Zastosowanie rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu w modelach wielotorbielowatości nerek u małych gryzoni do fenotypowania in vivo i monitorowania leków

Podsumowanie

Opisano zastosowanie rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu jako nieinwazyjny sposób uzyskiwania informacji fenotypowych o modelach gryzoni dla wielotorbielowatości nerek i monitorowania interwencji. W porównaniu z tradycyjnym podejściem histologicznym, obrazy MRI można uzyskać in vivo, co pozwala na długotrwałą obserwację.

Streszczenie

Kilka badań przedklinicznych in vivo w wielotorbielowatości nerek (PKD) wykorzystuje ortologiczne modele gryzoni do identyfikacji i badania genetycznych i molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za chorobę, i są bardzo wygodne do szybkiego badania przesiewowego leków i testowania obiecujących terapii. Czynnikiem ograniczającym w tych badaniach jest często brak skutecznych nieinwazyjnych metod sekwencyjnej analizy zmian anatomicznych i funkcjonalnych w nerce. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) jest obecnie złotym standardem obrazowania stosowanej u pacjentów z autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek (ADPKD), zapewniając doskonały kontrast tkanek miękkich i szczegóły anatomiczne oraz umożliwiając pomiary całkowitej objętości nerki (TKV). Główną zaletą rezonansu magnetycznego w modelach PKD u gryzoni jest możliwość obrazowania in vivo, co pozwala na badania podłużne z wykorzystaniem tego samego zwierzęcia, a tym samym zmniejszenie całkowitej liczby wymaganych zwierząt. W tym manuskrypcie skupimy się na wykorzystaniu rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu (UHF) do nieinwazyjnego pozyskiwania obrazów in vivo modeli gryzoni pod kątem PKD. Głównym celem niniejszej pracy jest wprowadzenie do zastosowania MRI jako narzędzia do charakterystyki fenotypowej in vivo i monitorowania leków w modelach gryzoni w kierunku PKD.

Wprowadzenie

Wielotorbielowatość nerek (PKD) obejmuje grupę zaburzeń monogenowych charakteryzujących się rozwojem torbieli nerek. Wśród nich znajdują się autosomalnie dominująca wielotorbielowatość nerek (ADPKD) i autosomalno-recesywna wielotorbielowatość nerek (ARPKD), które reprezentują najczęstsze typy^1,2. ADPKD, najczęstsza postać dziedzicznych torbielowatych chorób nerek, powstaje w wyniku mutacji w genach PKD1 lub PKD2. Charakteryzuje się późnym, mnogimi obustronnymi torbielami nerek, którym towarzyszą zmienne torbiele pozanerkowe, a także nieprawidłowościami układu krążenia i mięśni. ARPKD, najczęściej dotykające noworodki i małe dzieci, jest spowodowane mutacjami w PKHD1 i charakteryzuje się powiększeniem echogennych nerek i wrodzonym zwłóknieniem wątroby³.

Co ważne, ADPKD charakteryzuje się różnorodnością, zarówno na poziomie genów (genetycznych), jak i mutacji (allelicznych), co skutkuje znaczną zmiennością fenotypową. Mutacje w genie PKD1 są związane z ciężkim obrazem klinicznym (liczne torbiele, wczesna diagnoza, nadciśnienie tętnicze i krwiomocz), a także szybką progresją do schyłkowej niewydolności nerek (20 lat wcześniej niż u pacjentów z mutacjami PKD2)⁴. Ciężka wielotorbielowatość wątroby (PLD) i nieprawidłowości naczyniowe mogą być związane z mutacjami zarówno w PKD1, jak i PKD2⁵. Większość powikłań nerkowych ADPKD powstaje głównie w wyniku ekspansji torbieli wraz z towarzyszącym jej stanem zapalnym i zwłóknieniem. Rozwój torbieli rozpoczyna się w macicy i trwa przez całe życie pacjentki. Nerki zwykle zachowują swój kształt reniform, mimo że mogą osiągnąć ponad 20 razy większą objętość nerek. U większości pacjentów występuje obustronne rozmieszczenie torbieli nerek, ale w niektórych nietypowych przypadkach torbiel może rozwijać się jednostronnie lub asymetrycznie.

Głównym wyzwaniem dla nefrologów śledzących pacjentów z ADPKD lub wdrażających terapie jest naturalna historia choroby. Przez większość jego przebiegu czynność nerek pozostaje normalna, a do czasu, gdy czynność nerek zaczyna się pogarszać, większość nerek została zastąpiona torbielami. Gdy terapie są wdrażane na późniejszych etapach, jest mniej prawdopodobne, że zakończy się sukcesem, ponieważ pacjent mógł już osiągnąć punkt, z którego nie ma odwrotu w przewlekłej chorobie nerek. W przeciwieństwie do tego, gdy terapie rozpoczynają się na wczesnym etapie, trudno jest określić odpowiedź wyłącznie na podstawie współczynnika filtracji kłębuszkowej. W rezultacie zwrócono uwagę na objętość nerek jako marker postępu choroby.

