Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

Summary

Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.

Abstract

Wady lokomotywy wynikające z zaburzeń neurodegeneracyjnych mogą być późnym początkiem choroby, po latach subklinicznej degeneracji, a zatem obecne strategie leczenia nie są lecznicze. Dzięki zastosowaniu sekwencjonowania całego egzomu zidentyfikowano coraz większą liczbę genów, które odgrywają rolę w poruszaniu się człowieka. Pomimo zidentyfikowania tych genów, nie wiadomo, w jaki sposób geny te są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania lokomotywy. Dlatego bardziej niż kiedykolwiek potrzebny jest wiarygodny test, który wykorzystuje organizmy modelowe do wyjaśnienia roli tych genów w celu identyfikacji nowych celów terapeutycznych. Zaprojektowaliśmy uwrażliwioną wersję negatywnego testu geotaksji, która pozwala na wcześniejsze wykrycie łagodniejszych wad i ma możliwość oceny tych wad w czasie. Test przeprowadza się w szklanym cylindrze z podziałką, który jest uszczelniony folią barierową woskową. Zwiększając odległość progową do pokonania do 17,5 cm i wydłużając czas trwania eksperymentu do 2 minut, zaobserwowaliśmy większą czułość w wykrywaniu łagodnych dysfunkcji ruchowych. Test jest opłacalny i nie wymaga intensywnego szkolenia w celu uzyskania wysoce powtarzalnych wyników. To sprawia, że jest to doskonała technika do badań przesiewowych potencjalnych leków u mutantów Drosophila z wadami lokomocji.

Introduction

Coraz częściej rozpoznawane są wyniszczające zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne i dziedziczna paraplegia spastyczna. Niestety, większość z tych zaburzeń neurodegeneracyjnych nadal nie ma leczenia. Powszechne kliniczne stosowanie obejmujących cały genom, bezstronnych testów genetycznych, takich jak sekwencjonowanie całego egzomu, doprowadziło do wzrostu liczby genów związanych z zaburzeniami lokomocji u ludzi. Pomimo tego postępu, patologiczna progresja od wczesnych do późnych stadiów pozostaje nieuchwytna w tych zaburzeniach. Drosophila dostarcza narzędzi genetycznych do badania zapotrzebowania na geny w kontrolowany sposób przestrzenny i czasowy. Ponadto Drosophila okazała się przydatna w badaniach przesiewowych leków na schorzenia neurologiczne, takie jak między innymi choroba Parkinsona¹, choroba Alzheimera², niepełnosprawność intelektualna^3,4 i padaczka^5,6. Naszym celem było opracowanie opłacalnego i wiarygodnego testu, który pozwoliłby na analizę o wysokiej przepustowości, a jednocześnie byłby wystarczająco czuły, aby wykryć niewielkie zmiany w wydajności silnika.

Istnieje kilka testów używanych do ilościowego określenia wpływu mutacji genetycznej i/lub warunków środowiskowych na zachowanie wspinaczki Drosophila. Większość testów wykorzystuje naturalną tendencję much do wspinania się, znaną jako geotaksja ujemna lub test wspinaczkowy. Benzer⁷ zasugerował w 1967 roku, że aparatura przeciwprądowa używana do badania fototaksji może być również używana do badania grataksji. Od tego czasu Ganetsky⁸ i wiele innych ^9-12 oparło się na początkowym teście. Zasada polega na umieszczeniu znanej liczby much w fiolce i silnym uderzeniu fiolką o twardą powierzchnię, powodując upadek much na dno fiolki. Ponieważ jest to zachowanie wrodzone, muchy będą próbowały wspiąć się na szczyt fiolki, w przeciwieństwie do grawitacji. Ten test jest ilościowy i mierzy, ile much przekroczyło znacznik na fiolce w wyznaczonym czasie. Pomiar prędkości zamiast całkowitej liczby wznoszących się much stał się wiarygodnym parametrem i wykazał wady w przypadkach, gdy kryterium liczby much nie było znaczące¹³.

