Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół enkapsulacji komórek katabolicznych, które zużywają lipidy do produkcji ciepła w tkance tłuszczowej w jamie brzusznej i zwiększają rozpraszanie energii u otyłych myszy.

Streszczenie

Enkapsulacja komórek została opracowana w celu uwięzienia żywotnych komórek w półprzepuszczalnych błonach. Wszczepione kapsułkowane komórki mogą wymieniać metabolity o niskiej masie cząsteczkowej w tkankach leczonego gospodarza, aby osiągnąć długoterminowe przeżycie. Półprzepuszczalna błona umożliwia wszczepione komórki otorbione, aby uniknąć odrzucenia przez układ odpornościowy. Procedura enkapsulacji została zaprojektowana tak, aby umożliwić kontrolowane uwalnianie związków bioaktywnych, takich jak insulina, inne hormony i cytokiny. W tym miejscu opisujemy metodę enkapsulacji komórek katabolicznych, które zużywają lipidy do produkcji ciepła i rozpraszania energii (termogenezy) w tkance tłuszczowej w jamie brzusznej otyłych myszy. Enkapsulacja termogenicznych komórek katabolicznych może mieć potencjalne zastosowanie w profilaktyce i leczeniu otyłości i cukrzycy typu 2. Innym potencjalnym zastosowaniem komórek katabolicznych może być detoksykacja z alkoholi lub innych toksycznych metabolitów i zanieczyszczeń środowiska.

Wprowadzenie

Rosnąca częstość występowania chorób przewlekłych¹ pobudziła badania nad przeszczepianiem terapeutycznych populacji komórek². Syngeniczne lub allogeniczne komórki macierzyste są najczęściej stosowanymi typami komórek do tych zastosowań². Zabiegi te nie pozwalają jednak na kontrolę różnicowania i migracji komórek macierzystych po implantacji i nie są opłacalne. Przeszczepienie genetycznie zmodyfikowanych komórek o korzystnych funkcjach przewiduje poprawę leczenia wielu chorób. Jednak genetyczne modyfikacje komórek są rozpoznawane przez układ odpornościowy gospodarza, dlatego leczenie to wymaga immunosupresji³. Enkapsulacja komórek produkujących insulinę została opracowana przez dr Chang⁴. Technika opiera się na enkapsulacji komórek w kropelkach alginianu, które są zanurzone w roztworze chlorku wapnia. Cząsteczki alginianu składają się z kwasu mannuronowego (M) i guluronowego (G) i mogą być połączone przez Ca²⁺. Po żelowaniu kulki są zawieszane w roztworze poli-L-lizyny (PLL). Na tym etapie PLL wiąże się z G i M w cząsteczkach alginianu, które tworzą błonę kapsułki. Porowatość błony kapsułki można modulować poprzez zmianę stężeń M i PLL, czasu inkubacji i temperatury. Wiązanie PLL zależy również od rodzaju i stężenia alginianu. Matryce alginianowe usieciowane jonami Ca²⁺ są niestabilne w środowisku fizjologicznym lub w zwykłych roztworach buforowych o wysokim stężeniu jonów fosforanowych i cytrynianowych. Bufor te może ekstrahować Ca²⁺ z alginianu i upłynniać rdzeń. Upłynnienie rdzenia alginianowego zapewnia przestrzeń wewnątrz kapsułek dla ruchu i wzrostu komórek. Komórki otoczone alginianem polianionowym z polikationową poli-L-lizyną (APL) są nieprzepuszczalne dla immunoglobulin, ale mają napływ składników odżywczych i wypływ toksyn. Te właściwości APL umożliwiają długoterminowe przeżycie otorbionych komórek po przeszczepie do genetycznie różnych gospodarzy. Elliott i wsp. opisali przeżycie funkcjonujących zamkniętych w kapsułkach komórek trzustki świni u ludzkiego pacjenta dziewięć lat po implantacji⁵.

Techniki enkapsulacji można podzielić na mikrokapsułkowanie (3-800 μm) i makroenkapsulację (większe niż 1000 μm). Mikrokapsułki są trwalsze niż makrokapsułki⁶. Od czasu odkrycia przez dr Changa i współpracowników w 1964 roku, mikrokapsułkowanie jest szeroko stosowane do enkapsulacji komórek anabolicznych wytwarzających insulinę, inne hormony i cząsteczki bioaktywne⁷. Terapie te napotkały kilka wyzwań w tkance gospodarza, w tym zwłóknienie i odpowiedź immunologiczną⁸. Początkowo skutki uboczne związane z jakością biopolimerów zostały rozwiązane. Jednak przeszczep komórek anabolicznych nadal inicjuje skutki uboczne, takie jak zwłóknienie, w wyniku nadprodukcji hormonów poza wyspecjalizowanym gruczołem.

