęcia do systemu obrazowania, aby umożliwić monitorowanie tętna i częstości oddechów. Nasmaruj i włóż sondę temperatury doodbytnicy w celu ciągłego monitorowania temperatury ciała. Normalna temperatura ciała myszy wynosi 36,9 °C. Zmiana 1-2 °C jest normalna w znieczuleniu.
  4. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć sierść z szyi myszy. Opłucz okolice szyi gazą nasączoną wodą, aby usunąć włosy i nadmiar kremu do depilacji. Opcjonalnie użyj dodatkowej aplikacji kremu do depilacji, aby usunąć wszelkie pozostałe włosy na ciele (Rysunek 2B).

2. Identyfikacja i pozyskiwanie obrazu węzłów chłonnych szyjnych myszy za pomocą HFUS

  1. Na początek nałóż warstwę ocieplonego żelu ultradźwiękowego na obszar szyi pozbawiony sierści. Użyj obfitej aplikacji żelu, aby uzyskać optymalną jakość obrazu (ryc. 2C). Podczas aplikacji należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do żelu, które mogą zakłócać obrazowanie ultradźwiękowe.
  2. Ustaw platformę obrazowania pod kątem 20-30° tak, aby mysz była ustawiona z lekko uniesioną głową. Ta pozycja pomaga zapewnić optymalne tempo oddychania myszy. Umieść przetwornik 40 MHz poprzecznie w systemie montażowym i ostrożnie opuść go, aż przód głowicy skanującej przetwornika zostanie zanurzony w żelu ultradźwiękowym (Rysunek 2C).
    UWAGA: Pamiętaj, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na szyję myszy, ponieważ może to spowodować nadmierną niewydolność oddechową. Ponadto w przypadku obrazowania pomocne jest posiadanie buforu żelu między przetwornikiem a myszą.

Obrazowanie i wykrywanie węzłów chłonnych w trybie B:

  1. Za pomocą komputera sterującego oprogramowaniem akwizycyjnym HFUS dostosuj ustawienia trybu jasności (B-) do następujących parametrów: Wzmocnienie 22 dB, głębokość 10,00 mm, szerokość 14,08 mm,
    UWAGA: Te ustawienia są sugerowanym punktem wyjścia i mogą wymagać niewielkiej regulacji w celu optymalnego pozyskiwania obrazu między różnymi aplikacjami. Obserwuj normalne węzły chłonne szyjne jako owalne hipoechogeniczne struktury w pobliżu powierzchni skóry w otaczającym polu hiperechomicznym. Wygląd chorych węzłów chłonnych może się różnić w zależności od modelu. Aby systematycznie obrazować wszystkie węzły chłonne w okolicy szyi, wykonaj następujące czynności:
    1. Użyj osi Y, aby zeskanować szyję w sposób czaszkowo-ogonowy w kierunku klatki piersiowej. Użyj osi X, aby wyśrodkować obraz.
    2. Zidentyfikuj główne punkty orientacyjne: jamę policzkową, język i tarczycę (ryc. 3A, B i C; odpowiednio); przechyl platformę obrazowania, aby w poziomie dostosować brzuszną powierzchnię szyi myszy, dzięki czemu obie strony szyi będą widoczne nawet na obrazie w trybie B. Stopień przechylenia zależy od fizjologii każdej myszy.
  2. Przeprowadź skan 3D całego obszaru szyi od jamy policzkowej/okolicy języka do tarczycy, aby zmapować węzły chłonne i związane z nimi punkty orientacyjne na całej szyi.
    1. Zlokalizuj obszar języka/jamy policzkowej (Rysunek 3A) i zanotuj położenie numeryczne na skali Y.
    2. Zlokalizuj tarczycę (ryc. 3C) i zanotuj położenie numeryczne na skali Y.
    3. Obliczyć różnicę między uzyskanymi wartościami w (2.4.1) i (2.4.2), aby określić całkowitą długość w mm dla obrazowanego obszaru szyi.
    4. Użyj pokrętła Y, aby wyśrodkować przetwornik w punkcie środkowym wyznaczonej długości całkowitej.
    5. Naciśnij "3D". Wprowadź długość całkowitą. W przypadku rozmiaru kroku 3D użyj 0,076 mm, aby uzyskać stos serii obrazów dla całego obszaru szyi.
  3. Po zakończeniu skanowania wybierz prawą lub lewą stronę szyi i wyśrodkuj głowicę na pojedynczym węźle chłonnym, który Cię interesuje, a następnie podnieś przetwornik 40 MHz z myszy. Usuń przetwornik 40 MHz i zastąp go przetwornikiem mikroskopowym 50 MHz (również w pozycji poprzecznej), aby uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości. Uzupełnij żel ultradźwiękowy na szyi myszy i opuść przetwornik 50 MHz do żelu ultradźwiękowego.

