Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi

Zarówno nieprzekształcone (normalne), jak i przekształcone komórki mogą łatwo namnażać się w jednowarstwowej hodowli 2D. Ta forma przylegającego wzrostu komórek jest dość odmienna od tej, która występuje in vivo, gdzie przy braku stymulacji mitogennej komórki często nie dzielą się szybko w swoim mikrośrodowisku. Z drugiej strony test miękkiego agaru różni się od systemów hodowli 2D, ponieważ określa ilościowo rakotwórczość, mierząc zdolność komórki do namnażania się i tworzenia kolonii w zawiesinie w półstałym żelu agarozowym¹. W tym otoczeniu nieprzekształcone komórki nie są w stanie szybko się rozmnażać przy braku zakotwiczenia w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i ulegają apoptozie, procesowi znanemu jako anoikis. Natomiast komórki, które przeszły transformację złośliwą, tracą zależność od zakotwiczenia z powodu aktywacji szlaków sygnałowych, takich jak kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K)/Akt i Rac/Cdc42/PAK. Dlatego komórki te są w stanie rosnąć i tworzyć kolonie w półstałej miękkiej matrycy agarowej².

Powszechnym zastosowaniem miękkiego testu agarowego jest sprawdzenie, czy określone związki, takie jak inhibitory PADI, są w stanie zahamować wzrost guza in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, liczba kolonii lub rozmiary kolonii są ilościowymi odczytami z testu, które można porównać między grupami kontrolnymi i leczonymi w celu oceny różnic w rakotwórczości komórkowej. W związku z tym, jeśli okaże się, że tworzenie kolonii jest odwrotnie skorelowane ze wzrostem stężenia leku, można wyciągnąć wniosek, że lek jest skutecznym inhibitorem rakotwórczości in vitro. Z drugiej strony, jeśli lek nie wpływa na tworzenie kolonii, lek albo nie jest w odpowiedniej dawce, albo nie jest skutecznym inhibitorem rakotwórczym. Oprócz użycia miękkiego testu agarowego do zbadania przeciwnowotworowego działania leku, test ten może być również wykorzystany do zbadania związku między określonym genem a nowopowstaniem. Na przykład wpływ hamowania ekspresji PADI2 na rakotwórczość można rozwiązać za pomocą leczenia siRNA specyficznego dla PADI2.

PADI to zależne od wapnia enzymy, które po translacji modyfikują białka poprzez przekształcanie dodatnio naładowanych reszt argininy w neutralnie naładowaną cytrulinę w procesie znanym jako cytrulinacja lub deiminacja^3-5. Niedawno odkryliśmy, że deiminaza peptydyloargininy 2 (PADI2) może funkcjonować jako nowy biomarker raka piersi i że inhibitory PADI stanowią potencjalne terapie we wczesnym stadium raka piersi⁶. Na przykład, wcześniej wykazaliśmy, że inhibitor "pan-PADI", Cl-amidyna, hamuje proliferację komórek raka piersi za pomocą monowarstw 2D i że inhibitor hamuje wzrost sferoid guza 3D⁶. W tym raporcie rozszerzamy te badania i podkreślamy użyteczność testu z miękkim agarem, testując skuteczność nowego inhibitora PADI, BB-CLA, w hamowaniu wzrostu MCF10DCIS kolonii raka piersi⁷. Zwracamy uwagę, że użyliśmy komórek MCF10DCIS w tym eksperymencie, ponieważ są one onkogennymi pochodnymi nieprzekształconych ludzkich komórek MCF10A i ponieważ zawierają wysokie poziomy białka PADI2⁸ w stanie stacjonarnym. Stawiamy hipotezę, że aktywność enzymatyczna PADI2 odgrywa kluczową rolę w rakotwórczości tej linii komórkowej i że hamowanie aktywności PADI2 za pośrednictwem BB-CLA zahamuje postęp raka.