W ostatnich dziesięcioleciach otyłość i cukrzyca typu 2 osiągnęły rozmiary epidemii⁹. Ponad 30% dorosłych ludzi na całym świecie ma nadwagę i otyłość¹⁰. Zwiększone tworzenie tłuszczu w jamie brzusznej (iAb) zwiększa częstość występowania przewlekłego stanu zapalnego i sprzyja cukrzycy typu 2, chorobom sercowo-naczyniowym, niektórym nowotworom i innym chorobom^11-13. Kilka linii dowodów sugerowało, że patogeneza związana z tłuszczem iAb może być zapobieżona przez określone adipocyty. Ostatnie badania wykazały, że przeszczepienie podskórnych adipocytów do regionu iAb może poprawić metabolizm oraz zmniejszyć otyłość i insulinooporność u gryzoni in vivo14. Skuteczna redukcja otyłości i insulinooporności wiąże się z termogenicznymi adipocytami zdolnymi do rozpraszania energii w postaci ciepła^15,16. Termogeniczną modyfikację adipocytów można osiągnąć poprzez stabilną transfekcję genów uczestniczących w mitochondrialnym rozprzęganiu protonów, takich jak rozprzęganie białka 1 (Ucp1) lub genów regulujących ekspresję Ucp1 i innych genów termogenicznych^15,16. Nasze ostatnie badania wykazały, że niedobór dehydrogenazy aldehydowej 1 a1 (Aldh1a1) prowadzi do termogenicznej przebudowy tłuszczu iAb, która zmniejsza otyłość i insulinooporność u tych myszy^17,18. Warto zauważyć, że enkapsulacja termogenicznych preadipocytów z niedoborem Aldh1a1 (Aldh1a1-/-) pośredniczy w tym samym efekcie terapeutycznym w tłuszczu iAb u otyłych myszy typu dzikiego, co sugeruje nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu tłuszczu iAb¹⁸. W warunkach eksperymentalnych komórki otorbione umożliwiają naukowcom badanie wpływu określonych populacji komórek w opłacalny sposób¹⁹. W tym artykule omówiono metodę enkapsulacji termogenicznej linii komórek katabolicznych oraz jej laboratoryjne i terapeutyczne zastosowanie w mysim modelu otyłości. Protokół opisuje trzy fazy produkcji mikrokapsułek (ryc. 1): tworzenie mikrokulek alginianowych (ryc. 1A), tworzenie polikationowych błon poli-L-lizyny (PLL) na powierzchni mikrogranulek (ryc. 1B) oraz usuwanie rdzeni alginianowych (ryc. 1C).

Protokół

Protokół badania został zatwierdzony przez Komisje Etyki Uniwersytetu Stanowego Ohio. Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez protokół IACUC. Wszystkie zabiegi zostały wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 z przepływem laminarnym. Przestrzegaliśmy wszystkich standardowych wymogów i procedur bezpieczeństwa. Technikę mikrokapsułkowania w celu przygotowania mikrokapsułek przeprowadzono zgodnie z opisem ^17,18.

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotować 10 ml 2% roztworu alginianu sodu w autoklawizowanym roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl w wodzie). Przygotować 0,05% roztwór PLL w soli fizjologicznej. Przygotuj te roztwory dzień wcześniej i mieszaj przez noc. Przed użyciem przefiltrować roztwory filtrem 0,22 μm.
2. Przygotować 50 mM cytrynianu sodu i 100 mM CaCl₂ w 0,9% roztworach NaCl i sterylizować je w autoklawie.
3. Autoklawuj wszystkie roztwory, igły, elektrody i zlewki. Dokładnie wyczyść igły drutami, aby uniknąć zatkania.
4. Określ odpowiednią ilość komórek do użycia w kapsułkach (102 mikrokapsułki są potrzebne na każdy^cm2 studzienki, a na kapsułkę przypada około 500 komórek¹⁸). Użyj 1 ml alginianu sodu na dwa miliony komórek.
5. Przygotuj "Pożywkę do wzrostu fibroblastów" zawierającą 10% surowicy cielęcej i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4 500 mg/l glukozy).
   1. Przygotować "Pożywkę różnicującą I" zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 μg/ml insuliny, 1 μM deksametazonu, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny i 100 j./ml penicyliny/streptomycyny w DMEM.
   2. Przygotować "Pożywkę różnicującą II" zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 μg/ml insuliny i 100 j./ml penicyliny/streptomycyny w DMEM.
6. Przygotować bufor do lizy zawierający jedną tabletkę inhibitora proteazy na 10 ml buforu do testów radioimmunoprecypitacyjnych (bufor RIPA).

