Artykuł metodologiczny

Analiza funkcji komórek tucznych in vivo przy użyciu myszy typu "mastucyjnego knock-in"

DOI:

10.3791/52753

⸱

27 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę generowania komórek tucznych pochodzących z in vitro, ich wszczepiania myszom z niedoborem komórek tucznych oraz analizy fenotypu, liczby i rozmieszczenia przeszczepionych komórek tucznych w różnych miejscach anatomicznych. Protokół ten można wykorzystać do oceny funkcji komórek tucznych in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki tuczne (MCs) to komórki hematopoetyczne, które znajdują się w różnych tkankach, a szczególnie obfite są w miejscach narażonych na działanie środowiska zewnętrznego, takich jak skóra, drogi oddechowe i przewód pokarmowy. Najbardziej znane ze swojej szkodliwej roli w reakcjach alergicznych IgE-zależnych, MC stały się również ważnymi graczami w obronie gospodarza przed jadem oraz atakującymi bakteriami i pasożytami. Na fenotyp i funkcję MC mogą mieć wpływ czynniki mikrośrodowiskowe, które mogą się różnić w zależności od lokalizacji anatomicznej i/lub w zależności od rodzaju lub etapu rozwoju odpowiedzi immunologicznej. Z tego powodu my i inni faworyzowaliśmy podejścia in vivo nad metodami in vitro, aby uzyskać wgląd w funkcje MC. W tym miejscu opisujemy metody generowania MC pochodzących ze szpiku kostnego myszy (BMCMC), ich adoptywnego transferu do myszy z genetycznym niedoborem MC oraz analizę liczby i rozmieszczenia adoptywnie przeniesionych MC w różnych miejscach anatomicznych. Metoda ta, zwana podejściem "knock-in" z wykorzystaniem komórek tucznych, jest szeroko stosowana w ciągu ostatnich 30 lat do oceny funkcji MC i produktów pochodnych MC in vivo. Omówiono zalety i ograniczenia tej metody w świetle alternatywnych podejść, które zostały opracowane w ostatnich latach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki tuczne (MCs) to komórki hematopoetyczne, które powstają z pluripotencjalnych komórek progenitorowych szpiku kostnego1-3. W wyniku wydostania się szpiku kostnego komórki progenitorowe MC migrują do różnych tkanek, gdzie pod wpływem lokalnych czynników wzrostu1-3 przekształcają się w dojrzałe MC. Rezydujące w tkankach MC są strategicznie zlokalizowane na styku gospodarz-środowisko, takie jak skóra, drogi oddechowe i przewód pokarmowy, gdzie zachowują się jako pierwsza linia obrony przed zewnętrznymi zniewagami3-6. MC są często klasyfikowane na podstawie ich "wyjściowych" cech fenotypowych i ich lokalizacji anatomicznych. U myszy opisano dwa typy MC: MC typu tkanki łącznej (CTMC) i MC błony śluzowej (MMC)1-3,7,8. CTMC są często zlokalizowane wokół żyłek i w pobliżu włókien nerwowych i znajdują się w jamach surowiczych, podczas gdy MMC zajmują śródnabłonkowe lokalizacje w błonie śluzowej jelit i dróg oddechowych1-3.

Liczne metodologie zostały zastosowane do badania funkcji biologicznych MCs9-13. Wiele grup skupiło się na podejściach in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych (takich jak ludzkie linie MC HMC114 lub LAD215,16), MC pochodzących z in vitro (takich jak MC 17 pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej17 lub MC pochodzących ze szpiku kostnego myszy [BMCMCs]18, MC pochodzących ze skóry płodu [FSCMCs]19 i MC pochodzących z komórek otrzewnej [PCMCs]20) lub ex vivo izolowane MC z różnych miejsc anatomicznych. Wszystkie te modele są szeroko stosowane do badania szczegółów molekularnych biologii MC, takich jak szlaki sygnałowe zaangażowane w aktywację MC. Jednak ważnym aspektem biologii MC jest to, że ich cechy fenotypowe i funkcjonalne (np. zawartość proteazy ziarnistej cytoplazmatycznej lub reakcja na różne bodźce) mogą być modulowane przez położenie anatomiczne i mikrośrodowisko2,7. Ponieważ dokładna mieszanina takich czynników, które występują in vivo, może być trudna do odtworzenia in vitro, opowiadamy się za stosowaniem podejść in vivo w celu uzyskania wglądu w funkcje MC9.

