Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba Alzheimera jest chorobą neurodegeneracyjną dotykającą starzejące się społeczeństwo. Kluczową cechą neuropatologiczną choroby jest nadmierna produkcja beta-amyloidu i odkładanie się blaszek beta-amyloidowych w obszarach mózgu osób dotkniętych chorobą. Przez lata naukowcy stworzyli wiele mysich modeli choroby Alzheimera, które próbują odtworzyć patologię beta-amyloidu. Niestety, modele myszy tylko wybiórczo naśladują cechy choroby. Śmierć neuronów, znaczący efekt w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera, jest zauważalnie nieobecna u tych myszy. W związku z tym my i inni zastosowaliśmy metodę bezpośredniego wstrzykiwania rozpuszczalnych oligomerycznych form beta-amyloidu - form beta-amyloidu, które, jak udowodniono, są najbardziej toksyczne dla neuronów - stereotaktycznie do mózgu. W tym raporcie wykorzystujemy samce myszy C57BL / 6J, aby udokumentować tę chirurgiczną technikę zwiększania poziomu beta amyloidu w wybranym regionie mózgu. Celem infuzji jest zakręt zębaty hipokampa, ponieważ ta struktura mózgu, wraz z podstawną przodomózgowiem, która jest połączona obwodem cholinergicznym, stanowi jeden z obszarów zwyrodnienia w chorobie. Wyniki podniesienia beta-amyloidu w zakręcie zębatym za pomocą infuzji stereotaktycznej ujawniają wzrost utraty neuronów w zakręcie zębatym w ciągu 1 tygodnia, podczas gdy jednocześnie występuje wzrost śmierci komórek i utrata neuronów cholinergicznych w pionowej kończynie ukośnego pasma Broca podstawy przodomózgowia. Efekty te obserwuje się do 2 tygodni. Nasze dane sugerują, że obecny model infuzji beta-amyloidu stanowi alternatywny model mysi do rozwiązywania problemów związanych ze śmiercią neuronów specyficznych dla regionu w perspektywie krótkoterminowej. Zaletą tego modelu jest to, że beta-amyloid może być podwyższony w sposób przestrzenny i czasowy.
Wprowadzenie
Złogi blaszek amyloidowych, które składają się z beta-amyloidu (Aβ1-42), są kluczową cechą patologii choroby Alzheimera (AD). Liczne badania wykazały, że wysokie lub toksyczne poziomy rekombinowanego oligomerycznego Aβ1-42 wywołują śmierć neuronów, dystrofię synaptyczną, utratę i dysfunkcję; a także deficyty uczenia się i pamięci1-4. Dotknięte obszary mózgu obejmują hipokamp, korę mózgową i struktury podkorowe, takie jak podstawa przodomózgowia i ciało migdałowate5,6. Do tej pory istnieje wiele transgenicznych modeli myszy, które próbują symulować patologię Aβ1-42 w AD. W zależności od szczepu, zwierzęta te okazuj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: We wszystkich eksperymentach na zwierzętach, przestrzegano Instytucjonalnych i Krajowych wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i rozwiązań do operacji
- Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych ze stali nierdzewnej.
- Przygotuj 70% etanolu, rozcieńczając 200-procentowy etanol absolutny sterylną dejonizowaną wodą dejonizowaną klasy molekularnej.
- Umieścić igłę 29 G w strzykawce Hamiltona. Wyczyść wnętrze strzykawki i igły Hamiltona, pobierając i wyrzucając nanoczystą wodę kilkakrotnie przez 1 minutę. Powtórz tę procedurę z 70% etanol....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisana metoda otrzymywania ludzkiego rekombinowanego oligomerycznego Aβ1-42 pozwala na uzyskanie rozpuszczalnych form oligomerycznych składających się z monomerów, dimerów, trimerów i tetramerów (Rysunek 1A). Wykazano w wielu badaniach, że te formy Aβ1-42 o niskiej masie cząsteczkowej, a nie włókna i blaszki, są najbardziej toksyczne dla neuronów1,4,9,17-19. Aby ustalić, czy oligomeryczny Aβ1-42 indukuje śmierć neuronów w mózgu myszy, Aβ1-42 (4 µl r.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby osiągnąć udane wstrzyknięcie Aβ1-42 , eksperymentator lub chirurg musi: 1) stosować technikę aseptyczną; 2) prawidłowo zidentyfikować obszar mózgu zainteresowania za pomocą dokładnych współrzędnych; 3) umieć prawidłowo zabezpieczyć mysz w ramce stereotaktycznej z mózgiem wypoziomowanym w osi AP i ML; 4) posiadają umiejętność precyzyjnej obsługi mikromanipulatora; 5) Zadbaj o właściwą opiekę pooperacyjną. Jeśli te kluczowe kroki zostaną wykonane, mysz powinna przetrwać operację bez zauważalnej infekcji.