Test wspinaczkowy okazał się przydatny w badaniu wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona¹⁴. Zauważyliśmy jednak, że wady lokomocji mogą nie być wykrywalne w czasie, gdy neurodegeneracja jest już obserwowana w badaniach patologicznych¹⁴. W związku z tym zastosowanie tradycyjnego testu może ograniczyć możliwość badania wczesnych etapów patogenezy choroby. Pojawienie się wad lokomotywy w późniejszych stadiach patologii może odzwierciedlać chorobę, której postęp jest zbyt zaawansowany, aby można było go całkowicie uratować.

To rodzi potencjalny problem z czułością tradycyjnego testu wspinaczkowego. Potencjalną niezdolność tradycyjnego testu wspinaczkowego do wykrycia łagodnych wad lokomotywy można przypisać wysokości, na którą muszki muszą się wspinać. Tradycyjny test^15,16 mierzy liczbę much, które z powodzeniem wspinają się na wysokość od 2 do 5 cm w ciągu 10 do 20 sekund.

Protocol

Badania nad Drosophila melanogaster były zgodne z wytycznymi badawczymi Uniwersytetu Alberty.

1. Kolekcja much

1. Zebrać 20 much za pomocą znieczulenia CO_{2 (g)} i umieścić w fiolce o wymiarach 25 mm x 95 mm zawierającej pokarm.
2. Fiolki zawierające muchy należy przechowywać poziomo, aby uniknąć uwięzienia much w płynach, które mogą gromadzić się na dnie fiolki.
3. Inkubować muchy przez co najmniej 21 godzin w temperaturze 22 °C przy wilgotności 45% w inkubatorze przez około 15 godzin. Ustawić inkubator na 12-godzinny cykl światło: ciemność.

2. Test wspinaczkowy

1. Następnego ranka przenieś 20 much z jednej fiolki do szklanego cylindra z podziałką o pojemności 250 ml. Zaznacz położenie cylindra, aby utrzymać go na stałym poziomie każdego dnia. Użyj jednego szklanego cylindra na genotyp, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między genotypami. Umyj je na końcu każdego eksperymentu i zmieniaj między genotypami.
   1. Przeprowadzaj eksperymenty w świetle otoczenia (lub czerwonym świetle, jeśli występuje potencjalna wada wzroku) w temperaturze i wilgotności odpowiednio 22 °C i 40%. Aby uniknąć zakłóceń rytmu okołodobowego, zawsze wykonuj eksperymenty o tej samej porze dnia.
2. Uszczelnij górną część cylindra folią barierową (folią woskową), aby zapobiec ucieczce much (rysunek 2).
3. Ustaw kamerę wideo na statywie. Ustaw ostrość kamery na linii 190 ml cylindra z podziałką 250 ml (17,5 cm).
4. Policz liczbę martwych much na dnie cylindra i w fiolkach z jedzeniem. Zapisz tę liczbę jako śmiertelność.
5. Bardzo delikatnie kilkakrotnie uderzaj cylindrem o podkładkę piankową o zamkniętych komórkach z wystarczającą siłą, aby przemieścić muchy na wewnętrzną powierzchnię dna. Stuknij 5–10 razy, używając drugiej ręki, aby nacisnąć przycisk nagrywania w aparacie.
6. Naciśnij przycisk "Nagraj" na aparacie.
7. Rozpocznij nagrywanie z kamery wideo i dotknij cylindra sześć razy w wyraźny nierytmiczny wzór.
8. Przeprowadzaj każdą próbę przez 2 minuty od czasu ostatniego stukania muchówek i zapisuj liczbę much przekraczających wysokość 17,5 cm (190 ml) w każdym wybranym punkcie czasowym (oznaczaj ilościowo co 10 sekund). Uwaga: Oznaczenie ml na butli będzie się różnić w zależności od modelu butli w zależności od średnicy. Aby uniknąć błędu, zmierz wysokość każdego używanego cylindra.
9. Po zakończeniu badania wyrzuć muchy w 95% etanolu.
10. Powtarzać kroki od 2.1 do 2.9, aż wszystkie kontrpróby zostaną za każdym razem przetestowane na świeżych muchach.
    Uwaga: Chociaż 5 powtórzeń może wystarczyć w przypadku mutacji mającej silny wpływ na lokomocję, zaleca się 10 powtórzeń biologicznych na 20 much (200 much) w celu wykrycia mniejszych różnic.
11. Po zakończeniu eksperymentu umyj cylindry w zmywarce laboratoryjnej i wysusz O/N do ponownego użycia.