3D Obrazowanie Dopplerowskie

  1. Wykonaj skany 3D za pomocą Power Doppler, aby ocenić objętość i unaczynienie poszczególnych węzłów chłonnych szyjnych w następujący sposób:
    1. Naciśnij przycisk zasilania na klawiaturze systemowej, aby uzyskać moc Doppera i dostosuj następujące ustawienia trybu zasilania: PRF 4 KHz, wzmocnienie dopplerowskie 34 dB, wzmocnienie 2D 30 dB, głębokość 5,00 mm, szerokość 4,73 mm. UWAGA: Tak jak poprzednio, te ustawienia są sugerowanym punktem wyjścia i mogą być modyfikowane w razie potrzeby w celu optymalnego uzyskania obrazu w różnych modelach.
    2. Zlokalizuj najbardziej wysunięty w czaszkę punkt węzła chłonnego będącego przedmiotem zainteresowania i zanotuj położenie na skali Y.
    3. Zlokalizuj najbardziej ogonowy punkt tego samego węzła i zanotuj położenie na skali Y.
    4. Obliczyć różnicę odległości, aby określić całkowitą długość węzła chłonnego (patrz krok 2.4.3).
    5. Wyśrodkuj przetwornik w punkcie środkowym wyznaczonej długości całkowitej, korzystając z lokalizacji w skali Y.
    6. Naciśnij "3D" i wprowadź całkowitą długość węzłów chłonnych. Użyj 0,051 mm dla rozmiaru kroku.
      UWAGA: Ze względu na bliskość przetwornika do okolicy klatki piersiowej, przetwornik 50 MHz może powodować niestabilny obraz dopplerowski z powodu wykrycia normalnego ruchu oddechowego. Można to wyeliminować, korzystając z opcji "Bramkowanie oddechu" dostępnej w zakładce "Fizjologiczne".
    7. Otocz wybrany węzeł chłonny żółtym polem, które oznacza obszar, który ma być analizowany przez Power Doppler i wybierz "Skanowanie 3D", aby uzyskać obrazy. Podnieś przetwornik z myszy i przesuń go na przeciwną stronę szyi. Opuść przetwornik na mysz i powtórz czynności opisane powyżej, aby zobrazować węzły chłonne po tej stronie szyi.
  2. Zapisywanie zestawów obrazów do późniejszej analizy.

