Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Podsumowanie

Transfekcja do linii komórkowej makrofagów, RAW264.7, jest trudna ze względu na naturalną reakcję komórki na obce materiały. Opisaliśmy tutaj delikatną, ale solidną procedurę transfekcji genów reporterowych lucyferazy do komórek RAW264.7.

Streszczenie

Transfekcja pożądanych materiałów genetycznych do komórek jest nieuniknioną procedurą w badaniach biomedycznych. Chociaż opisano wiele metod, niektóre typy komórek są odporne na wiele z tych metod i dają niską wydajność transfekcji¹, co potencjalnie utrudnia badania nad tymi typami komórek. W tym protokole przedstawiamy zoptymalizowaną procedurę transfekcji w celu wprowadzenia genów reporterowych lucyferazy jako plazmidowego DNA do linii komórkowej makrofagów RAW264.7. Opisano dwa różne rodzaje odczynników do transfekcji (na bazie lipidów i poliaminy), a w całym protokole podaje się ważne uwagi, aby zapewnić, że komórki RAW264.7 są minimalnie zmienione przez procedurę transfekcji, a wszelkie uzyskane dane eksperymentalne są bezpośrednimi wynikami eksperymentalnego traktowania. Chociaż skuteczność transfekcji może nie być wyższa w porównaniu z innymi metodami transfekcji, opisana procedura jest wystarczająco solidna, aby wykryć sygnał lucyferazy w RAW264.7 bez zmiany fizjologicznej odpowiedzi komórek na bodźce.

Wprowadzenie

Transfekcja kwasów nukleinowych w komórkach ma różnorodne zastosowanie w badaniach naukowych. Przykłady obejmują (1) geny reporterowe do badania roli różnych elementów genów w ekspresji genów, (2) plazmidy ekspresji białek do nadekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz (3) małe interferujące RNA do obniżania ekspresji genów. Manipulując poziomem ekspresji poszczególnych genów i mierząc zróżnicowany efekt takich manipulacji, naukowcy mogą wydedukować funkcje genów w wybranych systemach biologicznych. Nie wszystkie metody transfekcji zapewniają taką samą skuteczność transfekcji, a nawet ta sama metoda transfekcji nie transfekuje wszystkich typów komórek^{w równym stopniu 1}. W związku z tym opracowano różne metody transfekcji, takie jak metoda fosforanu wapnia, dekstran DEAE, kationowa transfekcja lipidów, kationowa transfekcja polimerów nielipidowych, elektroporacja i nukleofekcja^2,3.

Transfekcja do makrofagów jest szczególnie trudna ze względu na fakt, że makrofagi są profesjonalnymi fagocytami, które są bardzo wrażliwe na obce materiały, w tym pochodzące z bakterii (metylowane) DNA⁴. Wprowadzenie obcego DNA aktywuje szlak receptora Toll-podobnego 9 (TLR9) prowadzący do produkcji cytokin i tlenku azotu^5,6. Te aktywowane makrofagi mogą być wtedy mniej wrażliwe na leczenie, które naukowcy zamierzają zbadać.

Nasze laboratorium rutynowo transfekuje linię komórkową makrofagów RAW264.7 genami reporterowymi lucyferazy i opracowaliśmy protokół, który jest wystarczająco solidny, aby sygnał lucyferazy był znacznie wyższy niż tło, ale także wystarczająco łagodny, aby makrofagi mogły pozostać w stanie spoczynku. Zachowania transfekowanych komórek oceniano za pomocą genu reporterowego świetlika-lucyferazy zawierającego region promotorowy IκBζ (pGL3- IκBζ). Ekspresja IκBζ jest regulowana w górę przez lipopolisacharyd składnika ściany komórkowej bakterii (LPS)^7,8 i obniżana przez cytokinę przeciwzapalną, interleukinę-10 (IL-10)⁸. Aby uwzględnić zmienność transfekcji między studzienkami, współtransfekujemy plazmid kontrolny zawierający gen lucyferazy Renilla (np. phRL-TK) w celach normalizacyjnych. Opisany protokół jest optymalizowany po przetestowaniu różnych parametrów, w tym czasu transfekcji, rodzaju odczynników do transfekcji, ilości odczynników do transfekcji i plazmidowego DNA, a także stosunku odczynnika do transfekcji do plazmidowego DNA. Dwa odczynniki do transfekcji zawarte w tym protokole to (1) odczynnik do transfekcji na bazie lipidów i (2) odczynnik do transfekcji na bazie białka/poliaminy.

