Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych. Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wapń jest bardzo ważnym regulatorem wielu procesów fizjologicznych w tkankach naczyniowych. Większość funkcji śródbłonka i mięśni gładkich w dużym stopniu zależy od zmian wewnątrzkomórkowego wapnia ([Ca2 + ]i) i tlenku azotu (NO). Aby zrozumieć, w jaki sposób [Ca2 +] i, NO i cząsteczki znajdujące się dalej są obsługiwane przez naczynie krwionośne w odpowiedzi na leki zwężające naczynia krwionośne i rozszerzające naczynia krwionośne, opracowaliśmy nową technikę, która stosuje barwniki znakujące wapń (lub znakowanie NO) za pomocą dwóch mikroskopii fotonowych w celu zmierzenia obchodzenia się z wapniem (lub produkcji NO) w izolowanych naczyniach krwionośnych. Opisano tutaj szczegółową procedurę krok po kroku, która pokazuje, jak wyizolować aortę od szczura, oznaczyć wapń lub NO w komórkach śródbłonka lub mięśni gładkich oraz zobrazować stany przejściowe wapnia (lub produkcję NO) za pomocą mikroskopu dwufotonowego po bodźcach fizjologicznych lub farmakologicznych. Korzyści płynące ze stosowania tej metody są wielorakie: 1) możliwy jest jednoczesny pomiar stanów przejściowych wapnia zarówno w komórkach śródbłonka, jak i komórkach mięśni gładkich w odpowiedzi na różne bodźce; 2) pozwala na obrazowanie komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich w ich naturalnym otoczeniu; 3) metoda ta jest bardzo czuła na wewnątrzkomórkowe zmiany wapnia lub NO i generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości do precyzyjnych pomiarów; oraz 4) opisane podejście można zastosować do pomiaru innych cząsteczek, takich jak reaktywne formy tlenu. Podsumowując, zastosowanie mikroskopii emisyjnej z dwoma laserami fotonowymi do monitorowania stanów przejściowych wapnia i produkcji NO w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanego naczynia krwionośnego dostarczyło wysokiej jakości danych ilościowych i przyczyniło się do lepszego zrozumienia mechanizmów regulujących funkcję naczyń krwionośnych.
Wprowadzenie
Wapń jest podstawowym drugim przekaźnikiem w komórkach naczyniowych, takich jak śródbłonek i komórki mięśni gładkich. Jest głównym bodźcem do skurczu naczyń krwionośnych i odgrywa główną rolę w rozszerzaniu naczyń, w tym w jego skutkach poprzez wytwarzanie NO w śródbłonku. Ze względu na ograniczenia technologii obrazowania, praktycznie niemożliwe było zaobserwowanie obchodzenia się z wapniem w nienaruszonym naczyniu. Opracowanie dwóch systemów obrazowania fotonów i stworzenie nowych barwników znakujących wapń lub NO umożliwia obrazowanie na wystarczającej głębokości i rozdzielczości, aby zacząć rozumieć dynamikę wapnia i produkcję NO w układzie naczyniowym.
Mikroskopia dwufotonowa została ostatnio zastosowana w badaniach tkanek, organów, a nawet całych zwierząt, ze względu na jej doskonałą zdolność do głębokiej penetracji tkanek o niskiej fluorescencji tła i wysokiej czułości sygnału. 1,2 Wąskie spektrum wzbudzenia dwóch fotonów w ognisku oświetlenia oraz zastosowanie detektorów bez deskanowania są powodami, dla których mikroskopia dwufotonowa jest lepsza od tradycyjnej mikroskopii konfokalnej. Mikroskopia konfokalna nie jest w stanie uzyskać wysokiej jakości obrazów na wymaganej głębokości tkanki ze względu na autofluorescencję i rozpraszanie nieostrego światła do konfokalnego otworka. W związku z tym opracowaliśmy metodę wykorzystującą mikroskop dwufotonowy do pomiaru sygnalizacji [Ca2 +] i produkcji NO w nienaruszonych, pojedynczych komórkach naczyń krwionośnych z wysoką rozdzielczością i niskim stosunkiem sygnału do szumu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury eksperymentalne opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Medical College of Wisconsin i były zgodne z National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Izolacja aorty szczurzej
- Znieczulenie szczurów izofluranem (5% indukcji, 1,5% konserwacji) lub inną metodą zatwierdzoną przez IACUC.