3. Biopsja węzłów chłonnych szyjnych

  1. Wybierz żądany węzeł chłonny do biopsji i kontynuuj obrazowanie HFUS za pomocą głowicy 50 MHz. Wybierz największy widoczny szyjny węzeł chłonny po każdej stronie szyi myszy. Powiększenie węzłów chłonnych zazwyczaj wskazuje na reakcję zapalną, dlatego takie węzły są idealnymi kandydatami do biopsji.
    UWAGA: Stwierdziliśmy, że bardzo trudno jest przeprowadzić biopsje węzłów szyjnych mniejszych niż 10 mm3.
  2. Przygotować igłę i strzykawkę do biopsji, umieszczając strzykawkę o pojemności 1 ml z dołączoną igłą o masie 27 G 0,5 cala w uchwycie strzykawki. Wyreguluj uchwyt igły, aby ustawić igłę pod kątem 90° względem szyjki myszy (Rysunek 4A).
  3. Przygotuj się, podnosząc całą platformę myszy do poziomu igły. Osiągnij to, usuwając silnik 3D i przełączając się na wyższą platformę lub umieszczając solidny przedmiot o odpowiedniej wysokości pod dostarczoną krótką platformą. W tym celu użyj plastikowego stojaka na probówki do mikrofuge. W razie potrzeby należy obrócić platformę o 180° w celu wykonania biopsji węzłów znajdujących się po stronie szyi naprzeciwko aparatu igłowego.
  4. Dostosuj ustawienia akwizycji, wybierając "Preferencje", a następnie wybierając "Maksymalny i rozszerzony bufor". Powiększ pole widzenia do głębokości 8,00 mm i szerokości 9,73 mm. Włączyć prowadnik igły za pomocą pokrętła ekranowe. Prowadnica igły przewidzi drogę igły na ekranie i pozwoli użytkownikowi ustawić interesujący go węzeł chłonny we właściwym miejscu do biopsji.
  5. Upewnij się, że węzeł chłonny pozostaje stale widoczny, wyśrodkowując węzeł chłonny pośrodku lub nieco na lewo od środka ekranu (Rysunek 4B). Aby uzyskać całą pętlę cine procedury, przed rozpoczęciem biopsji naciśnij przycisk Pre-trigger na klawiaturze systemu.
  6. Wyreguluj uchwyt igły, aż końcówka igły znajdzie się w polu widzenia i zetknie się ze skórą (Rysunek 4B). Przesuń igłę mocnym, szybkim naciśnięciem, aby nakłuć skórę. Kontynuuj przesuwanie igły, aż końcówka również przebije kapsułkę (Ryc. 4C) i będzie widoczna w rdzeniu (Ryc. 4D).
  7. Gdy igła zostanie prawidłowo umieszczona w węźle, delikatnie pociągnij tłok strzykawki z powrotem między granicami 200-300 μl, aby przeprowadzić biopsję (ryc. 4D i 4E). Należy pamiętać, że materiał biopsyjny zazwyczaj nie jest widoczny w strzykawce.
  8. Delikatnie wyjmij igłę z szyjki myszy. Zawartość strzykawki należy przelać do probówki o pojemności 1,5 ml. Wyjąć igłę ze strzykawki, pozostawiając igłę w probówce. Za pomocą tej samej strzykawki pobrać 1 ml pożywki biopsyjnej (z podwielokrotności, oddzielnie od źródła podstawowego), a następnie ponownie przymocować igłę do strzykawki, trzymając igłę w probówce.
    1. Przepłukać strzykawkę i igłę pożywką do biopsji, wypychając pożywkę biopsyjną do probówki.
      UWAGA: Nie należy odciągać tłoka, gdy igła jest przymocowana w żadnym momencie po biopsji. Zmniejsza to ryzyko utraty materiału biopsyjnego ze względu na mały rozmiar próbki.
  9. Potwierdzić zawartość węzłów chłonnych za pomocą środków histologicznych (ryc. 4F) i przeanalizować za pomocą dodatkowych metod (histochemia, cytometria przepływowa itp.), jeśli jest to właściwe.
  10. Po zakończeniu biopsji wyłącz znieczulenie i wyjmij sondę temperatury doodbytniczą. Usuń nadmiar żelu ultradźwiękowego z myszy za pomocą gazy i usuń taśmę z każdej łapy.
  11. Zdejmij mysz z platformy obrazowania i wróć do klatki. Może wystąpić minimalne krwawienie z miejsca biopsji, ale ustaje ono bez interwencji. Monitoruj mysz podczas odzyskiwania, aż do wznowienia pełnej aktywności.