Istnieje kilka szczepów myszy z genetycznym niedoborem MC, takich jak szeroko stosowane myszy WBB6F 1-Kit W/W-v lub C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Myszy te nie mają ekspresji i/lub aktywności KIT (CD117), receptora dla głównego czynnika wzrostu MC czynnika macierzystego czynnika macierzystego (SCF)21,22. W rezultacie myszy te mają głęboki niedobór MC, ale mają również dodatkowe nieprawidłowości fenotypowe związane z ich mutacjami c-kit (u myszy WBB6F 1-Kit W / W-v) lub z efektami dużej inwersji chromosomów, która powoduje zmniejszoną ekspresję c-kit (u myszy C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh)9,10,12,23. Ostatnio zgłoszono kilka szczepów myszy z niezależnym od zestawu konstytutywnym niedoborem MC24-26. Wszystkie te myszy i kilka dodatkowych nowych typów myszy z indukowalnym niedoborem MC zostały ostatnio szczegółowo przeanalizowane9,10,13.

Tutaj opisujemy metody generowania MC pochodzących z mysiego szpiku kostnego (BMCMC), ich adoptywnego transferu do myszy z niedoborem MC oraz analizę liczby i rozmieszczenia adoptywnie przeniesionych MC w różnych miejscach anatomicznych. Ta tak zwana metoda "knock-in" komórek tucznych może być stosowana do oceny funkcji MC i produktów pochodnych MC in vivo. Omówiono zalety i ograniczenia tej metody w świetle alternatywnych podejść, które zostały opracowane w ostatnich latach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty i opieka nad zwierzętami były prowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Stanforda.

1. Wytwarzanie i charakterystyka hodowanych komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMCMC).

Uwaga: BMCMC dawcy powinny być generowane z komórek szpiku kostnego o tym samym tle genetycznym, co myszy z niedoborem MC biorcy. BMCMC dawcy pochodzącego od samców nie nadają się do wszczepiania samic myszy. BMCMC dawcy pochodzenia żeńskiego będą z powodzeniem wszczepiane zarówno do biorców płci męskiej, jak i żeńskiej.

