Artykuł metodologiczny

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

DOI:

10.3791/52784

⸱

10 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System ubikwityna-proteasom został ostatnio zamieszany w różne patologie, w tym choroby neurodegeneracyjne i raka. W związku z tym techniki badania mechanizmu regulacyjnego tego systemu są niezbędne do wyjaśnienia procesów komórkowych i molekularnych wyżej wymienionych chorób. Zastosowanie sond ubikwityny pochodzących z hemaglutyniny opisanych w tym artykule służy jako cenne narzędzie do badania tego układu. W tym artykule szczegółowo opisano metodę, która umożliwia użytkownikowi wykonywanie testów, które dają bezpośrednią wizualizację aktywności enzymu deubikwitynacyjnego. Enzymy deubikwitynujące kontrolują degradację proteasomalną i dzielą funkcjonalną homologię w swoich miejscach aktywnych, co pozwala użytkownikowi badać aktywność wielu enzymów w jednym teście. Lizaty uzyskuje się poprzez delikatne mechaniczne rozerwanie komórek i inkubuje za pomocą sond skierowanych w miejsce aktywne. Funkcjonalne enzymy są znakowane za pomocą sond, podczas gdy nieaktywne enzymy pozostają niezwiązane. Uruchamiając ten test, użytkownik uzyskuje informacje zarówno o aktywności, jak i potencjalnej ekspresji wielu enzymów deubikwitynujących w szybki i łatwy sposób. Obecna metoda jest znacznie bardziej efektywna niż stosowanie pojedynczych przeciwciał dla przewidywanej liczby stu enzymów deubikwitynujących w komórce ludzkiej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System ubikwityna-proteasom (UPS) służy jako jedna z głównych ścieżek degradacji w komórce ssaków. Substraty związane do degradacji w proteasomie są kowalencyjnie znakowane polimerami ubikwityny (Ub)1. Zanim docelowy substrat dostanie się do proteasomu w celu degradacji, znacznik poliubikwityny musi zostać usunięty. Klasa enzymów znana jako enzymy deubikwitynujące (DUB) jest odpowiedzialna za usuwanie i recykling cząsteczek ubikwityny2. Na podstawie ludzkiego genomu przewidziano, że w komórce3 pracuje prawie sto DUB-ów. Przy tak dużej liczbie DUB kontrolujących procesy komórkowe za pośrednictwem Ub, badanie tych enzymów stanowi wyzwanie, ponieważ techniki mRNA nie dostarczają informacji o aktywności, a western blot dostarcza tylko informacji o poziomach ekspresji.

Użycie sond ukierunkowanych na miejsce aktywne oznaczone hemaglutyniną grypy (HA), pochodzące z Ub, pozwala na kowalencyjną modyfikację funkcjonalnych DUB i dlatego daje bezpośrednią wizualizację aktywności tych enzymów na western blot4. Sondy mają C-końcową grupę reaktywną tiolu, która służy jako samobójczy substrat dla reszty cysteiny5 w miejscu aktywnym. Za pomocą tych sond możliwe jest badanie aktywności i potencjalnej ekspresji wielu DUB zarówno w stanach patologicznych, jak i fizjologicznych komórki.

Zmiany w aktywności DUB są związane z szeregiem stanów patologicznych, takich jak choroba Parkinsona, Alzheimera, anemia i różne nowotwory6-10. Technika ta stanowi potężne narzędzie do badania chorób. W niniejszej pracy przedstawiono zastosowanie tej techniki w komórkach HeLa i M17, które zostały poddane lizie przy użyciu kulek szklanych. Dodatkowo opisujemy, jak stosować tę metodę w próbkach tkanki rdzenia kręgowego myszy. Informacje uzyskane za pomocą tej techniki mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do identyfikacji celów terapeutycznych, a także do ustanowienia modeli do badania różnych stanów chorobowych. Prawdziwa użyteczność tej techniki polega na jej zdolności do dostarczania informacji na temat wielu DUB w jednym teście.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie buforu do lizy