4. Analiza obrazu węzłów chłonnych szyjnych

  1. W oprogramowaniu ultrasonograficznym wybierz obraz do analizy i przejdź do zakładki "Przetwarzanie obrazu". Wybierz "Załaduj do 3D".
  2. Wybierz "Zrekonstruowany obraz 3D" w lewym górnym rogu, klikając przycisk "Wyświetl pojedynczy panel". W razie potrzeby użyj funkcji powiększania, aby powiększyć obraz. Przełącz "Układ wyświetlania", aby wyświetlić obraz tylko w trybie B, który usuwa nakładkę Dopplera z widoku. Ułatwia to dostrzeżenie krawędzi węzła chłonnego podczas późniejszej analizy 3D. Przewiń serię obrazów, aby zlokalizować początek węzła chłonnego.
  3. Aby oznaczyć węzeł chłonny, przejdź do zakładki "Ustawienia 3D". Wybierz "głośność", a następnie przycisk "Start" obok "Równoległy".
  4. Narysuj kontury wokół obszaru zainteresowania na poszczególnych obrazach, przewijając. Kontynuuj, aż zostaną zaznaczone obrazy obejmujące cały węzeł chłonny. Wybierz "Zakończ", aby zakończyć analizę.
  5. U dołu obrazu zostanie automatycznie wyświetlona objętość 3D i % unaczynienia.
    UWAGA: Objętość 3D odpowiada objętości węzłów chłonnych, a procent unaczynienia reprezentuje procent węzłów chłonnych dodatnich pod względem przepływu krwi za pomocą Dopplera mocy.
  6. Przełącz "Układ wyświetlania", aby wyświetlić obrazowanie dopplerowskie jako nakładkę na obraz w trybie B. Na powierzchni obserwuj widok netto obszaru zainteresowania objętością. Eksportuj obrazy w formacie tagged image file (TIF) lub skany 3D jako filmy (.avi) do dalszego wykorzystania.

Wyniki

Ogólny schemat procedur obrazowania i biopsji przedstawiono na Rysunku 1. Kluczowe etapy procedury obejmują odpowiednie przygotowanie myszy do obrazowania, identyfikację węzłów chłonnych szyjnych, prawidłowe przygotowanie i przeprowadzenie biopsji igłowej oraz analizę obrazów B-mode i Dopplera w celu pomiaru objętości oraz stopnia unaczynienia każdego z wybranych węzłów przy użyciu oprogramowania komputerowego.

Obrazowanie HFUS węzłów chłonnych szyi myszy wymaga zastosowania i utrzymania odpowiedniej anestezji przez cały okres badania (Rycina 2A), a także całkowitego usunięcia sierści z całego obszaru szyi (Rycina 2B). Obfite nałożenie żelu do USG na zdepilowany obszar zapewnia wyraźny sygnał HFUS podczas procedury (Rycina 2C).

Obrazowanie HFUS obszaru szyi jest ułatwione dzięki wizualizacji szyjnych punktów orientacyjnych, które dają charakterystyczne obrazy sonograficzne. Rycina 3 przedstawia przykłady kluczowych narządów (Rycina 3A-C), szyjnych węzłów chłonnych w trybie B (Rycina 3D) oraz w trybie Power Doppler (Rycina 3E).

Obrazowanie HFUS w czasie rzeczywistym u znieczulonych myszy umożliwia prowadzoną biopsję cienkoigłową węzłów szyjnych, analogicznie do procedur stosowanych w praktyce klinicznej. Umieszczenie igły do biopsji oraz dołączonej strzykawki do pobierania w sterującym urządzeniu mikroinżektorze przedstawiono na Rysunku 4A. Kolejne obrazy sonograficzne w trybie B pokazują optymalne rozmieszczenie igły przed biopsją (Rysunek 4B), wprowadzenie czubka igły do węzła chłonnego szyjnego (Rysunek 4C) oraz pozycję igły podczas biopsji (Rysunek 4D). Powiększony obraz przedstawia czubek igły w rdzeniu węzła chłonnego (Rysunek 4E). Przetwarzanie materiału z biopsji za pomocą cytocentryfugi ujawnia liczne skupiska komórek limfoidalnych i powiązaną z nimi tkankę łączną, co potwierdza pomyślne wykonanie biopsji węzła chłonnego (Rysunek 4F).

Analiza obrazów HFUS oparta na metodach obliczeniowych pozwala na uzyskanie szczegółowych informacji dotyczących architektury, objętości oraz przepływu naczyniowego węzła chłonnego. Wykorzystując tryb power Doppler oraz pomiary objętości 3D, można obliczyć procent naczyniowości (PV) z serii obrazów obejmujących całe węzły (Rysunek 5A). Ponadto obrazowanie 3D umożliwia wirtualną rekonstrukcję węzła chłonnego, ujawniając ogólną topografię węzła chłonnego (Rysunek 5B).