- Ułóż szczura w pozycji leżącej. W celu odsłonięcia narządów jamy brzusznej należy wykonać małe brzuszne nacięcie linii środkowej przez skórę i podskórną tkankę brzuszną. Za pomocą gazików delikatnie odchyl jelita, aby odsłonić aortę i żyłę główną, jak pokazano na rysunku 1.
- Krótko, tępo wypreparuj aortę z tkanki łącznej i żyły głównej. Za pomocą szwu zawiąż aortę jak najbliżej nerki. Wyciąć około 1 - 2 cm aorty i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej normalny roztwór soli fizjologicznej (PSS; w mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 KCl, 6 Glukoza, 10 HEPES) na lodzie.
- Po wyizolowaniu aorty należy poddać zwierzę eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC. Po zakończeniu wszystkich procedur niemających na celu przeżycia należy poddać eutanazji głęboko znieczulone zwierzęta poprzez torakotomię wywołującą odmę opłucnową, aby zapewnić humanitarną śmierć zwierzęcia. 3
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego, kleszczyków z cienką końcówką i mikronożyczek wypreparuj tłuszcz i tkankę łączną z aorty. Gdy aorta jest czysta, przetnij aortę wzdłużnie i umieść ją w PSS na lodzie na później.
2. Ładowanie barwnika i inkubacja
- Odpipetować 7 μl 1 mM barwnika Fluo-4 AM, który jest dostarczany w roztworze na bazie DMSO, do pojedynczych probówek o pojemności 500 μl, które zostały pokryte folią aluminiową. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C, aby zachować właściwości barwnika przez długi czas. Uwaga: te poddane roztwory powinny być stabilne przez co najmniej sześć miesięcy.
- Przed użyciem poczekaj, aż roztwory barwnika rozgrzeją się do temperatury RT przed otwarciem. Przygotuj roztwory robocze bezpośrednio przed użyciem. Nie przechowywać rozcieńczonego odczynnika do późniejszego użycia.
- Dodać 7 μl gotowego 1 mM barwnika Fluo-4 AM rozpuszczonego w roztworze DMSO do 450 ul PSS niezawierającego wapnia. Dodaj 40 μl 10% roztworu kwasu pluronowego na bazie DMSO do koktajlu ładującego, aby pomóc w rozproszeniu estrów acetoksymetylowych (AM) i poprawić ładowanie barwnika wapniowego.
- Umieścić rozcięte aorty w probówkach o objętości 500 μl zawierających koktajl ładujący (jak opisano w ppkt 2.3) na 1 godzinę. Przykryć wszystkie probówki folią i umieścić na obracającym się wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
- Aby monitorować produkcję NO w układzie naczyniowym, użyj barwnika diacetaniowego DAF-FM. Inkubować aortę w roztworze zawierającym 450 μl PSS, 40 μl kwasu pluronowego i 5 μl 10 mM dioctanu DAF-FM. Podobnie jak w protokole inkubacji wapnia (opisanym w ppkt 2.3), umieścić aortę w probówce o objętości 500 μl zawierającej roztwór barwnika NO, pokrytej folią, i umieścić na obracającej się wytrząsarce na 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przez następne 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Gdy mierzona jest produkcja NO, użyj śródbłonkowego blokera syntazy NO, L-NAME, aby zablokować produkcję NO jako kontrolę, jak pokazano na rysunku 4B. W celu przeprowadzenia tej procedury dodać do koktajlu (zgodnie z opisem w ppkt 2.5) 100 nM L-NAME przez ostatnie 30 minut inkubacji (w temperaturze suchej masy).
3. Protokół skanowania laserowego z dwoma mikroskopami fotonowymi
- Po 1 godzinie inkubacji przemyj aortę 2 - 3 razy w czystym PSS, aby usunąć barwnik zewnątrzkomórkowy.
- Przenieść aortę do naczynia pokrytego silikonem zawierającego normalny bufor wolny od PSS lub Ca2+ (w zależności od protokołu eksperymentalnego). Przypnij aortę do powłoki silikonowej z przydanką stykającą się z silikonem (tj. światłem śródbłonka wystawionym na otwór naczynia) za pomocą szpilek w kształcie μ. Alternatywnie, użyj siatki Slice Anchor lub kleju, aby przymocować chusteczkę.
Uwaga: Aby zmniejszyć naprężenia i możliwe artefakty mechaniczne, przenieś i unieruchom aortę w roztworze wolnym od Ca2+ i odczekaj 5 - 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. - Podłączyć pompę perystaltyczną lub strzykawkę do płytki pokrytej silikonem w celu automatycznego lub ręcznego podawania leków lub zmiany roztworu zewnątrzkomórkowego.