Badanie Konsorcjum ds. Badań Obrazowania Radiologicznego Wielotorbielowatości Nerek (CRISP) wykazało, że u pacjentów z ADPKD wzrost objętości nerek i torbieli bezpośrednio koreluje z pogorszeniem funkcji nerek, podkreślając potencjał całkowitej objętości nerki (TKV) jako zastępczego markera progresji choroby^6,7. W związku z tym TKV jest obecnie stosowany jako pierwszorzędowy lub drugorzędowy punkt końcowy w wielu badaniach klinicznych dla ADPKD^2,8,9.

Wiele modeli mysich, w tym spontaniczne mutacje i genetycznie modyfikowane, rzuciło światło na patogenezę PKD^10,11. Najpopularniejsze stały się modele Pkd1 lub Pkd2 (mutacje w Pkd1 lub Pkd2), ponieważ doskonale naśladują choroby człowieka. Ponadto modele gryzoni z mutacjami w genach innych niż geny Pkd1 lub Pkd2 zostały wykorzystane jako platforma eksperymentalna do wyjaśnienia szlaków sygnałowych związanych z chorobą. Ponadto kilka z tych modeli wykorzystano do przetestowania potencjalnych terapii. Jednak czynnikiem ograniczającym w wielu badaniach na gryzoniach w kierunku PKD jest często brak skutecznych nieinwazyjnych metod sekwencyjnej analizy zmian anatomicznych i funkcjonalnych w nerkach.

Rezonans magnetyczny (MRI) jest obecnie złotym standardem techniki obrazowania do obserwacji pacjentów z ADPKD, zapewniając doskonały kontrast tkanek miękkich i szczegóły anatomiczne oraz umożliwiając pomiary TKV. Mimo że rezonans magnetyczny ma ugruntowaną pozycję w obrazowaniu anatomicznym u większych zwierząt i ludzi, obrazowanie małych gryzoni in vivo wiąże się z dodatkowymi wyzwaniami technicznymi, w przypadku których możliwość uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości może ograniczać jego przydatność. Dzięki wprowadzeniu rezonansu magnetycznego w ultrawysokim polu (UHF) (7-16,4 T) i opracowaniu silniejszych gradientów, możliwe jest obecnie osiągnięcie wyższych stosunków sygnału do szumu i rozdzielczości przestrzennej obrazów MRI o jakości diagnostycznej podobnej do uzyskiwanej u ludzi. W związku z tym wykorzystanie rezonansu magnetycznego UHF do obrazowania in vivo modeli małych gryzoni pod kątem PKD stało się potężnym narzędziem dla naukowców.

Protokół

Przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur na żywych zwierzętach, protokoły eksperymentalne powinny zostać zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC).

1. Konfiguracja skanera

1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że grzejnik jest w pozycji OFF.
2. Wybierz mini gradient obrazowania i cewkę RF 38 mm oraz mini uchwyt obrazowania.
3. W centralnym otworze uchwytu zamontuj zespół o zmiennej temperaturze.

2. Przygotowanie zwierząt

1. W przypadku eksperymentów MRI należy uzyskać optymalne znieczulenie za pomocą odparowanego izofluranu. W celu indukcji znieczulenia należy umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej wyłożonej chłonną tkanką. Ustawić przepływomierz parownika izofluranu na 2,0-2,5 l/min, a izofluranu na 3% tlenu.
2. Na tym etapie usuń wszelkie metalowe znaczniki lub inne metalowe przedmioty. Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
3. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (tj. utratę odruchu wycofania do szczypania palców), umieść zwierzę na uchwycie z nosem włożonym w stożek nosowy. Ustaw przepływ powietrza anestezjologicznego w sondzie na 2,0-2,5 ml/min, a stężenie izofluranu na 1,5-2,0% w tlenie. Podczas zabiegu znieczulenie będzie podawane przez stożek nosowy. Okresowo dostosowuj stężenie izofluranu w zależności od wieku i masy ciała zwierzęcia, aby utrzymać częstość oddechów na poziomie ~40 uderzeń na minutę.
4. Użyj uchwytów na zwierzęta, aby zabezpieczyć zwierzę na miejscu i zapobiec ruchowi podczas eksperymentu MRI. Zmieniaj rodzaj uchwytu na zwierzę w zależności od skanowanego obszaru ciała.
   Uwaga: Niestandardowe uchwyty z laboratoryjnych tworzyw sztucznych (polipropylen, teflon, polistyren, poliwęglan) mogą być wykonane w celu dostosowania do konkretnego eksperymentu i wielkości zwierzęcia (od nowonarodzonej myszy do 160 g szczura).
5. Umieść termometr doodbytniczy w zwierzęciu, aby monitorować temperaturę ciała zwierzęcia. Podczas eksperymentu utrzymuj zwierzę w temperaturze 35-37 °C, używając strumienia ciepłego powietrza. Dostosuj temperaturę powietrza (30-38 °C) i przepływ (1 200-2 000 l/h) w oparciu o informacje zwrotne dotyczące temperatury ciała zwierzęcia.
6. Przymocuj balonowy czujnik ciśnienia oddechowego do brzucha zwierzęcia, aby monitorować częstość oddechów.
7. Zabezpiecz zwierzę w środku cewki RF i ostrożnie umieść cewkę RF ze zwierzęciem w skanerze MRI.

