Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Podsumowanie

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Streszczenie

Narażenie na substancje chemiczne (w tym alkilujące chemiczne środki bojowe, takie jak iperyty siarkowe i azotowe) powoduje mnóstwo objawów klinicznych, w tym zaburzenia gojenia się ran. Fizjologiczny proces gojenia się ran jest bardzo złożony. Tworzenie się ziarniny jest kluczowym etapem w tym procesie, który prowadzi do wstępnego zamknięcia rany i zapewnienia sieci nowych naczyń krwionośnych naczyń włosowatych – albo poprzez waskulogenezę (tworzenie powieści), albo angiogenezę (kiełkowanie istniejących naczyń). Zarówno naczynia krwionośne, jak i angiogeneza wymagają funkcjonalnej, ukierunkowanej migracji komórek śródbłonka. W związku z tym badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii zaburzeń gojenia się ran wywołanych chemikaliami i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej.

Oceniliśmy upośledzone gojenie się ran po ekspozycji na środek alkilujący i przetestowaliśmy potencjalne związki kandydujące do leczenia. Zastosowaliśmy zestaw technik opisanych w tym protokole. Opisano zmodyfikowaną komorę Boydena do ilościowego badania chemokinezy EWG. Ponadto zilustrowano zastosowanie testu gojenia się ran w połączeniu z analizą torów w celu jakościowej oceny migracji. Na koniec demonstrujemy zastosowanie barwnika fluorescencyjnego TMRM do badania potencjału błony mitochondrialnej w celu identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw zaburzonej migracji komórek. Poniższy protokół opisuje podstawowe techniki, które zostały dostosowane do badania EWG.

Wprowadzenie

Migracja komórek jest ważna w wielu procesach fizjologicznych i patofizjologicznych, w tym w rozwoju, różnych chorobach i gojeniu się ran po urazach skóry.

Po urazie skóry, stan zapalny usuwa uszkodzoną lub martwiczą tkankę, a ziarninacja prowadzi do wstępnego zamknięcia rany i umożliwia tworzenie sieci nowych naczyń włosowatych poprzez waskulogenezę (tworzenie powieści) lub angiogenezę (kiełkowanie istniejących pęcherzyków)^1-3. Zarówno naczynia krwionośne, jak i angiogeneza wymagają migracji komórek śródbłonka. Rosnąca sieć naczyń krwionośnych jest niezbędna do transportu tlenu i składników odżywczych do proliferujących keratynocytów, które ostatecznie ulegają keratynizacji, tworzą nowy nabłonek i zapewniają zamknięcie rany.

Upośledzona migracja komórek śródbłonka jest podstawową przyczyną zaburzeń gojenia się ran^4,5. W związku z tym potrzebne są metody oceny migracji wczesnych komórek śródbłonka, aby zbadać patofizjologię zaburzeń migracji komórek i zidentyfikować nowe strategie interwencji terapeutycznej.

Narażenie skóry na czynniki alkilujące (np. iperyty siarkowe i azotowe) powoduje zaburzenia gojenia się ran⁶. Związki te były używane jako chemiczne środki bojowe w kilku konfliktach w XX wieku i nadal budzą duże zaniepokojenie ze względu na istniejące zapasy w niestabilnych politycznie regionach i stosunkowo prostą syntezę. Chociaż iperyt siarkowy został po raz pierwszy zsyntetyzowany w 1822 roku, molekularna i kliniczna patologia ekspozycji na SM nie jest szczegółowo poznana i nie zidentyfikowano antidotum na ekspozycję na SM.