  1. Rozpuść sacharozę w wodzie dejonizowanej (DI), aby uzyskać 2 M roztwór podstawowy. Przefiltrować 2 M roztwór sacharozy za pomocą napędzanego podciśnieniem filtra z polifluorku winylidenu (PVDF) o wielkości 0,22 μm.
  2. Rozpuść ditiotreitol (DTT) w wodzie DI w celu uzyskania 500 mM roztworu podstawowego i przechowuj w warunkach beztlenowych. Rozpuścić chlorek magnezu (MgCl2) w wodzie demineralizowanej, aby uzyskać 100 mM roztwór podstawowy. Rozpuścić hydrat disodowy trifosforanu adenozyny (ATP) w wodzie demineralizowanej, aby uzyskać 50 mM roztwór podstawowy.
  3. Uzupełnić roztwór Tris o pH 7,4, rozpuszczając chlorowodorek Trizma w wodzie DI i dostosowując pH za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH).
  4. Połączyć porcje roztworów podstawowych w wodzie demineralizowanej w celu uzyskania buforu do lizy o stężeniu sacharozy 250 mM, stężeniu DTT 1 mM, stężeniu MgCl2 5 mM, stężeniu ATP 1 mM i stężeniu Tris 50 mM. Na przykład wymieszaj 535,3 μl tris, 500 μl MgCl2, 1,25 ml sacharozy, 20 μl DTT, 200 μl ATP i 7,4947 ml wody DI, aby uzyskać 10 ml buforu do lizy. Można to wykorzystać do około 20 eksperymentów.

2. Hodowla komórek do eksperymentu

  1. Przygotuj pożywkę, podając 30 ml DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Przenieś zamrożone komórki M17 lub HeLa z magazynu ciekłego azotu do małej zlewki z letnią wodą.
  3. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Najpierw dodaj trochę pożywki do fiolki z komórkami. Następnie przenieś zawieszone komórki w ciągu 5 sekund od rozmrożenia.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 450 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Dodać 20 ml pożywki do kolby T75.
  5. Usunąć pożywkę z komórek za pomocą odsysania. Dodać 5 ml świeżej pożywki do osadu komórkowego i ponownie zawiesić.
  6. Przenieść 5 ml zawiesiny komórek do 20 ml pożywki w kolbie T75 i inkubować w temperaturze 37 °C. Zmieniać pożywkę co 3 dni.

3. Zbieranie komórek

  1. Usuń pożywkę przez odsysanie, uważając, aby nie dotknąć komórek.
  2. Umyj komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usuń PBS za pomocą odsysania.
  3. Dodać 3 ml kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do kolby T75 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  4. Dodać 6 ml świeżej pożywki do kolby i ponownie zawiesić komórki.
  5. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy stężeniu 290 × g przez 5 minut.
  6. Usunąć sklarowany osad i dodać 5 ml PBS. Delikatnie postukaj w spód tuby, aby rozbić granulkę. Wirować przy 290 x g przez 5 min.
  7. Powtórz krok 3.6 trzy razy.
  8. Usunąć PBS i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżego PBS. Przenieść do probówki Eppendorf (1,5 ml). Wirować z prędkością 290 x g przez 5 min.

4. Liza komórek

  1. Zmierzyć przybliżoną objętość granulki za pomocą pipety i odważyć szklane kulki w stosunku masa do objętości 1:1. Dodać dwukrotność objętości osadu do buforu do lizy.
    Uwaga: Dodaj bufor przed dodaniem szklanych koralików.
  2. Lizować komórki w probówce Eppendorfa przy maksymalnym mieszaniu przez 30 minut w temperaturze 4 °C, wirując w chłodnym pomieszczeniu.
  3. Krótko odwirować przy 200 x g przez 30 sekund, aby osadzać kulki. Zebrać supernatant.
  4. Dodać taką samą objętość kulek szklanych jak poprzednio do supernatantu.
  5. Ponownie wirować przy maksymalnym mieszaniu przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odwirować krótko przy 200 x g przez 30 sekund, aby osadzić szklane kulki. Zebrać supernatant.
  7. Wirować przy 5,030 x g przez 5 minut w celu usunięcia jąder, błon i nieuszkodzonych komórek. Zebrać supernatant, którym jest lizat komórkowy.

5. Homogenizacja tkanek

  1. Wykonaj masę: objętość roztworu 1:9 tkanki rdzenia kręgowego myszy do buforu do lizy.
    Uwaga: Metoda ta ma zastosowanie do wielu różnych próbek tkanek.
  2. Homogenizować tkankę, ustawiając poziom 2 na homogenizatorze przez 30 sekund, aby upewnić się, że nie pozostały żadne kawałki.
  3. Wirować w dół przy 5,030 x g przez 3 minuty, aby usunąć jądra, błony i nieuszkodzone komórki.
  4. Zebrać supernatant, którym jest lizat.