3. Eksperyment MRI

1. Dostosuj i dopasuj cewkę RF przed rozpoczęciem eksperymentów, aby zminimalizować zużywaną moc RF i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu. Aby rozpocząć dopasowywanie/dostrajanie:
   1. Otwórz narzędzie sterujące spektrometrem, klikając ikonę narzędzi.
   2. W narzędziu do sterowania spektrometrem kliknij opcję Acquisition → Wobble (Akwizycja) Otworzy się okno Acq/Reco wyświetlające krzywą chybotania.
   3. Alternatywnie dostosuj kondensatory strojące i dopasowujące (za pomocą prętów strojeniowych i dopasowujących) małymi krokami, aż odbita moc RF zostanie zminimalizowana. Celem jest zobaczenie krzywej z minimum na osi pionowej umieszczonej na zero na osi poziomej.
   4. Po pomyślnym zakończeniu kalibracji cewki naciśnij przycisk Stop w oknie Acq/Reco.
2. Uzyskuj obrazy zwiadowcze w trzech płaszczyznach ortogonalnych, aby tworzyć obrazy osiowe, koronalne i strzałkowe. Użyj szybkiej sekwencji obrazów, takiej jak Intra Gate Fast Low Angle Shot (IG-FLASH), aby uzyskać obrazy zwiadowcze¹². Użyj obrazów zwiadowczych, aby ustawić odpowiednią geometrię dla rzeczywistego obrazowania.
3. W zależności od konkretnych celów badawczych należy dobrać odpowiednią sekwencję i parametry obrazu, a następnie rozpocząć skanowanie za pomocą sygnalizacji świetlnej. Spowoduje to kalibrację kanału RF, podkładkę magnesu, ustawienie rezonansu częstotliwości nośnej dla wody i dostosowanie wzmocnienia odbiornika, wszystko automatycznie.
   1. W przypadku badań anatomicznych i obrazów ważonych T2 pobieraj w trybie wielowarstwowym 2D lub 3D. Aby skrócić czas eksperymentu dla danej rozdzielczości przestrzennej, utrzymuj pole widzenia (FOV) tak małe, jak to możliwe, ale wystarczająco duże, aby uniknąć zawijania artefaktów (2,56-3,2 cm).
4. Utrzymuj cykl wybranej sekwencji nieco krótszy niż cykl oddychania zwierzęcia poprzez odpowiedni dobór czasu powtarzania (TR) i/lub liczby plastrów. Dzięki temu dane są zbierane w okresie ciszy zwierząt.
   1. Na przykład w przypadku obrazów jamy brzusznej utrzymuj częstość oddechów zwierzęcia na poziomie ~30 uderzeń na minutę, czyli około 2000 ms na oddech. Użyj sekwencji Turbo Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement (RARE) i uzyskaj 11-19 wycinków koronalnych, z TR/TE 1500/9 ms, RARE factor 8 i (matryca 256 x 256, FOV 2,56 x 2,56 cm, grubość plastra 0,75 mm).
      Uwaga: Dostosowując TR do 1,500 ms i utrzymując częstość oddechów zwierzęcia na poziomie ~30 uderzeń na minutę (2,000 ms na oddech), zapewniamy, że dane są zbierane w okresie ciszy zwierząt.
5. Po zakończeniu akwizycji obrazu umieść zeskanowane zwierzę na podgrzewanej podkładce i monitoruj do czasu rozpoczęcia ruchu. Po powrocie do zdrowia zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce i monitorować przez co najmniej 1 godzinę przed powrotem do obiektu dla zwierząt.

Wyniki

W niniejszym manuskrypcie dążymy do wykazania użyteczności UHF MRI jako narzędzia do fenotypowej charakterystyki in vivo lub monitorowania działania leków w modelach gryzoni w PKD i innych chorobach nerek. Wszystkie eksperymenty były częścią protokołów eksperymentalnych zatwierdzonych przez IACUC.

In vivo fenotypowanie modeli małych gryzoni z PKD przy użyciu UHF MRI:

Wszystkie badania obrazowe przeprowadzono na żywych zwierzętach w znieczuleniu izoflu...

Dyskusja

Niniejszy artykuł przedstawia możliwość wykorzystania rezonansu magnetycznego UHF jako narzędzia do charakterystyki fenotypowej in vivo lub monitorowania leków w modelach gryzoni pod kątem PKD.

Opisujemy eksperymenty wykonane przy ciśnieniu 16,4 T za pomocą spektrometru NMR o wysokiej rozdzielczości Avance III o szerokim otworze, wyposażonego w akcesoria do obrazowania mikro i mini. Spektrometr był napędzany przez oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania TopSpin2.0PV kontrolowane p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Dwukanałowy spektrometr wielojądrowy o szerokim otworze wyposażony w akcesoria do mini i mikroobrazowania do obrazowania małych gryzoni in vivo
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Oprogramowanie do przetwarzania spektrometrów
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Oprogramowanie do obrazowania
VTU BVT 3000 cyfrowe	Regulator temperatury Bruker	W1101095