Protokół

1. Oczyszczanie plazmidowego DNA

1. Ekstrahuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu maxiprep zgodnie z protokołem producenta. Ponownie zawiesić plazmidowe DNA w 500 μl buforu TE.
2. Wykonaj ekstrakcję fenol:chloroform:izoamyl alkoholem i wytrącanie izopropanolu w celu usunięcia resztkowych zanieczyszczeń bakteryjnych. Obecność LPS zakłóca transfekcję⁹.
   1. Dodać 500 μl alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1, pH 8) do plazmidowego DNA i energicznie wstrząsać przez 15 sekund. Fenol powoduje poważne oparzenia skóry i jest środkiem znieczulającym, więc oparzenia nie zawsze są odczuwalne, dopóki nie dojdzie do poważnych uszkodzeń. Przeprowadzić ekstrakcję fenol:chloroform:izoamyl w dygestorii i zachować ostrożność.
3. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 350 μl górnej fazy wodnej do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml.
4. Dodać 350 μl buforu TE do probówki zawierającej dolną fazę organiczną. Wstrząsaj energicznie przez 15 sekund. Wirować przy 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 350 μl górnej fazy wodnej do tej samej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać 70 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) i dobrze wymieszać. Dodać 700 μl 100% izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Wirować przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
6. Do granulatu dodać 500 μl 75% etanolu. Próbki należy mieszać i odwirowywać w temperaturze 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. DNA znajduje się w granulce.
7. Otwórz nakrętkę probówki i susz granulat na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Granulka powinna stać się przezroczysta. Dodać 500 μl buforu TE, aby ponownie zawiesić osad DNA. Podgrzewać w temperaturze 50 - 60 °C przez 10 minut, aby rozpuścić osad DNA.
8. Zmierzyć absorbancję przy 260 nm (A260) i 280 nm (A280) za pomocą spektrometru. Obliczyć stężenie DNA, mnożąc wartość A260 przez 50 ng/μl. Ocenić jakość DNA, obliczając stosunek A260/A280. DNA o wysokiej jakości powinno dawać stosunek A260/A280 1,8 - 2,0.

2. Hodowla i wysiew komórek

1. Hodowla komórek RAW264.7 w DMEM uzupełniona 9% płodową surowicą cielęcą (DMEM/9% FCS) w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Podczas każdego pasażu należy odłączyć komórki od płytki poprzez ciągłe pipetowanie za pomocą pipety Pasteura. Pasażuj komórki co 2 dni i wysiewaj 1,5 - 2 miliony komórek na 10 cm naczyniu poddanym kulturze tkankowej jako podkład. Rozmrażaj nowy zapas komórek co 5-6 tygodni.
2. W dniu transfekcji wysiewa się 200 000 komórek na dołek na 24-dołkową płytkę w objętości 500 μl DMEM/9% FCS. Inkubować komórki przez 4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
3. Komórki transfekcyjne za pomocą odczynnika na bazie lipidów (krok 3.1) lub odczynnika na bazie białka/poliaminy (etap 3.2).

3. Transfekcja

1. Transfekcja na bazie lipidów:
   1. Rozgrzej odczynnik do transfekcji do RT w ciemności. Rozgrzej pożywkę bez serum i DMEM/9% FCS do 37 °C.
   2. Dodać 0,5 μg plazmidowego DNA do 50 μl pożywki bez surowicy w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 2 μl odczynnika do transfekcji końcówką pipety poniżej powierzchni cieczy. Wirować przez 6 sek.
   3. Pozostawić mieszaninę odczynnika/DNA w ciemności w temperaturze pokojowej na 30 minut.
   4. Podczas 30-minutowej inkubacji należy usunąć pożywkę z dołka i dodać 250 μl świeżego DMEM/9% FCS do każdej studzienki.
   5. Po 30 minutach dodać 250 μl DMEM/9% FCS do mieszaniny odczynnika/DNA. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
   6. Dodać 300 μl rozcieńczonej mieszaniny do każdego dołka. Inkubować przez 2 - 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
   7. Usunąć roztwór do transfekcji i dodać 500 μl DMEM/9% FCS. Inkubować przez 24 - 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przed stymulacją komórek.
2. Transfekcja na bazie białka/poliaminy:
   1. Rozgrzej pożywkę bez serum i DMEM/9% FCS do 37 °C.
   2. Dodać 0,75 μl odczynnika do transfekcji do 18,75 μl pożywki wolnej od surowicy. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 0,5 μl 1 μg/μl DNA do rozcieńczonego transfekowanego odczynnika. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   3. Podczas 10-minutowej inkubacji usunąć pożywkę z każdej studzienki 24-dołkowej płytki i dodać 250 μl świeżego DMEM/9% FCS do każdej studzienki.
   4. Po 10 minutach dodać 250 μl DMEM/9% FCS do mieszaniny odczynnik/DNA.
   5. Dodać 270 μl rozcieńczonej mieszaniny do studzienki. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 - 4 godziny.
   6. Usunąć roztwór do transfekcji i dodać 500 μl DMEM/9% FCS. Inkubować przez 24 - 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}