6. Derywatyzacja próbki

  1. Wykonaj analizę kwasu bicinchoninowego (BCA) w 96-dołkowej analizie płytki, aby określić stężenie białka w lizacie tkankowym za pomocą kolorymetrycznego czytnika 96-dołkowych płytek, zgodnie z protokołem zestawu do testów białkowych Pierce BCA.
  2. Doprowadzić podwielokrotność odpowiadającą 20 μg białka całkowitego do 50 μl przy użyciu wody dejonizowanej (DI).
  3. Dodać 2 μl z 1,35 μM sulfonu HA-Ub-winylu (VS) do roztworu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Daje to 20 μg lizatu na 50 nM sondy w końcowej mieszaninie reakcyjnej. Jest to duży nadmiar molowy, aby zapewnić znakowanie funkcjonalnych DUB.
  4. Inkubować próbkę w buforze do próbek Laemmliego przez 5 minut w temperaturze 95 °C. W przypadku objętości reakcyjnej 52 μl należy użyć 26 μl buforu 2x próbki, 13 μl buforu 4x próbki lub 8,87 μl buforu 6x próbki.
  5. Schłodzić na lodzie przed załadowaniem żelu.

7. Western Blot

  1. Załadować 12-dołkowy żel tris-glicynowy 40 μl przygotowanej próbki
  2. Uruchom żel pod napięciem 95 V, aż czoło jonu dotrze do dna.
  3. Przeprowadzić nocny transfer żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF).
  4. Inkubuj błonę w czarnym barwniku amido i zeskanuj membane, aby uzyskać obraz pokazujący ilość białka w każdym pasie.
  5. Odbarwić błonę i inkubować w 5% mleku w PBS przez 1 godzinę w celu zablokowania.
  6. Inkubować błonę w pierwszorzędowym przeciwciałie anty-HA w stężeniu 1:10 000 w 5% mleku w PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Wykonaj 3 prania po 5 minut każde w PBS z 0,1% detergentem Tween-20.
  8. Inkubować błonę w mysiej peroksydazie chrzanowej w stężeniu 1:10 000 w 5% mleku w PBS przez co najmniej 2 godziny.
  9. Wykonaj 3 prania po 5 minut każde w PBS z 0,1% detergentem Tween-20.
  10. Wykonaj 1 pranie przez 5 minut w PBS.
  11. Inkubować membranę w chemiluminescencyjnym odczynniku detekcyjnej przez 10 minut i wykrywać za pomocą detektora chemiluminescencyjnego. Użyj ustawienia automatycznej ekspozycji w detektorze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowane komórki M17 i HeLa zostały zebrane przy użyciu metody opisanej w protokole (3. Cell Harvesting) i uzyskano tkankę rdzenia kręgowego myszy. Osad komórkowy/tkankę rdzenia kręgowego umieszczono w probówce z buforem do lizy opisanym w rozdziale dotyczącym przygotowania odczynnika. Granulki komórkowe poddano lizie za pomocą szklanych kulek (ryc. 1A), a próbki tkanki rdzenia kręgowego myszy homogenizowano za pomocą homogenizatora (ryc. 1B). Po lizie lub homogenizacji próbkę odwirowano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ ubikwitynacja jest podstawową aktywnością komórkową, zrozumienie mechanizmów regulacyjnych może być kluczem do odkrycia procesów chorobowych i patologicznych. Opisane tutaj zastosowanie sond ukierunkowanych na miejsce aktywne oznaczone znakiem HA Ub zapewnia łatwą, ale wysoce przydatną metodę badania degradacji białek za pośrednictwem Ub. Ta metoda jest szybsza i tańsza niż studiowanie każdego z DUB z osobna.

W tej metodzie liza komórek odbywa się za pomocą środków mechanicznych – za ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Lee z University of Minnesota za dostarczenie próbek tkanek rdzenia kręgowego myszy, które zostały użyte. Prace te były wspierane przez Departament Obrony Programu Badań nad Rakiem Jajnika (OCRP) OC093424 do MB, przez Randy Shaver Cancer Research and Community Fund do MB oraz przez Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) do MB. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PowerGen 125 (homogenizator)Fischer Scientific14-261-02P
Filtry próżniowe 0,22 i mikro; mBPV2210
Koraliki szklane, myte kwasem ≤ 106 &mikro; m (~140 sita amerykańskiego)Sigma-aldrichG4649-10G
SacharozaFischer ScientificS6-212
DL-ditiotreitolSigma-AldrichD0632
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanuSigma-AldrichA26209
Chlorowodorek TrizmaSigma-AldrichT3253
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-092
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies10010-023
Kolba do hodowli tkankowych 75 cm2 z kubkiem filtracyjnym 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0,05% Trypsyna-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Przeciwciało monoklonalne anty-HA wytwarzane u myszySigma-AldrichH9658
Ubikwityna sulfonu winylu (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Bufor do próbek SDS firmy Laemmli (4x, redukujący)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein Zestaw testowyThermo Scientific23225

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Deubiquitinating Enzyme ActivityHA Derived ProbesWestern Blot AnalysisCell Lysate PreparationMechanical Cell LysisProtein Concentration AssayChemiluminescent DetectionActive Site LabelingEnzyme Activity ProfilingPVDF Membrane Transfer

Powiązane artykuły