Tutaj dokumentujemy użycie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do testowania wpływu inhibitora enzymu deiminazy peptydyloargininowej (PADI), BB-Cl-amidyny, na rak piersi rak piersi w badaniach in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biorąc pod uwagę trudności w badaniu mechanizmów progresji nowotworu in vivo, testy oparte na komórkach, takie jak test tworzenia miękkiego kolonii agaru (dalej nazywany miękkim testem agarowym), który mierzy zdolność komórek do proliferacji w półstałych matrycach, pozostają znakiem rozpoznawczym badań nad rakiem. Kluczową zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi jednowarstwowymi lub sferoidalnymi testami hodowli komórek sferoidalnych 2D jest ścisła mimikra środowiska komórkowego 3D do tego obserwowanego in vivo. Co ważne, test z miękkim agarem stanowi również idealne narzędzie do rygorystycznego testowania wpływu nowych związków lub warunków leczenia na proliferację i migrację komórek. Dodatkowo test ten umożliwia ilościową ocenę potencjału transformacji komórek w kontekście zaburzeń genetycznych. Niedawno zidentyfikowaliśmy deiminazę peptydyloargininy 2 (PADI2) jako potencjalny biomarker raka piersi i cel terapeutyczny. W tym miejscu podkreślamy użyteczność testu z miękkim agarem w przedklinicznych badaniach przeciwnowotworowych poprzez testowanie wpływu inhibitora PADI, BB-Cl-amidyny (BB-CLA), na rakotwórczość ludzkich komórek raka przewodowego in situ (MCF10DCIS).
Wprowadzenie
Zarówno nieprzekształcone (normalne), jak i przekształcone komórki mogą łatwo namnażać się w jednowarstwowej hodowli 2D. Ta forma przylegającego wzrostu komórek jest dość odmienna od tej, która występuje in vivo, gdzie przy braku stymulacji mitogennej komórki często nie dzielą się szybko w swoim mikrośrodowisku. Z drugiej strony test miękkiego agaru różni się od systemów hodowli 2D, ponieważ określa ilościowo rakotwórczość, mierząc zdolność komórki do namnażania się i tworzenia kolonii w zawiesinie w półstałym żelu agarozowym1. W tym otoczeniu nieprzekształcone komórki nie są w stanie szybko się rozmnażać przy braku zakotwiczenia w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i ulegają apoptozie, procesowi znanemu jako anoikis. Natomiast komórki, które przeszły transformację złośliwą, tracą zależność od zakotwiczenia z powodu aktywacji szlaków sygnałowych, takich jak kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K)/Akt i Rac/Cdc42/PAK. Dlatego komórki te są w stanie rosnąć i tworzyć kolonie w półstałej miękkiej matrycy agarowej2.
Powszechnym zastosowaniem miękkiego testu agarowego jest sprawdzenie, czy określone związki, takie jak inhibitory PADI, są w stanie zahamować wzrost guza in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, liczba kolonii lub rozmiary kolonii są ilościowymi odczytami z testu, które można porównać między grupami kontrolnymi i leczonymi w celu oceny różnic w rakotwórczości komórkowej. W związku z tym, jeśli okaże się, że tworzenie kolonii jest odwrotnie skorelowane ze wzrostem stężenia leku, można wyciągnąć wniosek, że lek jest skutecznym inhibitorem rakotwórczości in vitro. Z drugiej strony, jeśli lek nie wpływa na tworzenie kolonii, lek albo nie jest w odpowiedniej dawce, albo nie jest skutecznym inhibitorem rakotwórczym. Oprócz użycia miękkiego testu agarowego do zbadania przeciwnowotworowego działania leku, test ten może być również wykorzystany do zbadania związku między określonym genem a nowopowstaniem. Na przykład wpływ hamowania ekspresji PADI2 na rakotwórczość można rozwiązać za pomocą leczenia siRNA specyficznego dla PADI2.