- Umieść czaszę pod końcówką nosową pionowego mikroskopu dwufotonowego, a następnie zainstaluj i umieść soczewkę obiektywu zanurzeniowego w wodzie o kącie 25× (N.A. 1.05 i odległość robocza 2 mm) nad preparatem. Uwaga: Jeśli ten konkretny obiektyw nie jest dostępny, użyj obiektywu wyprodukowanego specjalnie do obrazowania dwufotonowego, ponieważ może on znacznie zwiększyć rozdzielczość sygnału w porównaniu ze zwykłym obiektywem.
- Aktywuj laser dwufotonowy za pomocą oprogramowania (laser zacznie pompować i włączać się). Dostosuj wzbudzenie lasera do 820 nm.
- Za pomocą epifluorescencji zlokalizuj aortę i skup obiektyw na powierzchni śródbłonka za pomocą zgrubnej regulacji.
- Przełącz mikroskop w tryb skanowania laserem fotonowym, upewniając się, że laser wzbudzający jest zablokowany w trybie, detektory nieoczyszczone są włączone i zainstalowane są filtry emisyjne odpowiednie do oczekiwanych widm emisji. Uwaga: W tym przypadku zastosowano FV10-MRL/R (495 do 540 nM).
- Rozpocznij skanowanie na żywo przy użyciu około 5% mocy lasera i precyzyjnie ustaw ostrość obiektywu, aby uwidocznić komórki śródbłonka.
Uwaga: Komórki śródbłonka będą wykazywać silny sygnał fluorescencyjny podczas inkubacji w normalnym PSS. Będzie to zauważalnie słabsze, gdy naczynia będą inkubowane w buforze bezwapniowym. Komórki śródbłonka będą obecne na szczycie otwartej aorty, a komórki mięśni gładkich można zobaczyć tuż poniżej komórek śródbłonka (patrz ryc. 2). Ponieważ naczynia krwionośne nie są ani gładkie, ani równe, będą miejsca, w których obecne są zarówno komórki mięśni gładkich, jak i komórki śródbłonka. - Gdy komórki są już ostre, zaprogramuj oprogramowanie mikroskopu tak, aby zbierało sekwencyjne obrazy w trybie szybkiego skanowania (skanowanie rastrowe, okno 512 x 512 pikseli z częstotliwością zbierania klatek 1,1 s). Równolegle z fluorescencją Fluo-4 AM zbieraj obrazy w świetle przechodzącym w celu wykrycia zmian w skurczu naczyń i lepszej wizualizacji warunków eksperymentalnych.
- Po zebraniu podstawowych obrazów sygnałowych należy zmienić stężenie jonów Ca2+ w roztworze zewnętrznym lub powoli stosować środki bodźców farmakologicznych za pomocą pompy perystaltycznej podczas obrazowania. Obserwuj wzrost sygnału fluorescencyjnego w załadowanych komórkach.
Uwaga: Komórki śródbłonka reagują na zmiany przepływu, dlatego zaleca się stosowanie aplikacji niskolaminarnych i testów nośników przed zastosowaniem farmakologicznych aktywatorów sygnalizacjiCa2+ lub NO. Aby ponownie obliczyć wewnątrzkomórkowe wartości stężenia wapnia do nM w naczyniach obciążonych Fluo-4 (stała dysocjacji dla Fluo-4 wynosi 345 nM), intensywność fluorescencji można zarejestrować na początku i po dodaniu jonomycyny i MnCl2. 4
4. Przetwarzanie obrazów i obliczenia
- Pobierz i zainstaluj pakiet do przetwarzania obrazu Fidżi.
- Otwórz plik obrazu w Fidżi. Po zaimportowaniu pliku podziel kanały (światło przepuszczane i sygnał fluorescencyjny), gdy zostaniesz o to poproszony. Do analizy danych należy używać wyłącznie sygnału fluorescencyjnego.
- W programie Fidżi kliknij kartę analizy i przewiń w dół do opcji narzędzi. W opcji narzędzi znajdź zakładkę z napisem Menedżer ROI i kliknij ją; Pojawi się nowe okno.
- Następnie kliknij ustaw pomiary w zakładce analiza. Wybierz konkretne pomiary, które Cię interesują. W przypadku pomiarów stanów przejściowych wapnia należy użyć opcji średniej wartości szarości.