  1. Ekstrakcja szpiku kostnego.
    1. Wlać sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 6-dołkowej płytki hodowlanej (1 dołek na mysz) i umieścić na lodzie.
    2. Namocz narzędzia preparacyjne w 70% etanolu do sterylizacji.
    3. Poddaj myszy dawcy eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2), a następnie zwichnięcie szyjki macicy, a następnie spryskaj myszy 70% etanolem w miejscach manipulacji.
    4. Użyj sterylnych narzędzi preparacyjnych, aby wydobyć kości udowe, piszczelowe i strzałkowe bez przecinania nasad kostnych.
    5. Zabezpieczając kości kleszczami, zeskrob całą tkankę z kości (i wyrzuć kość strzałkową) za pomocą sterylnych nożyczek (lub ostrzy skalpela). Umieść kości w PBS na lodzie, aż wszystkie kości zostaną zebrane.
    6. Wykonaj wszystkie pozostałe kroki w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych. Za pomocą sterylnych narzędzi zabezpiecz kości kleszczami i odetnij obie nasady, aby odsłonić jamę szpikową.
    7. Używając strzykawek o pojemności 3 ml i igieł 30 G oraz pożywki do płukania na zimno (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą [FCS, inaktywowaną termicznie], 2 mM L-glutaminy, 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, 50 μM β-merkaptoetanolu), przepłucz czerwony szpik kostny na szalkę Petriego.
    8. Użyj tej samej strzykawki do dysocjacji przepłukanych skupisk komórek szpiku kostnego poprzez wielokrotne delikatne zasysanie i wyrzucanie.
    9. Zebrać szpik kości udowej i piszczelowej od każdej myszy w jednej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Napełnić probówkę zimnym środkiem do płukania w celu przepłukania komórek szpiku kostnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Kultura BMCMC.
    1. Usunąć supernatant i odzyskać granulowane komórki szpiku kostnego w 10 ml pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą [FCS, inaktywowaną termicznie], 2 mM L-glutaminy, 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, 50 μM β-merkaptoetanolem i 20% pożywką kondycjonowaną komórkami WEHI-3 [jako źródło IL-3; alternatywnie należy użyć rekombinowanej mysiej IL-3 w stężeniu 10 ng / ml]).
    2. Umieścić komórki w kolbie do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości (np. T25 dla 1 myszy, T75 dla 2 myszy itp.).
    3. 1-2 dni po posianiu komórek, przenieść pożywkę i komórki zawiesiny (pozostawiając resztki i przylegające komórki przyklejające się do dna kolby) do nowej kolby i dodać świeżą pożywkę hodowlaną (10 ml/mysz).
    4. W ciągu kolejnych tygodni karmić komórki co 3-4 dni (dodawać 10 ml pożywki na mysz). Utrzymuj gęstość komórek w zakresie 2,5 x 105-1 x 106 komórek/ml. Nieprzylegające komórki przenosić do nowej kolby raz w tygodniu, aż do momentu, gdy w kolbie hodowlanej nie będzie żadnych przylegających komórek. Badanie dojrzałości komórek (patrz poniżej) przed użyciem do testów in vitro lub wszczepienia myszom z niedoborem MC.
      UWAGA: Całkowite zróżnicowanie BMCMC zajmie 4-6 tygodni.
  3. Ocena dojrzałości BMCMC.
    1. Korzystanie z cytometrii przepływowej.
      1. Umyj komórki (5 x 104-5 x 105 komórek/warunek) lodowatym buforem FACS (PBS, 0,5% FCS) w 5 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant.
      2. Rozcieńczyć przeciwciała monoklonalne anty-mysie CD16/32 (klon 93 lub 2,4G2) w stosunku 1:200 (2,5 μg/ml) w buforze FACS. Dodać 10 μl do każdej granulki i ponownie zawiesić przez krótkie wirowanie. Inkubować 5 minut na lodzie, aby zablokować wiązanie Fc.
        UWAGA: Chroń próbki przed bezpośrednim światłem na wszystkich pozostałych etapach.
      3. Rozcieńczony fikoerytryną (PE) sprzężony z mysią przeciw-myszą Fc εRI α (klon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) i sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) anty-mysi zestaw (CD117; klon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("roztwór barwiący") lub odpowiednie znakowane przeciwciała kontrolne izotypu w buforze FACS ("roztwór kontrolny izotypu").
      4. Podzielić połowę zablokowanych komórek z kroku 1.3.1.2) na dodatkową probówkę z okrągłym dnem z polistyrenu i dodać 20 μl "roztworu barwiącego" do jednej probówki i 20 μl "roztworu kontrolnego izotypu" do drugiej probówki. Inkubować 30 minut na lodzie.
      5. Dodać 3 ml lodowatego buforu FACS i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl buforu FACS zawierającego 1 μg/ml jodku propidyny (PI, do identyfikacji martwych komórek). Przejdź do analizy cytometrii przepływowej (patrz rysunek 2A).
    2. Za pomocą barwienia błękitem toluidyny.
      1. Przemyć 1 x 105 komórek raz PBS przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać i ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS.
      2. Przenieść zawiesinę komórek do przygotowanego cytolejka przymocowanego do szkiełka mikroskopowego i przystąpić do cytowirowania przy użyciu cytowirówki (40 x g przez 5 min).
      3. Susz szkiełka na powietrzu przez 10 minut i narysuj woskowy okrąg wokół komórek za pomocą pisaka PAP. Dodaj 0,1% roztworu błękitu toluidynowego, aby pokryć komórki. Inkubować przez 1 minutę. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę, a następnie susz je na powietrzu przez 10 minut.
      4. Komórki szkiełka nakrywkowego za pomocą podłoża montażowego. Przejdź do analizy pod mikroskopem świetlnym (patrz rysunek 2B)