PADI to zależne od wapnia enzymy, które po translacji modyfikują białka poprzez przekształcanie dodatnio naładowanych reszt argininy w neutralnie naładowaną cytrulinę w procesie znanym jako cytrulinacja lub deiminacja3-5. Niedawno odkryliśmy, że deiminaza peptydyloargininy 2 (PADI2) może funkcjonować jako nowy biomarker raka piersi i że inhibitory PADI stanowią potencjalne terapie we wczesnym stadium raka piersi6. Na przykład, wcześniej wykazaliśmy, że inhibitor "pan-PADI", Cl-amidyna, hamuje proliferację komórek raka piersi za pomocą monowarstw 2D i że inhibitor hamuje wzrost sferoid guza 3D6. W tym raporcie rozszerzamy te badania i podkreślamy użyteczność testu z miękkim agarem, testując skuteczność nowego inhibitora PADI, BB-CLA, w hamowaniu wzrostu MCF10DCIS kolonii raka piersi7. Zwracamy uwagę, że użyliśmy komórek MCF10DCIS w tym eksperymencie, ponieważ są one onkogennymi pochodnymi nieprzekształconych ludzkich komórek MCF10A i ponieważ zawierają wysokie poziomy białka PADI28 w stanie stacjonarnym. Stawiamy hipotezę, że aktywność enzymatyczna PADI2 odgrywa kluczową rolę w rakotwórczości tej linii komórkowej i że hamowanie aktywności PADI2 za pośrednictwem BB-CLA zahamuje postęp raka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie 3% agarozy 2-hydroksyetylowej
- Do czystej, suchej szklanej butelki o pojemności 100 ml dodaj 0,9 g 2-hydroksyetyloagarozy (Agaroza VII), a następnie 30 ml wody destylowanej.
- Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund i delikatnie zamieszaj. Powtórz ten krok jeszcze co najmniej trzy razy, aż proszek agarozy całkowicie się rozpuści.
- Butelkę z roztworem należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut.
- Odczekać, aż roztwór agarozy ostygnie do temperatury pokojowej przed dalszym użyciem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie dolnej warstwy: 0,6% żelu agarozowego
- W inkubatorze o temperaturze 37 °C należy wstępnie rozgrzać kilka pipet o pojemności 5 ml i 10 ml, aby zapobiec zastyganiu agarozy w pipecie podczas obsługi.
- Częściowo poluzuj pokrywkę butelki i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przygotowany 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund. Następnie delikatnie obracaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund. UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wirowania roztworu agarozy, ponieważ roztwór unosi się pod wpływem powietrza i może się rozlać.
- Jeśli w butelce znajdują się resztki stałego żelu, podgrzewaj w kuchence mikrofalowej jeszcze przez kilka sekund.
- Przechowywać butelkę zawierającą roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C podczas następnych czynności, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu agarozy.
- Ciepłe podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Uwaga: MCF10DCIS pożywka składa się z DMEM/F12, 5% surowicy końskiej, 5% penicyliny streptomycyny.
- Przenieść 3 ml 3% roztworu agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Natychmiast dodaj 12 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS i delikatnie odwróć stożkową rurkę, aby wymieszać agarozę z podłożem. Staraj się nie tworzyć żadnych pęcherzyków, ponieważ będzie to przeszkadzać w późniejszym liczeniu kolonii.
- Delikatnie dodać 2 ml tej mieszaniny do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej, nie tworząc żadnych pęcherzyków powietrza.
- Inkubować 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, aby mieszanina mogła się zestalić.
- Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut. Dolna warstwa jest teraz gotowa do użycia.
3. Przygotowanie warstwy zawierającej komórkę: 0,3% żel agarozowy
- Trypsynizować MCF10DCIS komórki i rozcieńczyć je do stężenia komórek 4 x 104 / ml.
- Pobrać 2 ml 3% agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet i przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Natychmiast dodaj 8 ml pożywki MCF10DCIS do stożkowej probówki i delikatnie odwróć, aby wymieszać agarozę z podłożem. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.
- Pobrać 2 ml komórek MCF10DCIS (4 x 10 4 /ml) i potraktować BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).
- W rozcieńczeniu 1:1 wymieszać komórki z 0,6% agarozą.