4. Stymulacja komórek i test lucyferazy

1. Zastąp pożywkę w studzience 250 μl świeżego DMEM/9% FCS.
2. Dodać do studzienki 50 μl LPS lub LPS+IL-10 w żądanych stężeniach. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Stymuluj przez 2 - 6 godzin.
3. Usuń roztwór stymulacyjny przez aspirację, przemyj lodowatym PBS i dodaj 200 μl 1x pasywnego buforu do lizy. Kołysz się w RT przez 30 minut. Zeskrobać i przenieść lizat do probówek o pojemności 1,5 ml i usunąć resztki komórek, wirując przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Przenieść 40 μl oczyszczonego lizatu (supernatantu) na białą, przezroczystą płytkę 96-dołkową w celu oznaczenia sygnałów lucyferazy zgodnie z protokołem producenta.
5. Odczytaj sygnał lucyferazy za pomocą luminometru w całym spektrum światła widzialnego.

5. Analiza danych

1. Oblicz stosunek świetlików do Renilli, dzieląc poszczególne wartości lucyferazy świetlika przez wartości lucyferazy Renilla z każdej studzienki.
2. Oblicz zmianę zagięcia, dzieląc stosunek świetlika do Renilla w dobrze traktowanej studni przez tę w studni nieleczonej.

Wyniki

Rysunek 1 porównuje wydajność transfekcji dwóch odczynników transfekcyjnych w komórkach RAW264.7. Odczynnik oparty na lipidach zazwyczaj dawał wydajność transfekcji na poziomie około 25%, podczas gdy transfekcja oparta na białkach/poliaminach skutkowała wydajnością około 5% (Rysunek 1A). Różnica w wydajności transfekcji była widoczna również w sygnałach lucyferazy w komórkach RAW264.7 transfekowanych reporterem promotora pGL3-IκBζ (Rysunek 1B). Dodanie LPS do tych transf...

Dyskusja

Opisany tutaj protokół nie skupia się wyłącznie na wydajności transfekcji, ale ma na celu osiągnięcie równowagi między wydajnością a zachowaniem stanów fizjologicznych komórek. W szczególności nasza procedura skutecznie minimalizuje toksyczność odczynnika do transfekcji i maksymalizuje sygnał lucyferazy.

Jednym z krytycznych kroków w protokole jest zdrowie komórek. Przerośnięte kultury nie nadają się do transfekcji, ponieważ zmienia się ich fizjologia, a ciągła hodowla komórek RAW264.7 przez d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Technologies	K210007	Każdy zestaw maxiprep będzie działał
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy	Life Technologies	15593-049	Klasa biologii molekularnej. Fenol jest toksyczny, więc jeśli to możliwe, pracuj w dygestorium. Użyj dolnej przezroczystej warstwy organicznej, jeśli w pojemniku tworzą się dwie warstwy płynu.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Scientific	SH30396.03	Inaktywowana w 56 & stopniach; C kąpiel wodna przez 45 minut przed użyciem.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Przed użyciem ogrzać do temperatury co najmniej pokojowej.
Odczynnik do transfekcji XtremeGene HP DBA	Roche	6366236001	Przed użyciem podgrzać do temperatury pokojowej.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Przed użyciem podgrzać do temperatury pokojowej.
5x Pasywny Bufor do Lizy	Promega	E1941	30 ml jest zawarty w Dual Luciferae Reporter Assay System
Dual Lucyferazy Reporter Assay System	Promega	E1910

Life