2. Wszczepienie myszy z niedoborem komórek tucznych za pomocą BMCMC.

  1. Wszczepienie ucha przez wstrzyknięcie śródskórne (i.d.).
    UWAGA: W celu adoptywnego przeniesienia BMCMC do małżowiny usznej uszu myszy z niedoborem MC zalecamy wykonanie dwóch wstrzyknięć po 1 x 106 komórek każda (w sumie 2 x 106 komórek) na małżowinę uszną. Śródskórne wszczepienie BMCMC do małżowin usznych uszu myszy z niedoborem MC było stosowane przez wielu badaczy w kilku modelach, w tym w modelach biernej anafilaksji skórnej (PCA)24,27, obronie gospodarza przed jadami28 i przewlekłych reakcjach nadwrażliwości (CHS)29,30.
    1. Policz i ponownie zawieś komórki w 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/25 μl) w zimnym DMEM. Przenieść roztwór BMCMC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
    2. Znieczulenie 4-6 tygodniowych myszy z niedoborem MC za pomocą izofluranu (2,5% v/v). Sprawdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, dostosuj izofluran, jeśli jest to wskazane i kontynuuj monitorowanie oddechu i reakcji na uszczypnięcie palca u nogi przez cały zabieg. Nałóż maść okulistyczną z patyczkiem higienicznym, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
    3. Palcem wskazującym wytwórz pionowy nacisk na grzbietową powierzchnię małżowiny usznej, aby odsłonić i rozciągnąć twarz brzuszną.
    4. Wykonać dwa wstrzyknięcia roztworu BMCMC o średnicy wewnętrznej 25 μl w dwa różne miejsca brzusznej powierzchni małżowiny usznej, pierwsze wstrzyknięcie w środek ucha, a drugie wstrzyknięcie w kierunku czubka małżowiny usznej. Odczekaj 4-6 tygodni po wszczepieniu i.d. przed wykonaniem eksperymentów in vivo.
      Uwaga: Z naszego doświadczenia wynika, że do tego czasu liczba MCs/mm2 skóry właściwej w centralnej części małżowiny usznej jest na ogół podobna do tej w odpowiedniej lokalizacji u myszy typu dzikiego, podczas gdy liczba MCs/mm2 na obrzeżach małżowin usznych ucha jest zwykle znacznie niższa niż u odpowiednich myszy typu dzikiego27,28. Należy o tym pamiętać przy projektowaniu eksperymentów z takimi myszami z implantami MC (np. środki o możliwym wpływie na funkcję MC powinny być wstrzykiwane w centralną część małżowiny usznej, a analiza efektów takich zabiegów powinna również koncentrować się na tym obszarze).
  2. Wszczepienie jamy otrzewnej przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.).
    UWAGA: Adoptywne przeniesienie BMCMC do jamy otrzewnej myszy z niedoborem MC będzie wymagało jednego wstrzyknięcia 2 x 106 komórek na mysz. Takie wstrzyknięcia BMCMC i.p. myszom z niedoborem MC były wykorzystywane przez wiele grup do badania roli MC otrzewnej w różnych modelach, w tym w modelach obrony gospodarza przed jadami31 lub posocznicą bakteryjną32,33.
    1. Policz odpowiednią liczbę komórek i ponownie zawiesić przy 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/200 μl) w zimnym DMEM. Przenieść roztwór BMCMC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o pojemności 25 g. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
    2. Wykonaj 1 wstrzyknięcie 200 μl roztworu BMCMCs do jamy otrzewnej 4-6 tygodniowych myszy z niedoborem MC. Odczekaj 4-6 tygodni po wszczepieniu i.p. przed wykonaniem eksperymentów in vivo.
  3. Wszczepienie we wstrzyknięciu dożylnym (dożylnym).
    UWAGA: Adoptywny transfer BMCMC przez wstrzyknięcie dożylne myszom z niedoborem MC będzie wymagał jednego wstrzyknięcia 5 x 106 komórek na mysz. Dożylne (dożylne) wstrzyknięcia BMCMC myszom z niedoborem MC były stosowane przez wiele grup do badania roli MC w różnych modelach choroby, w tym w modelach infekcji pęcherza moczowego34, astmy35, zwłóknienia płuc36 i zapalenia stawów za pośrednictwem przeciwciał37.
    1. Policz odpowiednią liczbę komórek i ponownie zawieś przy 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) w zimnym DMEM. Przenieść roztwór BMCMC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
    2. Znieczulenie 4-6 tygodniowych myszy z niedoborem MC za pomocą izofluranu (2,5% v/v). Sprawdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, dostosuj izofluran, jeśli jest to wskazane i kontynuuj monitorowanie oddechu i reakcji na uszczypnięcie palca u nogi przez cały zabieg. Nałóż maść okulistyczną z patyczkiem higienicznym, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
    3. Wykonać jedno wstrzyknięcie 200 μl roztworu BMCMC do żyły ogonowej (lub, alternatywnie, żyły zaoczodołowej) myszy z niedoborem MC. Odczekaj 12 tygodni po wszczepieniu dożylnym przed wykonaniem eksperymentów in vivo.