Schemat procesu obrazowania ultradźwiękowego, biopsji i analizy u myszy; obejmuje częstotliwości MHz i konfigurację biopsji.
Rycina 1: Schematyczna analiza etapów diagnostycznego obrazowania HFUS węzłów chłonnych szyjnych u myszy. Kluczowe etapy obejmują: 1: Przygotowanie myszy do obrazowania HFUS i uzyskanie obrazów o rozdzielczości 40 i 50 MHz obszaru szyi zawierającego trzy szyjne węzły chłonne myszy. 2: Biopsja cienkoigłowa węzłów chłonnych szyjnych pod kontrolą obrazową i późniejsza analiza histologiczna pobranego materiału. 3: Komputerowa analiza obrazów i rekonstrukcja 3D obrazów węzłów chłonnych uzyskanych w trybie B i Doppler w celu określenia odpowiednio objętości węzłów chłonnych oraz procentowego (%) przepływu naczyniowego.

Układ obrazowania 3D dla modelu mysiego; stacja eksperymentalna, analiza wielospektralna, proces obrazowania.
Rysunek 2: Przegląd systemu wysokorozdzielczego mikroobrazowania in vivo do oceny i biopsji węzłów chłonnych szyjnych. (A) Przedstawiono system HFUS z znieczuloną myszą przygotowaną do obrazowania węzłów chłonnych szyjnych. Pokazano również akcesoria w postaci mikroinjektora (MI) oraz stołu z silnikiem 3D (3D MS). (B) Zbliżenie znieczulonej myszy przygotowanej do obrazowania HFUS z usuniętym włosem w okolicy szyi. (C) Ta sama mysz z przetwornikiem 50 MHz umieszczonym na szyi. Zwróć uwagę na dodatkowy żel ultradźwiękowy użyty w celu ułatwienia obrazowania okolicy szyi.

Schemat ultrasonograficzny: jama ustna, język, gruczoły żuchwowe, tarczyca, gruczoł ślinowy przyuszny, opisane elementy.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy anatomii szyi w wysokoczęstotliwościowym USG (HFUS) w trybie B i power Doppler. (A, B) Obrazy w trybie B jamy ustnej, przedstawiające jamę ustną (BC) i język (T) z obrazowania najbliżej jamy nosowej. Trzy węzły chłonne szyjne znajdujące się po każdej stronie szyi (oznaczone jako M, żuchwowe; SM, podżuchwowe; SP, powierzchowne przyuszne) widoczne jako grupa struktur hipoechogenicznych w jednej płaszczyźnie obrazowania, jak pokazano na (B). (C) Tarczyca (Th) widoczna w górnym regionie klatki piersiowej, prezentująca się jako lita, echogeniczna struktura w kształcie motyla. Obrazy (A-C) wykonano przetwornikiem 40 MHz; pasek skali = 1 mm. (D, E) Reprezentatywne obrazy prawidłowych (D) i powiększonych (E) węzłów chłonnych szyjnych w trybie B i power Doppler (kolor czerwony). Linie przerywane obrysowują poszczególne węzły chłonne. Pasek skali = 0.5 mm.

Układ do biopsji pod kontrolą USG i procedura; wprowadzanie igły i analiza komórkowa w cytologii.
Rycina 4: Układ do biopsji węzła chłonnego szyjnego, obrazowanie i analiza cytospin materiału biopsyjnego. (A) Platforma obrazująca przedstawiająca mikroinżektor i umiejscowienie igły w pobliżu szyi myszy. Szeroki statyw na probówki do mikrocentryfugi (pomarańczowy blok) służy do lekkiego podniesienia platformy, co umożliwia prawidłowe umieszczenie igły, zachowując jednocześnie miejsce na stolik z silnikiem 3D. Taki układ minimalizuje czas poświęcony na usuwanie stolika silnikowego dla każdej myszy. (B-D) Obrazy HFUS całego obszaru szyi pobrane z nagrania wideo biopsji węzła chłonnego szyjnego z użyciem przetwornika 50 MHz. (B) Obraz HFUS w trybie B przedstawiający igłę umieszczoną z boku szyi przed biopsją. Końcówka igły to struktura hiperechogeniczna znajdująca się tuż poniżej pozycji prowadnicy igły (zielona przerywana linia) nałożonej podczas obrazowania w celu oznaczenia trajektorii igły. Węzeł chłonny znajduje się w centrum obrazu. Pasek skali = 1 mm. (C) Wprowadzenie igły do węzła chłonnego. (D) Biopsja węzła chłonnego szyjnego. (E) Powiększony obraz biopsji węzła chłonnego szyjnego. Pasek skali = 0.5 mm. (F) Analiza cytospin reprezentatywnego materiału z biopsji węzła chłonnego potwierdzająca prawidłowe wykonanie biopsji. Pasek skali = 100 µm.

