Celem tego protokołu jest pokazanie skutecznej techniki izolowania całego, nienaruszonego rdzenia i kory ciała szklistego z pośmiertnych wyłuszczonych oczu świń.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sekcja całego ciała szklistego do analizy witreodynamicznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Autorzy proponują skuteczną technikę izolowania całego, nienaruszonego rdzenia i kory ciała szklistego z pośmiertnie wyłuszczonych oczu świń. Podczas gdy poprzednie badania wykazały wyniki takich sekcji, szczegółowe etapy nie zostały opisane, co uniemożliwia badaczom spoza tej dziedziny powtórzenie ich metod. Inne badania pobierają ciało szkliste albo przez aspirację, która nie utrzymuje anatomii struktury ciała szklistego, albo przez częściową dyspreparację, która izoluje tylko rdzeń ciała szklistego. Proponowana metoda polega na izolacji całego ciała szklistego, z nienaruszonym rdzeniem i korą ciała szklistego, przy zachowaniu anatomii ciała szklistego i integralności strukturalnej. W tej metodzie najpierw tworzony jest płat twardówkowy o pełnej grubości w wyłuszczonym oku świni, dzięki czemu można oddzielić tkankę naczyniówki od twardówki. Płat twardówkowy jest następnie rozszerzany, a naczyniówka jest całkowicie oddzielona od twardówki. Na koniec tkanka naczyniówkowo-siatkówkowa jest odrywana od ciała szklistego, aby pozostawić izolowane nienaruszone ciało szkliste. Proponowana technika preparacji ciała szklistego może być wykorzystana do badania właściwości fizycznych ciała szklistego. W szczególności metoda ta ma znaczenie dla badań eksperymentalnych obejmujących dostarczanie leków, transport tlenu w ciele szklistkowo-siatkówkowym oraz konwekcję wewnątrzgałkową.
Wprowadzenie
Celem tej metody jest szczegółowe opisanie techniki izolowania całego, nienaruszonego ciała szklistego, z nienaruszonym rdzeniem ciała szklistego i korą, z oka zwłok, dla celów analizy witreodynamicznej. Wraz z rozwojem fizjologii ciała szklistego multidyscyplinarni naukowcy, tacy jak naukowcy zajmujący się mechaniką płynów, badają fizyczne i biomechaniczne właściwości ciała szklistego1. W tym celu konieczne jest wyszczególnienie techniki izolowania całego, nienaruszonego ciała szklistego, aby pomóc multidyscyplinarnym badaczom.
Sebag et al.2 i inni3 przeprowadzili eleganckie sekcje całego ciała szklistego na ludzkich zwłokach i pokazali ilustracje wyników. Zastosowana technika nie została jednak szczegółowo opisana, a osoby niebędące ekspertami nie byłyby w stanie samodzielnie odtworzyć tej metody. W innych badaniach pobrano ciało szkliste z oczu zwłok przy użyciu prostszych metod, takich jak aspiracja lub częściowa sekcja, z których obie nie skutkują uzyskaniem całego, nienaruszonego ciała szklistego. Gisladottis i wsp.4 oraz Xu i wsp.5 Zbadaj przepuszczalność ciała szklistego pobranego z oczu zwłok. Ponieważ jednak nie opisano żadnej metody ekstrakcji ciała szklistego, założono, że odsysają oni ciało szkliste za pomocą strzykawki. Watts i wsp.6 poszedł o krok dalej, opisując metodę izolowania ciała szklistego królika za pomocą techniki chirurgicznej. Jednak ta metoda powoduje izolację tylko rdzenia ciała szklistego, a nie kory ciała szklistego. Skeie i wsp.7 później podzielił ciało szkliste na 4 unikalne regiony i elegancko opisał metodę preparowania każdej części do analizy. Technika ta nie prowadzi jednak do powstania nienaruszonego ciała szklistego jako całości.