2. Przygotowanie mikrogranulek alginianowych (Rysunek 1A)

1. Usunąć starą pożywkę z kolby do hodowli komórkowych. Przepłukać komórki 10 ml PBS. Doprowadzić komórki do zawiesiny za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA (2 ml na jedną zlewającą się kolbę T175).
2. Policz komórki w zawiesinie komórek za pomocą hemocytometru. Użyć 10 ml podwielokrotności z zawiesiny komórek i policzyć komórki zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostałe komórki odwirować w pożywce wirówkowej o sile 480 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
3. Zawiesić osad komórkowy w alginianie sodu, jak opisano w kroku 1.4. Przenieść roztwór komórek alginianu sodu do strzykawki o pojemności 5 ml.
4. Usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu, dodać igłę o rozmiarze 23 i odwrócić strzykawkę, aby utworzyć kieszeń o pojemności 1 ml powietrza.
5. Umieścić małą zlewkę (180 ml) zawierającą 144 ml 100 mM roztworu CaCl₂ pod dziobkiem igły kapsułkatora. Przymocuj elektrodę do enkapsulatora z końcówką umieszczoną około 2,5 cm nad powierzchnią roztworu 100 mM CaCl₂.
6. Umieścić szczelnie strzykawkę zawierającą roztwór komórek alginianu sodu w pompie strzykawkowej. Przymocować gumową rurkę do otworu strzykawki. Naciskać tłok, aż roztwór komórek alginianu sodu wejdzie do połowy rurki. Dostosuj napięcie do 5,4 kV. Ustawić średnicę 12,06 mm na pompie strzykawkowej. Dostosuj prędkość do 3 ml/h. Uruchom pompę. Włącz enkapsulator i utrzymuj napięcie na poziomie 5,4 kV.
7. Zamknij okienko maski i unikaj niepotrzebnych wibracji aż do końca tworzenia się mikrokulek alginianowych. Po tym, jak cały roztwór przejdzie przez igłę, zestalić mikrokulki alginianowe w kształcie kuli w 100 mM roztworze CaCl₂ przez dodatkowe 20 minut przed pokryciem PLL.

3. Powlekanie mikrokulek PLL (Rysunek 1B)

1. Wyjąć zlewkę zawierającą mikrokulki w kształcie kuli z komórek alginianu sodu i przenieść te mikrokulki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Usunąć roztwór CaCl₂ z osadu mikrokulek.
2. Umyj mikrokulki w kształcie kuli z komórek alginianowych, dodając 30 ml 0,9% NaCl. Delikatnie potrząśnij tubką ręcznie. Usunąć 0,9% NaCl za pomocą pipety o pojemności 25 ml po tym, jak mikrogranulki wytrącą się grawitacyjnie. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania.
3. Użyć 10 ml 0,05% roztworu PLL na każdy 1 ml roztworu alginianu sodu. Dodaj 0,05% PLL i wiruj z prędkością 1,000 obrotów na minutę przez 10 min.
   Uwaga: Zwykle do powlekania PLL wystarcza 10 minut.
4. Po utworzeniu powłoki PLL należy usunąć roztwór PLL i umyć kapsułki 3 razy, jak opisano w ppkt 3.2.

4. Usunięcie rdzenia alginianowego (Rysunek 1C)

1. Dodać 30 ml 50 ml roztworu cytrynianu sodu. Odczekaj 5 minut lub do momentu, gdy cały alginian sodu się rozpuści. Umyć kapsułki trzy razy, jak opisano w kroku 3.1.1.
2. Usunąć 0,9% NaCl, dodać 20 ml pożywki do probówki o pojemności 50 ml i przenieść wszystkie kapsułki zawierające komórki do kolby do hodowli komórkowych. Z zamkniętymi w kapsułkach komórkami należy obchodzić się w standardowych warunkach hodowli komórkowej¹⁸.