Analiza obrazowania ultradźwiękowego, pomiar objętości 3D, system Vevo 2100, badanie obrazowania medycznego.
Rysunek 5: Analiza komputerowa trójwymiarowych obrazów węzłów chłonnych szyi. (A) Reprezentatywny zrzut ekranu węzła chłonnego analizowanego za pomocą oprogramowania komputerowego. Węzeł jest obryzowany na niebiesko; wyniki analizy pokazują objętość 3D (3D Volume) oraz procent unaczynienia (PV), jak wskazano. (B) Obraz widoku powierzchni tego samego węzła po analizie 3D. Przedstawia całą objętość węzła chłonnego na podstawie pomiarów wykonanych w punkcie A.

Dyskusja

Opisany protokół pozwala na wizualizację i ocenę in situ mysich węzłów chłonnych szyjnych za pomocą nieinwazyjnego obrazowania HFUS. Zastosowanie obrazowania dopplerowskiego w trybie B i mocy do wizualizacji morfologii, objętości i przepływu krwi w węzłach chłonnych szyjnych umożliwia eksperymentalną analizę przedklinicznych systemów modeli mysich podobnych do tych stosowanych do charakterystyki węzłów szyjnych pacjenta w praktyce klinicznej. Możliwość monitorowania węzłów chłonnych szyjki macicy za pomocą biopsji cienkoigłowej stanowi również przydatną technikę wykrywania zmian w komórkach odpornościowych i obecności obcych typów komórek lub bakterii podczas limfadenopatii wywołanych chorobą jamy ustnej u myszy. Łatwość użycia i niski koszt związany z HFUS pozwala na szybkie badanie przesiewowe stanu węzłów chłonnych szyjnych w szerokiej gamie modeli zwierzęcych.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest wstępna pomyślna identyfikacja węzłów chłonnych szyjnych na obrazach HFUS. Nasza placówka posiada asortyment przetworników HFUS zgodnie z opisem, dzięki czemu wykorzystaliśmy je do uzyskania najwyższej jakości obrazów. Jeśli jednak opisywane przez nas przetworniki są niedostępne, istnieje możliwość dostosowania obrazowania za pomocą innych przetworników. W tym celu wystarczy dostosować głębię i szerokość obrazu, aby uzyskać odpowiedni obraz. Rozdzielczość takich obrazów może się różnić, ale nadal powinno być możliwe uzyskanie obrazów wysokiej jakości za pomocą HFUS. Obrazowanie punktów orientacyjnych jamy ustnej i tarczycy znacznie pomoże w zorientowaniu użytkownika we właściwym regionie, w którym zlokalizowane są węzły chłonne. Charakterystyczny owalny, hipoechogeniczny charakter i powierzchowne położenie blisko powierzchni skóry pozwala na szybką potwierdzoną identyfikację węzłów chłonnych szyjnych w obrębie właściwej okolicy szyi. Podczas gdy wszystkie trzy węzły mogą być widoczne w jednej płaszczyźnie obrazowania (rysunek 3B), zazwyczaj jeden lub dwa węzły są rejestrowane podczas obrazowania. Można wprowadzić drobne korekty położenia przetwornika, aby uwidocznić różne płaszczyzny obrazowania, co pozwala na wizualizację wszystkich węzłów po jednej stronie szyjki.