Obecna technika została opracowana, aby ułatwić eksperymenty biofizyczne, które obecnie są wykonywane tylko na oczach zwłok. Poprzednie metody, jak opisano powyżej, są ograniczone, ponieważ: 1) żadna z nich nie izoluje całkowicie całego ciała szklistego, 2) pobrany rdzeń i kora ciała szklistego są homogenizowane, 3) struktura anatomiczna ciała szklistego nie jest zachowana, lub 4) techniki preparacji nie są odpowiednio szczegółowe do powtórzenia przez badaczy z innych dziedzin. Ponadto, ze względu na zmętnienie twardówki i naczyniówki, wizualizacja ciała szklistego jest ograniczona w nienaruszonej gałce ocznej. Ogranicza to precyzję i wykonalność pomiarów, które można wykonać wewnątrz całego oka. Ponadto struktury anatomiczne otaczające ciało szkliste mogą zakłócić badanie właściwości biochemicznych i fizycznych ciała szklistego.
W ostatnich latach ciało szkliste ogromnie się rozrosło i istnieją powody, aby sądzić, że całe ciało szkliste ma inne właściwości niż jego poszczególne części. Rośnie zainteresowanie badaniem właściwości fizycznych, biomechanicznych i chemicznych ciała szklistego w badaniach witreodynamicznych, które mają zastosowanie w medycynie klinicznej, takiej jak dostarczanie leków, natlenianie doszklistkowe8 i witrektomia. Witreodynamika farmakologiczna, która wykorzystuje środki farmakologiczne do manipulowania ciałem szklistym, może być stosowana w celu poprawy wyników witrektomii9. Właściwości biomechaniczne są wykorzystywane do modelowania przepływu płynu w ciele szklistym, co można wykorzystać do ulepszenia technologii dostarczania leków do ciała szklistego10–12. Właściwości fizyczne różnych segmentów ciała szklistego mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia transportu tlenu w stanie szklistym i siatkówkowym13. Proponowana technika preparacji ciała szklistego może być wykorzystana do badania różnych właściwości nienaruszonego ciała szklistego. Umożliwia przeprowadzanie eksperymentów laboratoryjnych na całych, nienaruszonych ciałach szklistych z lepszą wizualizacją.
Podsumowując, obecne metody badania ciała szklistego albo nie są odpowiednio opisane, albo skutkują niekompletną izolacją rdzenia i kory ciała szklistego. W związku z tym istnieje potrzeba przeprowadzenia eksperymentów na przezroczystym modelu oka przy zachowaniu anatomii ciała szklistego, które istnieje w oku zwłok
.Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie wyłuszczone oczy zostały uzyskane z rzeźni, a wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
- Przymocuj wyłuszczone oko do powierzchni. W tym celu należy umieścić szpilki do tkanek w nadmiarze tkanki wokół oka i przymocować je do płyty styropianowej.
- Wypreparuj i odłącz spojówkę okołolimbową od oka.
- Użyj cienkich kleszczy (0,3 kleszczyka) i mikronożyczek (nożyczki Westcotta), aby naciąć spojówkę na rąbku i tępo odciąć ją od twardówki. Przetnij spojówkę wzdłuż rąbka, gdy rozwarstwienie postępuje, aby umożliwić dalszą sekcję.
- Usuń spojówkę na całej długości oka (360 stopni), aby odsłonić jak najwięcej twardówki.
UWAGA: Pomocne jest pozostawienie niewielkiej ilości spojówki, aby ułatwić mocowanie oka za pomocą szpilek chirurgicznych lub kleszczy podczas pozostałej części zabiegu.
- Utwórz płat twardówki o pełnej grubości wzdłuż jednej strony oka (ostrze skalpela 69).
- Wykonaj nacięcie twardówki o średnicy ~5 mm równolegle do rąbka i 3 mm z tyłu do rąbka, delikatnie nacinając twardówkę skalpelem (ostrze skalpela 11), aż do wyświetlenia ciemno zabarwionego naczyniówki. Uważaj, aby nie naciąć samego naczyniówki.