Przeprowadzono kilka badań, aby zrozumieć i modelować upośledzone gojenie ran po ekspozycji na SM oraz przetestować potencjalne potencjalne związki zdolne do zachowania tego efektu. Schmidt i in. (2009) przetestowali wpływ chlorambucylu, związku alkilującego o właściwościach podobnych do SM w modelach ciała myszy embrionalnych i stwierdzili dramatyczne, czasami ponad 99% zmniejszenie tworzenia naczyń⁷. To niekorzystne działanie było najbardziej widoczne na etapie rozwoju, który w warunkach fizjologicznych jest zdominowany przez proliferację i migrację komórek prekursorowych śródbłonka naczyń krwionośnych. W związku z tym stwierdzono, że komórki te są szczególnie wrażliwe na czynniki alkilujące. Steinritz i in. (2010) przetestowali zmiatacze reaktywnych form tlenu (ROS), w szczególności N-acetylocysteiny (NAC) i kwasu alfa-linolenowego (ALA) pod kątem ich zdolności do zmniejszania toksyczności SM w modelach ciała zarodków myszy, a w szczególności do przywracania tworzenia naczyń⁸. Zaobserwowano tymczasowe działanie ochronne, co wskazuje, że nadmierne tworzenie ROS może przyczyniać się do niekorzystnego wpływu SM na gojenie się ran. Efekty te nie były trwałe, a dwa kandydujące związki mogą nie być zdolne do przywrócenia tworzenia naczyń krwionośnych i gojenia się ran w dłuższej perspektywie⁸. Eksperymenty te zostały jednak przeprowadzone na złożonym modelu 3D, który pozwolił na zbadanie migracji komórek. W związku z tym następnie przetestowaliśmy NAC i ALA pod kątem korzystnego wpływu na migrację komórek EWG, które odgrywają kluczową rolę w procesie tworzenia naczyń^{krwionośnych 9}.

Ponadto, istnieją dowody na to, że polaryzacja komórek jest wymagana do migracji komórek. Wykazano, że dysfunkcja mitochondriów prowadząca do powstawania ROS upośledza polaryzację komórek, a tym samym może niekorzystnie wpływać na migrację komórek. W związku z tym przeprowadzono obrazowanie żywych komórek pod kątem funkcji mitochondriów oraz zbadano działanie zmiataczy ROS. Poniższy protokół opisuje ogólne wymagania dotyczące uprawy EWG, testu w komorze Boydena, testu gojenia się ran, w tym analizy śledzenia komórek oraz szczegółowego stosowania TMRM do oceny funkcji mitochondriów. Podkreślono ważne aspekty protokołów doświadczalnych dotyczących uprawy i migracji EWG.

Protokół

Poniższy protokół opisuje techniki badania wczesnej migracji komórek śródbłonka. Właściwa hodowla komórek śródbłonka naczyń krwionośnych wymaga wstępnego pokrycia kolb hodowli komórkowych żelatyną, aby zapewnić prawidłową proliferację i utrzymanie fenotypu śródbłonka.

1. Wstępne powlekanie kolb do hodowli komórkowych

1. Rozpuścić żelatynę w 0,1 M PBS do końcowego stężenia 0,1%.
2. Autoklawuj roztwór z parametrami do autoklawowania płynnego (szczegóły znajdują się w instrukcji konkretnego autoklawu).
3. Dodać wystarczającą objętość autoklawizowanego roztworu żelatyny do sterylnej kolby do hodowli komórkowych (np. co najmniej 5 ml w przypadku kolby do hodowli komórek T25).
4. Przenieść kolby do inkubatora (37°C, 5% CO₂ nie jest wymagane, ale nie przeszkadza) na co najmniej 30 minut.
5. Usuń pozostały roztwór żelatyny. Kolby z powłoką należy następnie wykorzystać (patrz hodowla komórek) lub przechowywać w sterylnych warunkach do momentu użycia.

2. Hodowla wczesna komórek śródbłonka

Uwaga: Embrionalne komórki macierzyste pochodzące z wczesnych komórek śródbłonka (EEC) uzyskano ze zróżnicowanych mysich ciał embrionalnych poprzez aktywowane magnetycznie sortowanie komórek frakcji PECAM-1 dodatniej, jak opisano wcześniej^10,11.