1. Przygotowanie 3% agarozy 2-hydroksyetylowej

1. Do czystej, suchej szklanej butelki o pojemności 100 ml dodaj 0,9 g 2-hydroksyetyloagarozy (Agaroza VII), a następnie 30 ml wody destylowanej.
2. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund i delikatnie zamieszaj. Powtórz ten krok jeszcze co najmniej trzy razy, aż proszek agarozy całkowicie się rozpuści.
3. Butelkę z roztworem należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut.
4. Odczekać, aż roztwór agarozy ostygnie do temperatury pokojowej przed dalszym użyciem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie dolnej warstwy: 0,6% żelu agarozowego

1. W inkubatorze o temperaturze 37 °C należy wstępnie rozgrzać kilka pipet o pojemności 5 ml i 10 ml, aby zapobiec zastyganiu agarozy w pipecie podczas obsługi.
2. Częściowo poluzuj pokrywkę butelki i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przygotowany 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund. Następnie delikatnie obracaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund. UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wirowania roztworu agarozy, ponieważ roztwór unosi się pod wpływem powietrza i może się rozlać.
3. Jeśli w butelce znajdują się resztki stałego żelu, podgrzewaj w kuchence mikrofalowej jeszcze przez kilka sekund.
4. Przechowywać butelkę zawierającą roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C podczas następnych czynności, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu agarozy.
5. Ciepłe podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Uwaga: MCF10DCIS pożywka składa się z DMEM/F12, 5% surowicy końskiej, 5% penicyliny streptomycyny.
6. Przenieść 3 ml 3% roztworu agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
7. Natychmiast dodaj 12 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS i delikatnie odwróć stożkową rurkę, aby wymieszać agarozę z podłożem. Staraj się nie tworzyć żadnych pęcherzyków, ponieważ będzie to przeszkadzać w późniejszym liczeniu kolonii.
8. Delikatnie dodać 2 ml tej mieszaniny do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej, nie tworząc żadnych pęcherzyków powietrza.
9. Inkubować 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, aby mieszanina mogła się zestalić.
10. Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut. Dolna warstwa jest teraz gotowa do użycia.

3. Przygotowanie warstwy zawierającej komórkę: 0,3% żel agarozowy

1. Trypsynizować MCF10DCIS komórki i rozcieńczyć je do stężenia komórek 4 x 10⁴ / ml.
2. Pobrać 2 ml 3% agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet i przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
3. Natychmiast dodaj 8 ml pożywki MCF10DCIS do stożkowej probówki i delikatnie odwróć, aby wymieszać agarozę z podłożem. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.
4. Pobrać 2 ml komórek MCF10DCIS (4 x 10 4 /ml) i potraktować BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).
5. W rozcieńczeniu 1:1 wymieszać komórki z 0,6% agarozą.
6. Pobrać 1 ml mieszaniny komórka i agaroza i delikatnie dodać na dolną warstwę 6-dołkowej płytki hodowlanej (2 x 10⁴ komórki/ml).
7. Umieścić 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zestalenie się wierzchniej warstwy.
8. Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na tydzień przed dodaniem warstwy zasilającej.

4. Przygotowanie warstwy zasilającej: 0,3% żel agarozowy

1. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej gotowy 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund, delikatnie obracaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund.
2. Zrównoważyć butelkę z roztworem agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.
3. Ogrzej podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Wymieszać 1 ml 3% roztworu agarozy z 9 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie odwrócić, aby wymieszać agarozę z pożywką. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
5. Mieszaninę należy poddać działaniu BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).
6. Delikatnie dodać 1 ml tej mieszaniny (bez tworzenia pęcherzyków) do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej dolną i miękką warstwę.
7. Umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby mieszanina mogła się zestalić.
8. Po zestaleniu się warstwy zasilającej umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
9. Powtarzaj tę procedurę karmienia co tydzień, nakładając 1 ml 0,3% roztworu agarozy/pożywki/roztworu do leczenia na istniejącą warstwę zasilającą, aby uzupełnić komórki nową pożywką, aż do zaobserwowania tworzenia kolonii. Uwaga: Agar w warstwach miękkich i karmiących jest bardzo miękki, dlatego dodane składniki odżywcze z warstwy zasilającej łatwo dyfundują do warstwy zawierającej komórki, aby dotrzeć do komórek.

5. Gromadzenie danych

1. Po 2,5 tygodnia wzrostu komórek w miękkim agarze policz liczbę kolonii w każdym dołku za pomocą mikroskopu świetlnego. Aby ułatwić kwantyfikację, wydrukuj siatkę na folii przezroczystej i przymocuj siatkę do płytki 6-dołkowej, aby pomóc zlokalizować miejsca, w których znajdują się komórki podczas liczenia. Ponieważ wielkość kolonii (określana ilościowo przez średnicę każdej kolonii) będzie się różnić, wstępnie zdefiniuj referencyjną wielkość kolonii, aby określić, które kolonie zostaną ocenione. Na przykład w analizie danych należy uwzględnić rozmiary kolonii 70 μm lub większe.
2. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się kolonii i do przyszłego liczenia. Uszczelnij 6-dołkową płytkę hodowlaną za pomocą Parafilm, aby zapobiec wysychaniu żeli.