- Za pomocą narzędzia do śledzenia cyklicznego zacznij śledzić obszary zainteresowania (ROI) i kliknij "dodaj" na ekranie menedżera ROI dla każdego ROI. Po prześledzeniu wszystkich interesujących Cię komórek, w oknie menedżera ROI wybierz opcję Multi Measure w zakładce "więcej". Pamiętaj, aby zapisać pomiary bezpośrednio lub skopiować i wkleić wszystkie te pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
- Otwórz plik *.txt lub arkusz kalkulacyjny Excel z Fidżi i przenieś liczby do nowego arkusza Origin. Uwaga: Alternatywnie użyj dowolnego programu, takiego jak Sigma Plot lub Prism do dalszej analizy.
- W programie Origin użyj menu Wykres → Linia+Symbol, aby obserwować przegląd wszystkich odpowiedzi przejściowych. Usuń zaznaczenie komórek, które nie odpowiadają.
- Przelicz liczbę śladów na skalę czasu (oś X), użyj kolumny → ustaw wartości kolumny i pomnóż kolumnę liczby śladów przez częstotliwość zbierania obrazów (w naszym przypadku 1,1 s).
- Użyj narzędzia Analysis → Statistics on Rows dla wszystkich wybranych nagrań, aby obliczyć średnią (oś Y) i ślad błędu standardowego. Wykreśl końcowy wykres dla bieżącej grupy komórek Kreśl → Linia + symbol.
- Obliczanie średniego stanu nieustalonego wapnia opisano w następujący sposób.
- Aby uzyskać całkowite uwolnienie wapnia w programie Origin, kliknij Wykres, a następnie użyj menu Analiza → Rachunek różniczkowy → Integruj. Całka całkowita powierzchni pod krzywą pojawia się w Dzienniku wyników.
- W przypadku kinetyki stanów przejściowych kliknij Wykres, a następnie użyj menu: Analiza → Dopasuj krzywą nieliniową → Wybierz zestaw danych (wybierz zakres osi X od maksimum do końca odpowiedzi przejściowej). Rozpocznij dopasowywanie → wybierz funkcję → Zanik wykładniczy 1 → Gotowe.
Uwaga: Dopasowanie wykładnicze pojawia się w oknie Wykres i Dzienniku wyników. Uzyskane dane (wartości) reprezentują całkowitą ilość uwolnionego wapnia, a kinetyka kanałów pośredniczyła w odpowiedzi przejściowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu dokładnej oceny wpływu wapnia na fizjologię naczyniową (rozszerzanie i zwężanie naczyń), opracowano protokół umożliwiający wprowadzenie barwników wapniowych zarówno do komórek śródbłonka, jak i komórek mięśni gładkich w izolowanych, nienaruszonych aortach. Ogólny schemat doświadczalny przedstawiony na Rysunku 1 obrazuje podstawową strategię izolacji i przygotowania naczynia przed obrazowaniem. W skrócie, po wyizolowaniu aorty z organizmu szczura, należy ją oczyścić z tłuszczu i tkanki łącznej, a n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przegląd eksperymentalny. Aby lepiej zrozumieć wpływ wapnia i NO na fizjologię naczyń krwionośnych, opracowano nową metodę pomiaru [Ca2+]i i NO w komórkach mięśni gładkich i śródbłonka izolowanych nienaruszonych aort. Łącznie protokół ten składa się z następujących krytycznych etapów: 1) Mechaniczna izolacja i przygotowanie (nie trawienie enzymatyczne) naczynia. Ważne jest, aby utrzymać tkankę w zdrowiu i nienaruszonym stanie w jak największym stopniu, aby uzyskać optymalne zapisy fizjologi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy dr Williamowi Cashdollarowi oraz Centrum Obrazowania Northwestern Mutual Foundation w Instytucie Badań Krwi w Wisconsin za pomoc w badaniach obrazowych. Dziękujemy również dr Darii Ilatovskaya za krytyczną lekturę tego manuskryptu i pomocną dyskusję. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health Grants HL108880 (dla A.S.) i DP2-OD008396 (dla A.M.G.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µ l w roztworze DMSO |
| Pluronic F-68 | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Mikroskop pionowy Olympus | Olympus Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti: laser szafirowy 690nm — Filtry 1040nm | |
| Olympus | FV10-MRL/R | od 495 do 540 nm | |
| 25 i razy; soczewka obiektywowa zanurzająca | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1,05 i odległość robocza 2 mm |
| Slice Siatka kotwiąca | Instrument Warnera | SHD-27LH | |
| Inne odczynniki podstawowe | Sigma-Aldrich |
Bibliografia
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