1. Hodowla EEC na pokrytych żelatyną szalkach do hodowli komórkowych w DMEM uzupełnionych 15% FCS, 50 U/ml penicyliny, 50 U/ml streptomycyny, 200 μM L-glutaminy, 100 μM ß-merkaptoetanolu i 1% aminokwasów endogennych. Z komórkami należy obchodzić się w sterylnych warunkach. Hodować komórki z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C i wilgotności 95% aż do konfluencji (maks. 80%).
2. W przypadku konfluencji pod-konfluencji podziel komórki w stosunku 1:5. Uwaga: Oderwanie komórek śródbłonka jest krytycznym krokiem.
   1. Zbierz komórki za pomocą akutazy RT. Usunąć podłoże, spłukać PBS i dodać 1 ml akutazy na 25 cm².
   2. Inkubować kolbę w temperaturze pokojowej przez 2-10 minut, aż komórki się oderwą. Rozproszyć komórki i przenieść je do żądanej aplikacji. Uwaga: Chemiczna neutralizacja akutazy nie jest wymagana, ponieważ ma ona miejsce, gdy wysiane komórki są przechowywane w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jednak aktywność akutazy można również zmniejszyć, dodając DMEM zawierający FCS.

3. Komnata Boydena

Uwaga: Testy w komorze Boydena są wykonywane przy użyciu systemów wkładek z politereftalanu etylenu o wielkości porów 8 μm.

1. Wstępnie pokryć wkłady filtracyjne (które mieszczą się w studzienkach hodowli komórkowych, tworząc w ten sposób komorę Boydena), dodając 500 μl 0,1% żelatyny rozpuszczonej w 0,1 M PBS przez co najmniej 30 minut.
2. Jeśli komórki mają być narażone na działanie toksycznych substancji chemicznych, przed pobraniem komórek należy je poddać działaniu zgodnie ze specjalnym projektem doświadczalnym. Uwaga: Komórki wystawiono na działanie 12,5 μg chlorambucylu/ml DMEM przez 24 godziny. W odniesieniu do konkretnego projektu eksperymentalnego, instrukcje mogą się różnić.
3. Zebrać EWG i określić liczbę komórek za pomocą komory zliczającej. Uwaga: Można używać automatycznych urządzeń liczących, ale należy ich używać ostrożnie: ręczne liczenie komórek jest dokładniejsze i jest wysoce zalecane.
4. Dodać 500 μl pożywki do hodowli komórkowych do dolnej komory komory Boydena.
5. Dodać dokładnie 10⁴ EWG w 500 μl pożywki do hodowli komórkowych na wkład filtracyjny w górnej komorze komory. Wyeliminuj bąbelki.
6. Inkubować wkłady filtracyjne w inkubatorze dokładnie przez 8 godzin.
7. Spłucz raz PBS i zastąp pożywkę 0,5 ml 4% paraformaldehydu w obu komorach przez 25 minut w celu utrwalenia komórek. Dokładnie umyj filtr, ale co najmniej 3 razy za pomocą 0.1 M PBS.
8. Wytnij błony skalpelem.
9. Zamontuj membranę między dwoma szkiełkami nakrywkowymi z medium montażowym zawierającym DAPI do barwienia jądrowego. Zwróć uwagę na orientację. Upewnij się, że liczone są tylko komórki, które migrowały w kierunku dolnej strony komory membrany.
10. Policz komórki, które migrowały w kierunku dolnej strony przedziału membrany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 400-krotnym powiększeniu. Nie należy mylić porów błony z migrowanymi komórkami (ryc. 1A, 1B). Zbadaj rozsądną liczbę kontrprób biologicznych (co najmniej 3 kontrpróby biologiczne na warunek).