3. Analiza

1. Przeanalizuj filmy z każdej próby muchy. Co 10 sekund zapisuj całkowitą liczbę much, które przekraczają linię docelową.
   1. Jeśli mucha wspina się z powrotem w dół lub spada, zapisz tę muchę jako -1 i policz następną muchę, która przekroczyła linię celu, jako tę samą liczbę, co mucha, która zeszła z powrotem w dół lub spadła. Na przykład, jeśli 15. mucha spadnie poniżej linii docelowej, następna mucha, która przekroczy linię (16. mucha) jest uważana za 15. muchę, a nie 16. muchę.
2. Odejmij śmiertelność od całkowitej liczby much (20), aby uzyskać liczbę much, które pozostały w badaniu. W każdym punkcie czasowym uzyskaj frakcję much powyżej linii celu.
3. Wykreślić każdą wartość procentową w każdym punkcie czasowym (zob. rysunek 3).
4. Przeanalizuj wydajność w 120-sekundowym punkcie danych i wykonaj test t-studenta, gdy obecne są 2 grupy lub ANOVA i test końcowy dla wielokrotnych porównań (z modyfikacją Bonferroniego dla porównań planowanych i Tukey dla porównań nieplanowanych). Testy Kołmogorowa-Smirnowa¹⁷ są również wykonywane w celu ustalenia normalności i równej wariancji, ale także w celu porównania rozkładu grupy zmutowanej w stosunku do grupy kontrolnej.
5. Aby przedstawić dane dotyczące starzenia się, wykreśl odsetek much wspinających się w ciągu 120 sekund z muchami w różnym wieku (2 dni, 1 tydzień, 2 tygodnie), aby sprawdzić, czy występuje postępujący deficyt (ryc. 4).

Results

Wspinaczka to silne i powtarzalne zachowanie. Rzeczywiście, jednodniowe muchy typu dzikiego szybko osiągają docelową odległość, pokonując pokonany dystans (25 - 30 sekund). Zmutowane muchy prezentują zakres wydajności od łagodnej (lub opóźnionej) do całkowitej niezdolności do wspinania się na cel. Ilustrujemy to tutaj za pomocą dwóch różnych zmutowanych alleli. Pierwszym z nich jest ciężki allel genu spadyny spowodowany całkowitą delecją genu spastyny (spas^5,75) ¹⁸. W tej linii (uzdrowiska^5,75<...

Discussion

Drosophila już okazała się doskonałym modelem w chorobie Parkinsona¹⁴ i innych chorobach neurodegeneracyjnych^1,2. Oprócz narzędzi genetycznych dostępnych u Drosophila, jego genom jest wysoce konserwatywny pod kątem genów zaangażowanych w zaburzenia neurologiczne¹⁹. Pojawienie się metod genetycznych badań przesiewowych całego genomu (w tym sekwencjonowania całego eksomu) prawdopodobnie nadal będzie dostarczać większej listy genów kandydujących związanych z zaburzeniami ru...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		Drosophila Stada	są wybierane w zależności od eksperymentów. Temperatura i wilgotność w pomieszczeniu i inkubatorze muszą być kontrolowane i stałe, aby muchy nie były zbyt statyczne lub zbyt mokre.
Kamera			Każda kamera cyfrowa będzie odpowiednia. Upewnij się, że mogą ustawić ostrość na bliskim obiekcie.
Cylinder z podziałką	Kimble	20028W	Różne modele cylindra z podziałką mogą mieć różną średnicę. Dlatego ważne jest, aby zmierzyć wysokość.
Komputer			Każdy model się nada. Używaliśmy komputera do monitorowania wspinania się much i rejestrowania liczby much w każdym punkcie czasowym.