3. Analiza myszy z niedoborem komórek tucznych po szczepieniu.

  1. Analiza wszczepienia ucha.
    1. Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Odizolować małżowiny uszne ucha i utrwalić w 10% (obj./obj.) buforowanej formalinie przez noc w temperaturze 4 °C. Zanurzyć stałe małżowiny uszne w parafinie, wyciąć 4 μm odcinki małżowiny usznej i zamontować na szkiełkach podstawowych.
    3. Zabarwić szkiełka 0,1% roztworem błękitu toluidynowego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka w wodzie z kranu przez 1 minutę, a następnie susz na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Szkiełko nakrywkowe szkiełkuje za pomocą podłoża montażowego, a następnie policz liczbę wszczepionych MC na odcinki małżowin usznych za pomocą mikroskopu świetlnego. Oceń skuteczność wszczepienia, porównując procent i rozmieszczenie MC w skórze ucha wszczepionych myszy w porównaniu z myszami typu dzikiego.
  2. Analiza wszczepienia jamy otrzewnej.
    1. Ocena liczby komórek tucznych w jamie otrzewnej.
      1. Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Ostrożnie usuń brzuszną skórę myszy, nie przerywając jamy otrzewnej.
      2. Wstrzyknąć 5 ml zimnego lub pokojowego PBS do jamy otrzewnowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę o pojemności 25 g. Stosuj zimny PBS, aby zmniejszyć ryzyko aktywacji komórek otrzewnej (jest to bardzo ważne przy ocenie degranulacji MC otrzewnej lub poziomu niektórych produktów pochodzących z MC w płynie z płukania otrzewnej). Wykonuj masaż brzucha przez 20 sekund, aby pobrać komórki otrzewnej.
      3. Powoli odessać płukanie otrzewnowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę 22 G. Zapisz objętość zasysanego płukania (spodziewaj się odzyskania do 80% wstrzykniętej objętości).
      4. Przenieść płyn z płukania otrzewnowej do probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml polistyrenu i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant. Odzyskaj osad w 400 μl zimnego PBS.
      5. Policz całkowitą liczbę komórek otrzewnej za pomocą komory hemocytometru. Do analizy metodą cytometrii przepływowej (zgodnie z opisem w kroku 1.3.1) należy użyć połowy zawiesiny komórkowej w celu oceny procentowej i ekspresji markera wszczepionych MC w jamie otrzewnej. Pomnóż całkowitą liczbę komórek otrzewnej przez procent MC, aby uzyskać bezwzględną liczbę MC otrzewnej.
      6. Wykonaj cytowirowanie z pozostałymi komórkami, jak opisano w kroku 1.3.2.2. Suszyć szkiełka na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i narysować woskowy okrąg wokół komórek za pomocą pisaka PAP.
      7. Przykryj komórki nierozcieńczonym roztworem barwiącym May-Grünwald na 5 minut, a następnie umyj w PBS przez 5 minut, w obu przypadkach w temperaturze pokojowej. Przykryj komórki barwnikiem Giemsa rozcieńczonym w stosunku 1:20 wodą dejonizowaną i inkubuj 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka 2 razy w wodzie z kranu przez 1 minutę, a następnie wysusz je na powietrzu.
      8. Szkiełko nakrywkowe należy pobrać za pomocą podłoża montażowego i obliczyć procent wszczepionych MC za pomocą mikroskopu świetlnego (licząc co najmniej 400 komórek ogółem). Oceń skuteczność wszczepienia, porównując procent MC w płukaniu otrzewnowej myszy wszczepionych w porównaniu z myszami typu dzikiego.