4. Test gojenia się ran

1. W zależności od dostępnego sprzętu starannie wybierz szalki lub płytki do hodowli komórkowych: Podczas korzystania z mikroskopii DIC unikaj plastikowych naczyń hodowlanych lub płytek studzienkowych, ale zamiast tego używaj urządzeń na bazie szkła.
   Uwaga: W przypadku korzystania z mikroskopii z kontrastem fazowym można również używać naczyń na bazie tworzywa sztucznego.
2. Uprawiać EEC w odpowiednim urządzeniu do hodowli komórkowej (np. na szalce Petriego ze szklanym dnem o średnicy 4 cm, odpowiedniej do obrazowania żywych komórek) aż do 80% konfluencji. Ważne: nie hoduj komórek do całkowitego zgrania.
3. Zdrap monowarstwy sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 10 μl. Delikatnie dociśnij końcówkę bez zbytniego nacisku na powierzchnię naczynia i przesuwaj ją płynnie w linii prostej z jednej strony na drugą. Umyj komórki dwukrotnie 0,1 M PBS, aby usunąć oderwane komórki.
4. Dodaj wystarczającą ilość pożywki do naczynia hodowlanego. W razie potrzeby dodać związki, które powinny zostać zbadane.
   Uwaga: Dodano 1,5 ml pożywki zawierającej 15 ng/ml kwasu alfa-linolenowego.
5. Zamontuj szalkę hodowlaną pod mikroskopem zdolnym do obrazowania żywych komórek. Zapewnić 5% CO₂, 37 °C i nawilżoną atmosferę.
   Uwaga: Nawilżanie jest szczególnie ważne, aby uniknąć parowania medium.
6. Rób zdjęcia poklatkowe w ciągu 24 godzin w odstępach 10-minutowych. Zaplanuj duże rozmiary plików. Uwaga: Rozdzielczość 512 x 512 pikseli jest zwykle wystarczająca; Zalecamy jednak używanie obrazów o wymiarach co najmniej 1 024 x 1 024.
7. Zmierz szerokość szczeliny przy t = 0 godz. i przy t = 24 godz. za pomocą narzędzia do pomiaru długości w oprogramowaniu dostarczonym z mikroskopem lub użyj oprogramowania typu open source (np. ImageJ). Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, specjalne oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu jest dostarczane przez producenta. Dlatego szczegółowe informacje techniczne dotyczące korzystania z oprogramowania można znaleźć w instrukcji.

5. Śledzenie komórek

1. W zależności od dostępnego sprzętu starannie wybierz szalki lub płytki do hodowli komórkowych: Podczas korzystania z mikroskopii DIC unikaj plastikowych naczyń hodowlanych lub płytek studzienkowych, ale zamiast tego używaj urządzeń na bazie szkła.
   Uwaga: W przypadku korzystania z mikroskopii z kontrastem fazowym można również używać naczyń na bazie tworzywa sztucznego.
2. Wysiewać 5 x 10⁴ EEC w uzupełnionym DMEM w odpowiednim urządzeniu do hodowli komórkowej (np. na 24-dołkowej płytce) i hodować komórki z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C i wilgotności 95% przez 1-2 dni.
3. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, należy usunąć pożywkę i wyhodować komórki z nową pożywką w obecności odpowiednich substancji badanych (np. 12,5 μg chlorambucylu / ml DMEM). Należy zawsze włączyć komórki kontrolne (poddane działaniu rozpuszczalnika, np. etanolu) w temperaturze 37 °C przez określony czas (24 godziny, w zależności od indywidualnego systemu oznaczania).
4. Zamontuj naczynie hodowlane pod mikroskopem zdolnym do obrazowania żywych komórek (37 °C, 5% CO₂ i 95% wilgotności). Rejestruj zdjęcia poklatkowe w ciągu 24 godzin w określonych odstępach czasu. Rejestruj obrazy w odstępach 10-minutowych.
5. Wykonaj ręczne śledzenie EEC za pomocą wtyczki ImageJ MTrackJ. Wybierz losowo 10 komórek z pola widzenia i śledź ich ruchy, dodając punkt danych na punkt w czasie za pomocą polecenia "Dodaj" MTrackJ.

Uwaga: MTrackJ jest dostępny za darmo na [Meijering, \Mtrackj." http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ "], a ImageJ jest dostępny na [Rasband, \Imagej." http://rsbweb.nih.gov/ij/ "]. Szczegółowa instrukcja na temat wtyczki MTrackJ jest dostępna pod adresem "http://www.imagescience.org".