Chociaż stwierdziliśmy, że opisana technika jest wiarygodna w identyfikacji węzłów chłonnych szyjnych, istnieją pewne ograniczenia w technice obrazowania i biopsji. Powierzchowny charakter węzłów chłonnych szyjnych myszy powoduje nadmierną ruchomość, gdy nawet niewielki nacisk jest wywierany na skórę przez głowicę głowicy. Można temu przeciwdziałać, powoli nakładając głowicę przetwornika do żelu ultradźwiękowego na szyi myszy, aż do zidentyfikowania obrazów orientacyjnych. Ruchomość węzłów chłonnych może również komplikować biopsję cienkoigłową, zwłaszcza w przypadku stosowania głowic w zakresie wyższej rozdzielczości (50 MHz). Wyśrodkowane obrazy węzłów chłonnych do biopsji są zwykle wypychane poza pole widzenia ze względu na siłę igły biopsyjnej potrzebnej do nakłucia leżącej nad nią skóry i torebki. Można temu zaradzić poprzez przesunięcie węzła chłonnego w kierunku wprowadzenia igły, zapewniając przestrzeń na przepchnięcie węzła chłonnego, ale nadal pozostając w polu widzenia podczas biopsji. Z naszego doświadczenia wynika, że węzły chłonne >10mm3 są bardzo trudne do biopsji i często są popychane przez igłę, a nie penetrowane podczas wprowadzania igły. Dlatego biopsja jest najlepiej zarezerwowana dla powiększonych węzłów chłonnych, których rozmiar wynosi >10 mm3 , aby zapewnić wystarczającą wielkość węzła docelowego i stabilność w odcinku szyjnym. Ponadto materiał biopsyjny może nie zawierać wystarczającej liczby komórek do zabiegów, w których wymagana jest większa liczba komórek (np. cytometria przepływowa).  

HFUS został wykorzystany do skutecznej wizualizacji ortotopowych guzów HNSCC25 i ma potencjał do monitorowania przerzutów do węzłów szyjnych u myszy z guzami jamy ustnej24. Oprócz ultradźwięków, obrazowanie bioluminescencyjne zostało również wykorzystane do wizualizacji ortotopowego tworzenia się guza jamy ustnej i przerzutów do węzłów chłonnych szyjnych u żywych myszy26,27. Jako alternatywne podejście, obrazowanie bioluminescencyjne ma wyraźną przewagę nad HFUS, ponieważ jest w stanie bezpośrednio określić ilościowo progresję guza i obciążenie przerzutami w czasie u tego samego zwierzęcia. Chociaż obrazowanie bioluminescencyjne jest niezaprzeczalnie przydatne, nie jest w stanie zmierzyć wielu parametrów wizualizowanych przez HFUS, w tym morfologii węzłów chłonnych, objętości węzłów chłonnych lub przepływu krwi. Obrazowanie bioluminescencyjne wymaga również specjalistycznych ciemnych pudełek do utrzymania myszy podczas obrazowania, co sprawia, że technika ta nie nadaje się do adaptacji do biopsji cienkoigłowej.

Co więcej, obrazowanie bioluminescencyjne wymaga produkcji komórek nowotworowych, które stabilnie wyrażają enzym lucyferazy, co pozwala na stosowanie tej techniki tylko w przypadkach ksenoprzeszczepów ortotopowych z komórkami nowotworowymi transfekowanymi lucyferazy u myszy z obniżoną odpornością lub z indukowalnymi specyficznymi tkankowo systemami transgenicznymi, które ograniczają ekspresję lucyferazy w sposób czasoprzestrzenny specyficzny dla tkanki pochodzenia nowotworowego. W przeciwieństwie do tego, HFUS może być stosowany w połączeniu z obrazami bioluminescencyjnymi w tych modelach, a także jest zdolny do obrazowania węzłów chłonnych szyjki macicy w modelach nowotworów jamy ustnej wywołanych przez czynniki rakotwórcze u myszy z kompletnym układem odpornościowym28,29. Podczas gdy HFUS może być bardziej przystosowany do większości mysich modeli raka jamy ustnej, połączone informacje, które można uzyskać z obrazowania bioluminescencji i HFUS w systemach, w których komórki nowotworowe wyrażają lucyferazy, mogą zapewnić pełniejszy obraz zajęcia węzłów chłonnych szyjnych niż każda z tych metod obrazowania osobno.