    2. Ocena komórek tucznych w oknach krezkowych.
      1. Po płukaniu otrzewnej opisanym w kroku 3.2.1 należy rozciąć błonę otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy myszy. Ułóż od 4 do 5 okien krezkowych na jedną mysz na slajdzie.
      2. Utrwalić szkiełka na 1 godzinę w roztworze Carnoya (3:2:1 obj./obj./obj. etanolu, chloroformu i lodowatego kwasu octowego) w temperaturze pokojowej. Wysuszyć szkiełka na powietrzu i usunąć jelito (stałe okienka krezkowe pozostaną przymocowane do szkiełek).
      3. Preparaty barwić przez 20 minut w temperaturze pokojowej roztworem barwiącym Csaba (błękit alcyjski/Safranina O).
        1. Aby uzyskać 500 ml barwienia Csaba, należy przygotować 500 ml buforu octanowego, mieszając 100 ml 1 M roztworu octanu sodu ze 120 ml 1 M HCl. Uzupełnić do 500 ml wodą dejonizowaną i dostosować pH do 1,42. Następnie rozpuścić 90 mg Safraniny [na czerwono oznaczone jako »dojrzałe MCs«], 1,8 g błękitu alcian [oznaczając »niedojrzałe MCs« na niebiesko] i 2,4 g siarczanu żelazowo-amonowego NH4Fe(SO4)2 w 500 ml buforu octanowego.
      4. Szkiełko nakrywkowe szkiełkuje za pomocą podłoża montażowego, a następnie policz liczbę wszczepionych MC w oknie krezkowym za pomocą mikroskopu świetlnego. Oceń skuteczność wszczepienia, porównując procent i rozmieszczenie MC w oknach krezkowych wszczepionych myszy w porównaniu z myszami typu dzikiego.
  3. Analiza wszczepienia dożylnego.
    1. Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy, a następnie pobrać tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (np. płuca, skórę lub śledzionę) i utrwalić przez noc w 10% (obj. / obj.) buforze formaliny w temperaturze 4 °C.
    2. Utrwalone chusteczki zatopić w parafinie, wyciąć odcinki 4 μm i zamontować na szkiełkach podstawowych. Zabarwić szkiełka 0,1% roztworem błękitu toluidynowego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka w wodzie z kranu przez 1 minutę, a następnie susz je na powietrzu przez 10 minut.
    3. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć za pomocą podłoża montażowego i ocenić liczbę i rozmieszczenie wszczepionych MC na odcinki tkanki za pomocą mikroskopu świetlnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd podejścia "mastucznego wbijania komórek" jest pokazany na rysunku 1 i obejmuje generowanie BMCMC, liczbę komórek, które powinny być wszczepione i.p., i.d. lub i.v. myszom z niedoborem MC (liczba może być zmieniona, jeśli zostanie to wskazane na podstawie projektu eksperymentalnego) oraz odstęp między wszczepieniem a eksperymentem w zależności od miejsca wstrzyknięcia (ten odstęp również może się różnić, jeśli jest to wskazane; np. zawartość zmagazynowanych mediatorów w ziarnis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawie 30 lat po początkowym opisie38 metoda "mastucznego efektu knock-in" nadal dostarcza cennych informacji na temat tego, co MC mogą, a czego nie mogą robić in vivo. Przez długi czas uważano, że funkcje MC ograniczają się do ich roli w alergii. Dane uzyskane przy użyciu podejścia "knock-in komórek tucznych" zmieniły ten pogląd, dostarczając dowodów na to, że MC mogą, między innymi, odgrywać kluczową rolę w obronie gospodarza przed niektórymi patogenami4,39 lub jadami