5. Zastosowania in vitro do badania interakcji ksenoprzeszczepu i komórek gospodarza lub kinetyki napływu/odpływu metabolitów między komórkami (Rysunek 2)

1. Hoduj komórki gospodarza na 24-dołkowej płytce, aż do zlewania się dla kokultur. Użyj "Pożywki Wzrostu Firobiblastów" do hodowli preadipocytów.
2. Przenieś mikrokapsułki do 24-dołkowej płytki zawierającej zbiegające się komórki gospodarza. Dodaj mikrokapsułki, aby uzyskać monowarstwę (102 mikrokapsułki/^cm2 dołka).
3. Indukuj różnicowanie preadipocytów za pomocą pożywki różnicującej I. Co 48 godzin zmieniaj pożywkę na Differentiation Medium II na sześć dni. Lizuj komórki w buforze RIPA. Użyj 50 μg białka na warunek, aby przeanalizować ekspresję białka za pomocą Western blot.

6. Aplikacja in vivo do leczenia otyłości (Rysunek 3)

1. Zmieszać 4% izofluranu z tlenem w celu indukcji znieczulenia i 2% izofluranu z tlenem w celu podtrzymania znieczulenia. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca.
   1. Nałóż maść przeciwświądową na oczy, aby chronić rogówki przed wysuszeniem.
2. Używaj zamkniętych w kapsułkach komórek, które są trwale znakowane sztucznym białkiem fluorescencyjnym, takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP).
3. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły o rozmiarze 20 wstrzyknąć kapsułkowane komórki.
   1. Wstrzyknąć 0,5 x 10⁶ komórek zawieszonych w 0,2 ml PBS do każdego magazynu tłuszczu iAb, który znajduje się w obszarze wewnątrzotrzewnowym między gonadą a nerką, jak pokazano na rysunku 3. Użyj tej objętości PBS i liczby komórek dla myszy o średniej wadze 40 g. Dostosuj liczbę i objętość komórek u myszy o różnej masie ciała lub w celu określenia efektów zależnych od dawki.

Wyniki

Rycina 1 pokazuje, że każdy etap produkcji mikrokulek może być kontrolowany pod mikroskopem. Rycina 2A przedstawia sposób kokultywacji adypocytów z monowarstwą enkapsulowanych komórek. Rycina 2B to reprezentatywny przykład badania ilościowego z wykorzystaniem kokultur adypocytów i mikrokapsułek opisanych w sekcji 5. Lizaty adypocytów przeanalizowano metodą Western blot. W tym doświadczeniu nie analizowano komórek enkapsulowanych. Pierwotne przeciwciała przeciwko ATGL i β...

Dyskusja

Do kapsułkowania komórek stosowano różne metody, w tym suszenie, wytłaczanie i emulsję¹⁹. W tej metodzie kulki alginianowe są wytłaczane przez igłę, a następnie powlekane PLL, a rdzeń alginianowy zostanie rozpuszczony, aby zakończyć enkapsulację. Chociaż metoda ta jest stosowana od lat, formowanie koralików o pożądanym rozmiarze i kulistym kształcie nadal stanowi wyzwanie. Wielkość kapsułek w dużym stopniu zależy od lepkości roztworu alginianu sodu, średnicy ekstrudera i odległości między końcówką igły a roztw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie do enkapsulacji (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	Brak
KD naukowa pompa strzykawkowa	KD scientific	780100Y	Brak
Mikroskop Olympus	Olympus Optical	IX70-S8F2	Brak
Alginian sodu	Sigma	MKBP8122V	Brak
Bromowodorek poli-L-lizyny (PLL)	Sigma	020M5006V	Brak
Chlorek wapnia	Sigma	SLBJ2662V	Brak
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny	Sigma	030M0200	Brak
Chlorek sodu	Sigma	SLBD2595V	Brak
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	Brak
Przeciwciało pierwszorzędowe ATGL (od królika)	Sygnalizacja komórkowa	2138S	Brak
Przeciwciało wtórne (anty królik)	LI-COR	926-68071	Brak
Bufor do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) Boston	BioProducts	D25Y6Z	Brak
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)	Sigma	RNBD2893	None
Trypsyna	Gibco	25200-056	Brak
Cortizone 10 maść przeciwświądowa	Cortizone 10	C4029138	Brak
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Brak
Surowica dla noworodków (CS)	Sigma	N4762	Brak
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma	F4135	Brak
3-Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)	Sigma	I0516	Brak
Deksametazon	Sigma	D4902	Brak
Insulina (bydlęca)	Sigma	I5879	Brak
Inhibitor proteazy tabletki koktajlowe	Roche	4693159001	Brak