Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52814

⸱

25 marca 2015

 , 
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Streszczenie

Ze względu na ich modułowość i możliwość przeprogramowania do rozpoznawania szerokiego zakresu sekwencji DNA, domeny wiążące DNA Cys2-His 2 palcami cynkowymi stały się użytecznymi narzędziami do ukierunkowanej inżynierii genomu. Podobnie jak wiele innych białek wiążących DNA, palce cynkowe mają również wrodzoną zdolność do przenikania przez błony komórkowe. Niedawno wykazaliśmy, że ta wewnętrzna przepuszczalność komórek może być wykorzystana do wewnątrzkomórkowego dostarczania białek. Genetyczna fuzja motywów palców cynkowych prowadzi do efektywnego transportu ładunku białek i enzymów do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W przeciwieństwie do innych technologii transdukcji białek, dostarczanie przez domeny palca cynkowego nie hamuje aktywności enzymów i prowadzi do wysokiego poziomu dostarczania cytozolowego. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący wdrożenia technologii palca cynkowego do dostarczania białek do komórek ssaków. Podkreślono kluczowe kroki w celu osiągnięcia wysokiego poziomu wewnątrzkomórkowego dostarczania za pośrednictwem palców cynkowych i omówiono strategie maksymalizacji wydajności tego systemu.

Wprowadzenie

Wysoce efektywne i wszechstronne strategie dostarczania białka są kluczowe dla wielu podstawowych badań i zastosowań terapeutycznych. Bezpośrednie dostarczanie oczyszczonych białek do komórek stanowi jedną z najbezpieczniejszych i najłatwiejszych metod osiągnięcia tego celu. 1,2 W przeciwieństwie do strategii, które opierają się na ekspresji genów z kwasów nukleinowych,3-5 dostarczanie białek nie stwarza ryzyka mutagenezy insercyjnej, jest niezależne od komórkowej maszynerii transkrypcji/translacji i pozwala na natychmiastowy efekt. Jednak brak prostych i dających się uogólnić metod nadawania białkom aktywności penetrującej komórki rutynowo zakłóca ich bezpośrednie wejście do komórek. Obecne metody ułatwiające wewnątrzkomórkowe dostarczanie białek opierają się na wykorzystaniu naturalnie występujących6-8 lub zaprojektowanych peptydów penetrujących komórki9-12, doładowanych domen transdukcji13,14, nanocząstek15 i liposomów,16 cząstek wirusopodobnych 17,18 i polimerowych materiałów mikrosferycznych. 19 Niestety, wiele z tych podejść jest utrudnionych przez niskie wskaźniki wychwytu komórkowego,20,21 słabą stabilność,22 niezamierzoną specyficzność typu komórki,23niskie właściwości ucieczki endosomalnej24 i toksyczność. 25 Ponadto wiele technologii transdukcji białek zmniejsza bioaktywność dostarczanych białek. 14

Nasze laboratorium wcześniej wykazało, że białka nukleazy palca cynkowego (ZFN) — chimeryczne endonukleazy restrykcyjne składające się z programowalnego białka wiążącego DNA Cys2-His 2 z palcami cynkowymi i domeny rozszczepienia endonukleazy restrykcyjnej FokI26-28 — są z natury przepuszczalne dla komórek. Wykazano, że ta zaskakująca aktywność penetrująca komórki jest wewnętrzną właściwością specjalnie zaprojektowanej domeny palca cynkowego, platformy wiążącej DNA, która pojawiła się jako potężne narzędzie do ukierunkowanej inżynierii genomu i uważana za wynik konstelacji sześciu dodatnio naładowanych reszt na powierzchni białka. Rzeczywiście, wykazano, że kilka białek wiążących DNA, w tym c-Jun i N-DEK, ma wrodzoną zdolność do przenikania przez błony komórkowe. 33 Niedawno nasze laboratorium rozszerzyło te wyniki i wykazało, że aktywność przenikania do komórek domen palca cynkowego (ZiF) może być wykorzystana do wewnątrzkomórkowego dostarczania białek. Genetyczna fuzja jedno- lub dwupalcowych domen ZiF z określonym ładunkiem białkowym doprowadziła do zwiększenia wydajności wychwytu, która przewyższyła wiele konwencjonalnych systemów dostarczania peptydów penetrujących komórki. 34 Przede wszystkim dostarczanie za pośrednictwem ZiF nie zagroziło aktywności skondensowanego ładunku enzymatycznego i ułatwiło wysokie poziomy dostarczania cytozolu. Podsumowując, odkrycia te pokazują potencjał domeny ZiF w zakresie ułatwiania wydajnego i łatwego dostarczania białek i potencjalnie bardziej zróżnicowanych typów makrocząsteczek do komórek.