.......Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant NS081333 National Institute of Neurological Disorders and Stroke (dla CMT), grant Stowarzyszenia Alzheimera NIRG-10-171721 i grant Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego MH096702 (dla UH), oraz grant pilotażowy AG008702 National Institute on Aging na Uniwersytecie Columbia (dla YYJ i JB).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ketamina HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketaminy na 1 kg zwierzęcia |
| Ksylazyna (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | niedostępne | 10 mg ksylazyny na 1 kg zwierzęcia |
| Buprenex (0,3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0,1 mg buprenex na 1 kg zwierzęcia |
| Aβ 1-42 | David Teplow/UCLA | niedostępny | 100 μ M; Ten amyloid został wykorzystany w pracy |
| Aβ 1-42 | Bachem | H-1368 | Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow |
| Aβ 1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow |
| Scrambled Aβ 1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Może być stosowany jako peptyd kontrolny do porównywania A i beta; Przeciwciało 1-42 |
| NU4 (oligomeryczne przeciwciało amyloidowe) | Prezent od Williama Kleina/Northwestern U. | niedostępne | rozcieńczeniu 1:2 000 |
| (Królik poliklonalny) | EMD Millipore | AB9234 | Może być stosowany zamiast Nu4; musi być przetestowany przez użytkownika końcowego |
| Przeciwciało 6E10 (mysz monoklonalna) (przeciwciało amyloidowe) | Biolegend | sig-39320 | rozcieńczenie 1:1,000 |
| Przeciwciało ChAT (koza poliklonalna) | Milipora | AB144P | Rozcieńczenie 1:100 |
| Ślepy zaułek Fluorometryczny system TUNEL | Promega | G3250 | Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dla użyj |
| odczynnika Prolong Gold Antifade z DAPI | Invitrogen | P36935 | Używaj podczas szkiełek nakrywkowych |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | niedostępne | % roztwór |
| Absolutny etanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Do wytwarzania 70% etanolu do odkażania i dezynfekcji |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | Do oddzielania Aβ 1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | Do uruchamiania 10-20% żeli Tricine |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | Do przenoszenia 10-20% żeli Tricine |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | Do wzmacniania Aβ sygnał 1-42; postępuj zgodnie z protokołem producenta |
| Protran BA79 Nitrocelulozowa membrana bibułowa, 0,1 μ m | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | Do przenoszenia 10-20% żeli Tricine |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Aparatura do elektroforezy do uruchamiania 10-20% żeli tricine |
| GenTeal Lubricant Żel pod oczy | Novartis | niedostępny | Do utrzymywania wilgotności oczu myszy podczas operacji; można znaleźć w lokalnych aptekach |
| [header] | |||
| Odśwież Optive Lubricant Krople do oczu | Allergan | niedostępne | Do utrzymywania wilgotności oczu myszy podczas operacji; można je znaleźć w lokalnych aptekach; Może być stosowany zamiast GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | Do odkażania i dezynfekcji |
| szpatułki okrągłej/stożkowej | VWR | 82027-490 | Do otwierania pyska zwierzęcia |
| Bulldog Serrefines Zaciski (szczęki wym. 9X1,6 mm; Długość 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Opcjonalnie; Do rozsuwania skóry głowy podczas iniekcji |
| Proste cienkie nożyczki (krawędź tnąca 25 mm; Długość 11,5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | Do cięcia skóry głowy |
| #3 Rękojeść skalpela | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Ostrze chirurgiczne | Fine Science Tools | 10011-00 | Do wykonywania nacięć skóry głowy |
| Student Standard Pattern Forcep (końcówka wym. 2,5x1,5 mm; Długość 11,5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | Do trzymania skóry głowy zamkniętej podczas szycia |
| Zestaw trymerów Combo Kent | Scientific | CL9990-1201 | Do golenia włosów |
| Recyrkulator ciepłej wody T/Pump | Kent Naukowy | TP-700 | Do ogrzewania zwierzęcia podczas operacji |
| Podkładka wojenna wielokrotnego użytku (5 "x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | Do podłączenia go do recyrkulatora ciepłej wody T / Pump w celu ogrzania zwierzęcia podczas operacji |
| Akumulatorowa wiertarka Micro Drill | 58610 | Użyj stalowych zadziorów 0,8 mm do wiercenia otworów w czaszce | |
| Standardowy instrument stereotaktyczny Lab z myszą i Adapter dla noworodków dla szczurów | Stoelting | 51615 | |
| Tylko dla myszy Stereotaktyczny instrument | Stoelting | 51730 | Może używać tego zamiast Stoelting Cat. #51615 |
| Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego | Stoelting | 53311 | |
| Sterylizator z suchymi szklanymi kulkami | Stoelting | 50287 | Do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej |
| Sterylna serweta chirurgiczna (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Strzykawka Hamilton 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | Do wstrzykiwania mózgu; używaj różnych strzykawek do różnych roztworów |
| Igła 29 G, mała piasta RN | NDL Hamilton Company | 7803-06 | Do mocowania do strzykawki Hamilton do wstrzykiwań mózgu |
| 1 ml BD Strzykawki tuberkulinowe | VWR | BD309659 | Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej |
| Igła 30 G (0,5") | VWR | BD305106 | Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej |
| Przenośna elektroniczna waga z serii CS (Ohaus) | VWR | 65500-202 | Do ważenia zwierząt w celu ustalenia dawki znieczulającej |
| Płyta grzejna (płyta górna o wymiarach 7,25 x 7,25 cala) | VWR | 47751-148 | Do ogrzewania zwierząt po operacji |
| Cięcie szwu jedwabnego Sofsilk C-1 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | Do zamykania rany |
| Klej tkankowy Vetbond (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Opcjonalnie: do pomocy w zamykaniu ran; Stosować ze szwem. |
| Sterylne aplikatory z drewnianą końcówką z bawełnianą końcówką | Fisher scientific | 22-029-488 | Do czyszczenia i suszenia ran pooperacyjnych |
| Fisherbrand Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-550-15 | Do pobierania wycinków mózgu |
| Szkło osłonowe VWR Micro 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | Do montażu szkiełek mikroskopowych |
| Thermo Scientific Nalgene Filtr strzykawkowy 0,2 μ m | Fisher Scientific | 194-2520 | Do sterylizacji roztworu soli |
| fizjologicznej Sterylne markery do skóry z podwójną końcówką firmy Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | Do oznaczania współrzędnych na czaszce |
Bibliografia
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