Zdolność do identyfikacji i wykrywania węzłów chłonnych szyjnych myszy w czasie rzeczywistym pozwala na stosowanie tej techniki w większości modeli chorób jamy ustnej, które skutkują zapalną limfadenopatią, w której zwierzę może być utrzymywane w pozycji odwróconej w krótkotrwałym znieczuleniu. Wykrycie przerzutów do węzłów chłonnych lub infekcji bakteryjnej i związany z tym wpływ na morfologię węzłów chłonnych u żywych zwierząt stanowi znaczącą korzyść w porównaniu z tradycyjnymi metodami, które wymagają usunięcia węzłów chłonnych od martwych zwierząt w celu przetworzenia histologicznego. Połączenie HFUS z biopsją cienkoigłową pozwala na przeprowadzanie rutynowej analizy patologicznej węzłów chłonnych szyjki macicy, podobnej do tej, która jest przeprowadzana w klinice, zapewniając ulepszoną metodę monitorowania postępu choroby w większości obecnych mysich modeli chorób jamy ustnej.

Oświadczenia

Koszty publikacji tego artykułu są sponsorowane przez Visual Sonics.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusz Dorothy D. Radford Endowment z West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Korzystanie z West Virginia University Animal Models and Imaging Facility (AMIF) oraz Microscopy Imaging Facility (MIF) (wspieranego przez Mary Babb Randolph Cancer Center i granty NIH P20 RR16440, P30 RR032138/GM103488 i S10 RR026378) jest z wdzięcznością doceniane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Vevo2100 System obrazowania mikroultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości, ze zintegrowanym oprogramowaniem w wersji 1.6.0VisualSonics, Toronto, Ontario, KanadaVS-11945
Power Dopper Mode i 3DMode VisualSonics, Toronto, Ontario, KanadaVS-11952; VS-11484
Kompaktowy system anestezjologiczny VevoVisualSonics, Toronto, Ontario, Kanada
Zintegrowany system szynowy Vevo z silnikiem 3D i mikromanipulatorem do wstrzykiwańVisualSonics, Toronto, Ontario, KanadaSA-11983
Podgrzewacz do żelu ThermasonicVisualSonics, Toronto, Ontario, KanadaOpcjonalnie
Przetworniki – MS-550D (Częstotliwość szerokopasmowa: 22 MHz - 55 MHz)VisualSonics, Toronto, Ontario, KanadaVS-11960Określany jako Przetwornik 40 MHz
– MS-700 (Częstotliwość szerokopasmowa: 30 MHz - 70 MHz)VisualSonics, Toronto, Ontario, KanadaVS-12026Określany jako przetwornik 50 MHz
Maść okulistycznaPatterson Veterinary07-888-1663
Żel elektrodowyParker Laboratories174-1525
TaśmaPrasa do sztuki medycznej174-153000
Produkty dokremu do depilacji
Waciki bawełnianeZaopatrzenie ogólne Gaza
Fisher Scientific22-037-907
Ogólne zaopatrzeniew wodę
Żel smarującyParker Laboratories57-05
Żel do ultradźwiękówParker Laboratories01-50
Stojak na probówki do mikrowirówekZaopatrzenie ogólneSłuży do podnoszenia platformy myszy w celu uzyskania optymalnej pozycji do biopsji
Igła 27 G i frac12 cala ze strzykawką 1 mlFisher Scientific14-826-87
ThinPrep PreservCyt SolutionHologic70097-002Określany jako podłoże do biopsji
Probówki do mikrowirówekOgólne zaopatrzenie
Procesor Thinprep 2000Cytyc, Marlborough, MANiebieski filtr
Olympus AX70 Provis MikroskopOlympus, Center Valley, PA
Carter

Bibliografia

  1. Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
  2. Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
  3. Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
  4. Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
  5. Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
  6. Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
  7. Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
  8. Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
  9. Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  10. Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
  11. El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
  12. Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
  13. Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
  14. Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
  15. Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
  16. Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
  17. Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797(2013).
  18. Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
  19. Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
  20. Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
  21. Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
  22. Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
  23. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
  24. Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185(2014).
  25. Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
  26. Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
  27. Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
  28. Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
  29. Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie w trybie Bobrazowanie Power Dopplerbiopsja pod kontrolą obrazowaniaobjętość węzła chłonnegorekonstrukcja 3Dbiopsja cienkoigłowamorfologia węzła chłonnegonakładanie żelu ultradźwiękowego
Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości węzłów chłonnych szyjnych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.