- Pobrać 1 ml mieszaniny komórka i agaroza i delikatnie dodać na dolną warstwę 6-dołkowej płytki hodowlanej (2 x 104 komórki/ml).
- Umieścić 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zestalenie się wierzchniej warstwy.
- Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na tydzień przed dodaniem warstwy zasilającej.
4. Przygotowanie warstwy zasilającej: 0,3% żel agarozowy
- Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej gotowy 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund, delikatnie obracaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund.
- Zrównoważyć butelkę z roztworem agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.
- Ogrzej podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Wymieszać 1 ml 3% roztworu agarozy z 9 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie odwrócić, aby wymieszać agarozę z pożywką. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
- Mieszaninę należy poddać działaniu BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).
- Delikatnie dodać 1 ml tej mieszaniny (bez tworzenia pęcherzyków) do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej dolną i miękką warstwę.
- Umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby mieszanina mogła się zestalić.
- Po zestaleniu się warstwy zasilającej umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Powtarzaj tę procedurę karmienia co tydzień, nakładając 1 ml 0,3% roztworu agarozy/pożywki/roztworu do leczenia na istniejącą warstwę zasilającą, aby uzupełnić komórki nową pożywką, aż do zaobserwowania tworzenia kolonii. Uwaga: Agar w warstwach miękkich i karmiących jest bardzo miękki, dlatego dodane składniki odżywcze z warstwy zasilającej łatwo dyfundują do warstwy zawierającej komórki, aby dotrzeć do komórek.
5. Gromadzenie danych
- Po 2,5 tygodnia wzrostu komórek w miękkim agarze policz liczbę kolonii w każdym dołku za pomocą mikroskopu świetlnego. Aby ułatwić kwantyfikację, wydrukuj siatkę na folii przezroczystej i przymocuj siatkę do płytki 6-dołkowej, aby pomóc zlokalizować miejsca, w których znajdują się komórki podczas liczenia. Ponieważ wielkość kolonii (określana ilościowo przez średnicę każdej kolonii) będzie się różnić, wstępnie zdefiniuj referencyjną wielkość kolonii, aby określić, które kolonie zostaną ocenione. Na przykład w analizie danych należy uwzględnić rozmiary kolonii 70 μm lub większe.
- Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się kolonii i do przyszłego liczenia. Uszczelnij 6-dołkową płytkę hodowlaną za pomocą Parafilm, aby zapobiec wysychaniu żeli.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Test tworzenia kolonii w miękkim agarze może być stosowany w szerokim zakresie zastosowań dokumentujących potencjał nowotworowy komórek rakowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że półstała matryca selektywnie sprzyja wzrostowi komórek, które mogą proliferować w sposób niezależny od podłoża. Cecha ta jest przejawiana głównie przez komórki nowotworowe, a nie przez komórki prawidłowe. Technikę tę wykorzystujemy przede wszystkim do badania skuteczności hamowania wzrostu guza przez leki oraz do testowania wpływu nadekspr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Szybkość tworzenia kolonii w miękkim agarze różni się w zależności od typu komórki9. Dlatego liczba komórek, od których należy zacząć, powinna być zoptymalizowana i odpowiednio dostosowana. Sugerowany zakres początkowy wynosi od 5 x 102 do 1 x 104 komórek na studzienkę przy użyciu płytki 6-dołkowej. Ponadto wielkość kolonii różni się w zależności od tempa wzrostu każdej komórki. W związku z tym potrzebna jest predefiniowana wartość graniczna dla wielkości kolonii, aby oznaczyć poszczególn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni dr Richardowi Cerione, dr Marcowi Antonyakowi i Kelly Sullivan z Cornell University za udzielenie porad technicznych, a także dr Gerlinde Van de Walle z Cornell University za udostępnienie ich odwróconego mikroskopu Olympus CKX41.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop odwrócony Zeiss Axiopot | Carl Zeiss 1021859251Mikroskopia | ||
| Olympus | CKX41 | ||
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| Surowica koni dawcy hyklonów | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicylina Streptomycyna | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-hydroksyetyloagaroza: Typ VII, niska temperatura żelowania | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
Bibliografia
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343(2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500(2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