- Ostrożnie wypreparuj wzdłuż płaszczyzny między twardówką a naczyniówką, nożyczkami (przy użyciu sekcji) lub skalpelem, aż będzie można powiększyć potencjalną przestrzeń między tymi tkankami, delikatnie popychając naczyniówkę do środka.
- Wykonaj kolejne nacięcie twardówki prostopadle do pierwszego nacięcia twardówki ostrymi mikronożyczkami, tworząc nacięcie w kształcie litery T.
- Następnie kontynuuj preparowanie w sposób obwodowy, aby usunąć tkankę twardówki z leżącego poniżej naczyniówki i delikatnie odepchnij naczyniówkę od twardówki, jak wspomniano powyżej.
- W razie potrzeby powiększ płat twardówki.
- Delikatnie tępo, wypreparuj naczyniówkę z dala od twardówki przez cały proces.
- Powiększaj płatek, aż nacięcie wykonane prostopadle do rąbka dotrze do nerwu wzrokowego, a nacięcie wykonane równolegle do rąbka będzie miało co najmniej jedną trzecią obwodu oka (45°).
- Użyj płata twardówki jako źródła dźwigni do manipulowania okiem podczas rozwarstwienia. Przeciwbieżna trakcja na klapie ułatwia rozwarstwienie.
- Powtórz poprzedni krok na drugim płatze twardówkowym.
- Odetnij płaty twardówkowe, aby odsłonić duży obszar naczyniówki.
- Kontynuuj nacięcie wykonane w kroku 3 wokół obwodu oka (360 stopni).
- Usuń pozostałą tkankę naczyniówkowo-siatkówkową.
- W odsłoniętym obszarze użyj bawełnianej końcówki, aby delikatnie zetrzeć pozostałą tkankę naczyniówkowo-siatkówkową. Alternatywnie, delikatnie chwyć tkankę kleszczami i oderwij ją od leżącego pod spodem ciała szklistego.
- W razie potrzeby wykonaj nacięcie w naczyniówce, zaczynając od nerwu wzrokowego. Następnie delikatnie oderwij naczyniówkę, aby odsłonić siatkówkę i korę ciała szklistego.
- Kontynuuj preparowanie naczyniówki z dala od twardówki, a następnie oderwij naczyniówkę, aby uzyskać całe, nienaruszone ciało szkliste.
- Użyj obręczy twardówki przymocowanej do rogówki, aby ustawić całe ciało szkliste w pożądanym miejscu. W tym momencie ciało szkliste jest przyczepione do przedniej twardówki i soczewki.
- Tępo wypreparuj ciało szkliste od wewnętrznej strony twardówki, wokół soczewki, usuwając całą twardówkę.
- W razie potrzeby użyj narzędzia, aby zgarnąć soczewkę z ciała szklistego. Użyj próbki do różnych eksperymentów witreodynamicznych.
- Umieścić próbkę w szklanej zlewce o znanej powierzchni wystawionej na działanie powietrza. Umieść sondę wrażliwą na tlen na krawędzi próbki. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć sondę na znaną odległość (r) w głąb próbki.
- Użyj praw dyfuzji Ficka, aby uzyskać teoretyczne równanie dyfuzji. Na podstawie danych zebranych w kroku 10.1 uzyskaj eksperymentalny współczynnik dyfuzji/termin reakcji itp.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Postępowanie zgodnie z protokołem pozwoli na prawidłowe wycięcie ciała szklistego przy zachowaniu nienaruszonego rdzenia i kory (Rycina 3). Świadczą o tym pozostałe fragmenty siatkówki przylegające do kory ciała szklistego. Nienaruszone, całe ciało szkliste może być wykorzystane na kilka sposobów w specyficznych eksperymentach witreodynamicznych. W naszym przypadku badano szybkość dyfuzji tlenu w nienaruszonym ciele szklistym oraz odpowiadającą jej stałą czasową (Rycina 2). Ciało szklist...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieją dwa krytyczne etapy, które należy dokładnie wykonać podczas rozwarstwienia ciała szklistego. Krok 3, stworzenie płata twardówki o pełnej grubości, ma kluczowe znaczenie dla całego rozwarstwienia. Należy uważać, aby nie przeciąć naczyniówki podczas tworzenia płata twardówki o pełnej grubości. Drugim krytycznym krokiem jest wypreparowanie twardówki z naczyniówki. Ten krok należy wykonać ostrożnie, aby zapobiec tworzeniu się wielu otworów w naczyniówce, z których może ciało szkliste. Istnieje sposób na modyfikację ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy wymieniają następujące źródła finansowania: Whittier Foundation, Harrington Foundation, National Institutes of Health and Research to Prevent Blindness.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,3 kleszczyka | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Nożyczki do tenotomii zakrzywione w prawo | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Rękojeść skalpela nr 3 | VWR | 25607-947 | |
| Ostrze skalpela, #11, do uchwytu #3 | VWR | 470174-844 |
Bibliografia
- Siggers, J. H., Ethier, C. R. Fluid Mechanics of the Eye. Annual Review of Fluid Mechanics. 44 (1), 347-372 (2012).