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku, jak wdrożyć technologię ZiF do dostarczania białek w komórkach ssaków. Wcześniej skonstruowaliśmy zestaw jedno-, dwu-, trzy-, cztero-, pięcio- i sześciopalcowych domen ZiF, które nie mają zdolności do wiązania DNA, ze względu na podstawienie każdej z reszt wiążących α-helisowe DNA, ale są zdolne do dostarczania białek do komórek34 (Figura 1). Opisano produkcję i transdukcję szmaragdowego GFP (EmGFP) do komórek HeLa przy użyciu dwupalcowej domeny ZiF. Protokół ten można rozszerzyć na prawie każde białko zdolne do rozpuszczalnej ekspresji w Escherichia coli i prawie każdym typie komórek ssaków. Przedstawiono oczekiwane wyniki, a także omówiono strategie maksymalizacji wydajności tego systemu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Klonowanie

  1. Uzyskaj podstawione alaniną dwupalcowe domeny ZiF, które zostały sklonowane do systemu wektorów ekspresyjnych pET-28 i są dostępne na żądanie (pET-2F-ZiF). Rozdział 34
  2. PCR amplifikuje EmGFP z plazmidu Emerald-pBAD za pomocą starterów 5' XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTGCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGCTGTTCAC-3'; Xma (Międzynarodowa Sieć TI strona pogrubiona) i 3' SacI-EmGFP (5'-CGGATCTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCCATGCCGAG-3'; SacI strona pogrubiona).
    1. Użyć 5 ng matrycy DNA, 10 μl 10x buforu polimerazy, 1 jednostki (U) polimerazy Taq DNA, 0,2 mM każdy dNTP i 0,2 μM każdego startera w roztworze o objętości 100 μl, a pozostała objętość składa się z wody destylowanej/dejonizowanej. Korzystaj z warunków jazdy na rowerze: 95 °C przez 5 minut; 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i w temperaturze 72 °C przez 1 minutę; 72 °C przez 10 min. Oczyścić produkt PCR przez ekstrakcję żelem i oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru o wymiarach Abs260 x 50 μg/ml.
  3. Trawić pET-2F-ZiF i wkładkę kodującą EmGFP z enzymami restrykcyjnymi XmaI i SacI w zalecanym buforze przez 3 godziny w temperaturze 37 °C przy użyciu 10 U enzymu na 1 μg DNA. Wizualizacja DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego, takiego jak bromek etydyny.
  4. Oczyść strawione DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i oznacz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru o wymiarach Abs260 x 50 μg/ml.
  5. Zlikuluj oczyszczone DNA kodujące EmGFP do 50-100 ng pET-2F-ZiF za pomocą 1 U ligazy DNA T4 przez co najmniej 1 godzinę w RT. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przeprowadzić reakcję ligacji, stosując stosunek trzonowców do liczby wstawek do wektora wynoszący 6:1.
  6. Rozmrozić 50 μl dowolnych chemicznie kompetentnych komórek XL-1 Blue Escherichia coli na lodzie i delikatnie wymieszać z 10-20 ng ligowanego pET-2F-ZiF-EmGFP.
  7. Przechowywać na lodzie przez 30 minut. Mieszaninę poddać szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 90 sekund i odzyskać komórki w 2 ml bulionu Super Optimal z represją kataboliczną (SOC) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
  8. Rozprowadzić 100 μl kultury odzysku na płytce agarowej z bulionu lizogenicznego (LB) z 50 μg/ml kanamycyny i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  9. Następnego dnia zaszczepić 6 ml kultury Super Bulion (SB) lub LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny jedną kolonią z płytki agarowej LB i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Colony PCR przy użyciu starterów 5' XmaI-EmGFP i 3' SacI-EmGFP można użyć do identyfikacji pozytywnych klonów przed miniprepem.
  10. Oczyść pET-2F-ZiF-EmGFP przez miniprep i potwierdź plazmid przez sekwencjonowanie DNA przy użyciu promotora T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3').