Test tworzenia miękkich kolonii agarowych może być używany do szerokiego zakresu zastosowań dokumentujących rakotwórczość komórek rakowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że półstała matryca selektywnie sprzyja wzrostowi komórek, które mogą namnażać się w sposób niezależny od zakotwiczenia. Ta cecha jest wykazywana głównie przez komórki rakowe, ale nie przez normalne komórki. Używamy tej techniki przede wszystkim do testowania skuteczności hamowania wzrostu guza przez leki oraz do testowania wpływu nadekspresji lub wyczerpania naszych interesujących nas genów, w tym genów PADI, na rakotwórczość komórek raka piersi. Tutaj oceniliśmy wpływ BB-CLA na rakotwórcze hamowanie komórek MCF10DCIS z nadekspresją PADI2 (ryc. 1 i 2).

Wyniki pokazują, że BB-CLA znacząco hamuje tworzenie MCF10DCIS kolonii komórkowych. Rysunek 3 pokazuje, że w obecności inhibitora PADI nastąpiło zmniejszenie zarówno tworzenia kolonii, jak i wielkości kolonii w porównaniu z kontrolą DMSO. [Uwaga: BB-CLA został rozpuszczony w DMSO, a zatem DMSO został użyty jako kontrola.] Wielkość kolonii dla komórek MCF10DCIS traktowanych BB-CLA mieściła się głównie w zakresie od 20 do 100 μm, podczas gdy wielkość kolonii dla kontroli DMSO wykazywała większy zakres od 70 do 150 μm po 2,5 tygodnia wzrostu.

Kolonie większe niż 70 μm zostały policzone i przeanalizowane (Rysunek 4). W grupie kontrolnej DMSO było średnio 3,536 kolonii, podczas gdy tylko 1,967 kolonii zaobserwowano w grupie leczonej BB-CLA po 2,5 tygodnia miękkiej hodowli agaru. Stanowi to 44% spadek średniego tworzenia kolonii w obecności 1 μM BB-CLA, co wskazuje na znaczne rakotwórcze hamowanie komórek raka piersi (komórek MCF10DCIS) przez inhibitor PADI.

Rysunek 1. Struktura chemiczna BB-CLA.

Rysunek 2. Schematyczny przegląd protokołu testu tworzenia kolonii miękkiego agaru. Każdy studzienek z 6-dołkowych płytek hodowlanych został najpierw pokryty 0,6% żelem agarozowym (dolna warstwa). Mieszanina 0,3% żelu agarozowego zawierająca MCF10DCIS komórki i inhibitor BB-CLA (1 μM) lub DMSO (kontrola) została następnie nałożona na 0,6% żel. Raz w tygodniu na miękką warstwę nakładano mieszaninę 0,3% żelu agarozowego (zawierającą BB-CLA). Po 2 do 4 tygodniach zaobserwowano tworzenie kolonii i zliczono je do analizy danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3.Obrazy tworzenia kolonii w komórkach MCF10DCIS traktowanych BB-CLA. MCF10DCIS komórki hodowano w miękkim agarze w obecności (1 μM BB-CLA) lub bez obecności BB-CLA (0 μM DMSO). Po 2,5 tygodnia kolonie obrazowano za pomocą mikroskopu odwróconego w przypadku obrazów o małym powiększeniu i mikroskopu świetlnego w przypadku obrazów o dużym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Kwantyfikacja liczby kolonii MCF10DCIS po leczeniu BB-CLA. MCF10DCIS komórki hodowano w miękkim agarze o różnych stężeniach BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM BB-CLA). Po 2,5 tygodnia policzono pojedyncze kolonie większe niż 70 μm. Eksperymenty powtórzono 4 razy (n = 4). Istotność statystyczna całkowitej różnicy w liczbie komórek między próbką kontrolną a badaną określono za pomocą testu t Studenta dla dwóch prób (*p < 0,005).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.