- Sebag, J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 225 (2), 89-93 (1987).
- Grignolo, A. Fibrous components of the vitreous body. AMA Arch Ophthalmol. 47 (6), 760-774 (1952).
- Gisladottir, S., Loftsson, T., Stefansson, E. Diffusion characteristics of vitreous humour and saline solution follow the Stokes Einstein equation. G Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 (12), 1677-1684 (2009).
- Xu, J., Heys, J. J., Barocas, V. H., Randolph, T. W. Permeability and diffusion in vitreous humor: implications for drug delivery. Pharm Res. 17 (6), 664-669 (2000).
- Watts, F., Tan, L. E., Wilson, C. G., Girkin, J. M., Tassieri, M., Wright, A. J. Investigating the micro-rheology of the vitreous humor using an optically trapped local probe. Journal of Optics. 16 (1), 015301(2014).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), e2455(2011).
- Abdallah, W., Ameri, H., et al. Vitreal oxygenation in retinal ischemia reperfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 1035-1042 (2011).
- Goldenberg, D., Trese, M. Pharmacologic vitreodynamics: what is it? Why is it important. Expert Review of Ophthalmology. 3 (3), 273-277 (2008).
- Choonara, Y. E., Pillay, V., Danckwerts, M. P., Carmichael, T. R., du Toit, L. C. A review of implantable intravitreal drug delivery technologies for the treatment of posterior segment eye diseases. J Pharm Sci. 99 (5), 2219-2239 (2010).
- Balachandran, R. K., Barocas, V. H. Computer modeling of drug delivery to the posterior eye: effect of active transport and loss to choroidal blood flow. Pharm Res. 25 (11), 2685-2696 (2008).
- Smith, C. a, Newson, T. a, et al. A framework for modeling ocular drug transport and flow through the eye using micro-CT. Phys Med Biol. 57 (19), 6295-6307 (2012).
- Quiram, P. A., Leverenz, V. R., Baker, R. M., Dang, L., Giblin, F. J., Trese, M. T. Microplasmin-induced posterior vitreous detachment affects vitreous oxygen levels. Retina. 27 (8), 1090-1096 (2007).
- Shui, Y., Holekamp, N. The gel state of the vitreous and ascorbate-dependent oxygen consumption: relationship to the etiology of nuclear cataracts. Arch Ophthalmol. 127 (4), 475-482 (2009).
- Burk, S. E., Da Mata, A. P., Snyder, M. E., Schneider, S., Osher, R. H., Cionni, R. J. Visualizing vitreous using kenalog suspension. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 645-651 (2003).
- Spaide, R. Visualization of the Posterior Vitreous with Dynamic Focusing and Windowed Averaging Swept Source Optical Coherence Tomography. Am J Ophthalmol. S0002-9394 (14), 00537-00536 (2014).
- Domalpally, A., Gangaputra, S., Danis, R. P. Diseases of the Vitreo-Macular Interface. 21, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. 21-27 (2014).
- Stocchino, R., Repetto, A., Cafferata, C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model. Phys Med Biol. 50 (19), 4729-4743 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