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.G. jest laureatem stypendiów francuskiej "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" i Fundacji Philipp; R.S. jest wspierany przez Lucile Packard Foundation for Children's Health oraz Stanford NIH/NCRR CTSA award numer UL1 RR025744; P.S. jest wspierany przez stypendium Maxa Kade'a Fundacji Maxa Kade'a i Austriackiej Akademii Nauk oraz stypendium Schroedingera Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF): J3399-B21; S.J.G. dziękuje za wsparcie ze strony grantów National Institutes of Health U19 AI104209, NS 080062 oraz z Programu Badań nad Chorobami Związanymi z Tytoniem na Uniwersytecie Kalifornijskim; L.L.R. dziękuje za wsparcie ze strony Arthritis National Research Foundation (ANRF) i grantu National Institutes of Health K99AI110645.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Roztwór Antybiotykowo-PrzeciwgrzybiczyCorning Cellgro30-004-Cl
3 ml StrzykawkaFalcon309656
35 mm x 10 mm NaczynieCorning cellgro430588
5 ml Polistyren Rurka z okrągłym dnemFalcon352058
Kwas octowyFisher ScientificA35-500
Alcian Blue 8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Wirówka Allegra 6RBeckman
Anti-Mouse CD16/32 (klon 93) OczyszczonaeBioscience14-0161-81
2-merkaptoetanolSigma AldrichM7522
BD 1 ml TB StrzykawkaBD309659
BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) IgłyBD Igła Precision Glide205155
BD 25 G 5/8 IgłyBD Strzykawka305122
Igły BD 30 G x 1/2 BDPrecision Glide305106
Blue MAX Jr, 15 ml Rurka stożkowa polipropylenowaFalcon352097
ChloroformFisher ScientificC298-500
Cytoseal 60 Medium montażoweRichard-Allan Scientific8310-4
Cytospin3ShandonNA
Długopis DakoCytomationDakoS2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
EtanolSigma AldrichE 7023-500ml
Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznieSigma AldrichF4135-500ml
FITC Sprzężony IgG2b K Kontrola izotypuszczura eBioscience14-4031-82
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) Sprzężony zestaw przeciw myszom (CD117; klon 2B8)eBioscience11-1171-82
FormaldehydFisher ScientificF79-500
Giemsa Stain ModyfikowanySigma AldrichGS-1L
IsothesiaHenry Schein Zdrowiezwierząt29405
Maj-Grunwaldzki StainSigma AldrichMG-1L
Multiwell 6-dołkowe płytkiFalcon35 3046
Mikroskop Olympus BX60OlympusNA
Paraplast Plus Medium do osadzania tkanekFisher Brand23-021-400
PE Sprzężona IgG Kontrola izotypu chomika ormiańskiegoeBioscience12-4888-81
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
Fikoerytryna (PE) Sprzężona anty-mysia FceRIa (klon MAR-1)eBioscience12-5898-82
Roztwór do barwienia jodku propydueBioscience00-6990-50
Rekombinowana mysz IL-3Peprotech213-13
Certyfikat Safranin-oSigma AldrichS8884
Kolby do hodowli tkankowych T25 25 cm2Beckton Dickinson353109
Kolby do hodowli tkankowych T75 75 cm2Beckton Dickinson353110
Błękit toluidynowy 1% WodnyLabChem-IncLC26165-2
Rekombinowany mysz SCFPeprotech250-03

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hodowlane kom rki tuczne pochodz ce z szpiku kostnegotransfer adopcyjnymyszy z niedoborem kom rek tucznychcytometria przep ywowaanaliza immunohistochemicznaprzeszczep sk rnyprzeszczep dootrzewnowyprzeszczep do ylny

Powiązane artykuły