6. Obrazowanie żywych komórek/ocena potencjału błony mitochondrialnej

1. Uprawiać EEC w odpowiednim urządzeniu do hodowli komórkowej (np. na szalce Petriego ze szklanym dnem o średnicy 4 cm, odpowiedniej do obrazowania żywych komórek) do 80% konfluencji.
   Ważne: Nie hoduj komórek w celu całkowitego zbieżności.
2. W razie potrzeby wystaw ogniwa na działanie chemikaliów. Uwaga: Komórki wystawiono na działanie 12,5 μg/ml chlorambucylu przez 24 godziny. W odniesieniu do konkretnego projektu eksperymentalnego, instrukcje mogą się różnić.
3. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy tetrametylorodaminy (TMRM) w DMSO. Chronić przed światłem. Uwaga: Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w pożywce do hodowli komórkowej do roztworu roboczego o stężeniu 10 μM (rozcieńczenie 1:1 000). Chronić przed światłem i zużyć tak szybko, jak to możliwe. Uwaga: Roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez pewien czas (>1 godz.), jednak zdecydowanie zaleca się przygotowanie świeżego roztworu roboczego.
5. Dodać 2 μl roztworu roboczego do 1 ml pożywki do hodowli świeżych komórek (roztwór nasycający).
6. Załaduj komórki, zastępując pożywkę do hodowli komórkowych roztworem ładującym. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotnej atmosferze (inkubator). Uwaga: Prawie wszystkie wskaźniki fluorescencji są z czasem eksportowane przez żywe komórki; Dlatego unikaj długotrwałego ładowania lub opóźnionej analizy.
7. Bez mycia umieść naczynie pod mikroskopem odpowiednim do obrazowania żywych komórek. Ważne: wskaźniki fluorescencji są bardzo wrażliwe na światło, dlatego należy unikać niepotrzebnej ekspozycji na światło.
8. Pozyskiwanie obrazów bez zmiany parametrów akwizycji, aby zapewnić porównywalność między różnymi obrazami.

Wyniki

Ekspozycja skóry na środki alkilujące wywołuje rumień, powstawanie pęcherzy oraz owrzodzenia skóry, co wiąże się z zaburzeniem gojenia ran. Gojenie ran wymaga angiogenezy i waskulogenezy, które opierają się na migracji komórek śródbłonkowych. Migrację ilościową można ocenić za pomocą testu w komorze Boydena. Jak pokazano na Rysunku 1C, ekspozycja EEC na środek alkilujący chlorambucil spowodowała istotny spadek migracji komórek⁹. Dodatek przeciwutleniacza kwasu alfa-linolenowego (ALA) bezpośred...

Dyskusja

Narażenie skóry na toksyczne chemikalia często powoduje poważne zaburzenia gojenia się ran. Mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska są w dużej mierze nieznane. Gojenie się ran to złożony proces, który składa się z różnych faz (hemostaza, stan zapalny, proliferacja i przebudowa). Migracja komórek jest zaangażowana w każdą fazę, jednak ma ogromne znaczenie dla tworzenia się ziarniny. Tutaj nowe naczynia krwionośne powstają w wyniku angiogenezy lub unaczynienia.

Oba procesy wymagają niezakłócon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komora Boydena
Wkładki do hodowli tkankowych Corning FluoroBlok (TC), 24 dołki - 3 i mikro; m	Corning Incorporated	#351151
Corning FluoroBlok Wkładki do hodowli tkankowej (TC), 24 dołki - 8 i mikro; m	Nauki przyrodnicze	#351152(
do użytku z płytką towarzyszącą Falcon Insert 24 dołki (353504)
Test gojenia
Naczynia ze szklanym dnem	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
			mitochondrialnego
TMRM (ester metylowy tetrametylorodaminy)	Life Technologies	#T669
Hodowla
Accutase	PAA, Pasching, Austria	# L11-007
&alfa;-kwas linolenowy	Fluka (Sigma), Steinheim, Niemcy	# L2376
Chlorambucil	Fluka (Sigma), Steinheim, Niemcy#	23125
Gelatin	Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy	# G2500-100G

ran Ocena potencjału komórkowa