2. Ekspresja i Oczyszczanie

  1. Rozmrozić 50 μl chemicznie kompetentnych komórek BL21 E. coli na lodzie i delikatnie wymieszać ze 100 ng plazmidu pET-2F-ZiF-EmGFP. Przekształć zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.8.
  2. Następnego dnia zaszczepić 10 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny pojedynczą kolonią i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
  3. Następnego dnia rozcieńczyć 10 ml kultury O/N w 1 l pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny, 0,2% glukozy i 100 μM ZnCl2. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem do gęstości optycznej 0,8 przy długości fali 600 nm (OD600) i indukować ekspresję białka za pomocą 2 mM izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Po 6 godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Warunki indukcji są bardzo zmienne i zależą od stabilności wyrażanych białek. Monitoruj OD600 co 30 minut, aż zostanie osiągnięty OD600 0.8.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM MgCl2, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) i 10 mM imidazol, pH 8,0). Lizuj ogniwa na lodzie za pomocą sonikacji z następującym ustawieniem: 50% mocy wyjściowej, 4-minutowy czas procesu z 5-sekundowymi interwałami włączenia/10-sekundowego wyłączenia. Unikaj przegrzania roztworu.
  5. Odwirować lizat komórkowy przy 25 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do świeżej probówki zbiorczej. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wykonaj wszystkie poniższe czynności w temperaturze 4 °C.
  6. Przepuścić supernatant przez kolumnę uprzednio wypełnioną 1 ml zrównoważonej gnojowicy Ni-NTA. Przepłukać żywicę 20 ml buforu do przemywania (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 i 30 mM imidazolu, pH 8,0).
  7. Eluować białko za pomocą 5 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 i 300 mM imidazolu, pH 8,0).
  8. Wymienić buforowo eluowane białko z buforem spichrzowym (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 i 10% glicerolu, pH 8,0) i zagęścić białko do co najmniej 40 μM za pomocą koncentratora wirowego przez odwirowanie zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Określić stężenie białka za pomocą testu BCA lub Bradforda. Zmieszaj 2 μl oczyszczonych białek z 2 μl barwnika ładującego 2× SDS-PAGE, gotuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie rozpuść na 4%-20% Tris-Glycine SDS-PAGE w celu oceny czystości białka (Rysunek 2).

3. Magazynowanie białka

  1. Podwielokrotność zagęszczonego białka, błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C. W przypadku białek fuzyjnych EmGFP należy przykryć probówkę folią aluminiową, aby chronić białko przed światłem.
  2. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu białkowego. Uwaga: Białka połączone z ZiF są stabilne w tych warunkach przez co najmniej 1 miesiąc. Niewłaściwe lub >4-miesięczne przechowywanie może prowadzić do wytrącania się białka lub fotowybielania EmGFP.

4. Transdukcja białek

  1. Utrzymuj komórki HeLa w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Habitat (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego w temperaturze 37 °C w całkowicie nawilżonej atmosferze z 5% CO2,
    Uwaga: Komórki pasażowane więcej niż 30 razy nie są zalecane do transdukcji białek.
  2. Wstępnie pokryć 24-dołkową płytkę 500 μl 50 μg/ml polilizyny przez 30-60 minut w temperaturze 25 °C. Komórki nasienne umieścić na 24-dołkowej płytce o gęstości 2 ×10,5 komórek na basenik. Po 24 godzinach od wysiewu lub gdy komórki zlewają się w 80%-90%, usuń pożywkę z każdej studzienki i przemyj 500 μl wstępnie podgrzanego DMEM bez surowicy (SFM).
  3. Do każdej studzienki dodać 250 μl SFM zawierającego 2 μM białka ZiF-EmGFP i 100 μM ZnCl2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Uwaga: Domeny ZiF dostają się do komórek głównie przez makropinocytozę,34 która jest mechanizmem zależnym od energii. Dlatego komórki muszą być inkubowane w temperaturze 37 °C w celu efektywnej internalizacji białek.
  4. Usunąć pożywkę z komórek i przemyć trzykrotnie 500 μl soli fizjologicznej (DPBS) Dulbecco, buforowanej fosforanem bez wapnia i magnezu, uzupełnionej 0,5 mg/ml heparyny. Uwaga: Heparyna jest niezbędna do usunięcia białka związanego z powierzchnią, które może komplikować dalsze analizy.
  5. (Opcjonalnie) Powtórz zabiegi do trzech razy, aby usprawnić poród.
  6. Odizolować leczone komórki natychmiast po przepłukaniu heparyną przez trawienie 0,05% trypsyną-EDTA w temperaturze 37 °C przez 2 min. Ponownie zawiesić oderwane komórki w 0,5 ml DPBS uzupełnionego 1% FBS.
  7. Zmierzyć intensywność fluorescencji każdej próbki za pomocą cytometrii przepływowej35 przy użyciu kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (rysunek 3). Dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), aby umieścić populację zainteresowania na skali, zapewniając, że populacje o różnych właściwościach są od siebie oddzielane.
  8. Zbierz 10 000 zdarzeń na żywo dla każdej próbki i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej. 36 Normalizuj fluorescencję z komórek HeLa traktowanych ZiF-EmGFP do komórek traktowanych tylko SFM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Białka fuzyjne ZiF-EmGFP z dwoma palcami mogą być ekspresowane w E. coli z homogenicznością >95% i wysoką wydajnością (>25 mg/ml) (Rysunek 2). Ogólnie białka fuzyjne ZiF z jednym i dwoma palcami mogą być produkowane w ilościach niemal identycznych jak w przypadku białka dzikiego typu niezmodyfikowanego. Jednak w niektórych kontekstach białka fuzyjne ZiF z pięcioma i sześcioma palcami nie mogą być produkowane z wydajnością wystarczającą dla dalszych zastosowań.

B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono krok po kroku protokół dostarczania białka za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen palca cynkowego (ZiF). Domena ZiF nie zmniejsza aktywności skondensowanego ładunku enzymatycznego34; pozwala na produkcję i oczyszczanie białek w plonach prawie identycznych z tymi obserwowanymi w przypadku białka niemodyfikowanego; i może transportować białka i enzymy do szerokiego zakresu typów komórek z wydajnością przewyższającą tradycyjne peptydy penetrujące komórki lub systemy domen transdu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (DP1CA174426 Carlosa F. Barbasa) i ShanghaiTech University, Shanghai, China (do J.L.). Grafika molekularna została wygenerowana przy użyciu PyMol.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
XmaINew England BiolabsR0180L
SacINew England BiolabsR0156L
Rozwiń system High Fidelity PCRRoche11759078001
dNTPNew England BiolabsN0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini żele białkowe, 1,5 mm, 10 dołkówLife TechnologiesEC6028BOX
2x Bufor do próbek LaemmliBioRad161-0737
T4 DNA LigaseLife Technologies15224-017
BL21 (DE3) Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2527I
IPTGThermo ScientificR0391
ChlorekSigma-Aldrich208086-5G
SiarczanKanamycynyFisher ScientificBP906-5
GlukozaSigma-AldrichG8270-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-25
Chlorek soduSigma-AldrichS9888-25G
DTTFisher ScientificPR-V3151 
PMSFThermo Scientific36978
Żywica agarozowa Ni-NTAQIAGEN30210
GlicerolSigma-AldrichG5516-500ML
ImidazolSigma-AldrichI5513-25G
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15EMO MilliporeUFC900324
DMEMLife Technologies11966-025
Technologie życiapłodu bydlęcego10437-028
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy Life Technologies15240-062
24-dołkowa płaska płyta dolnaSigma-AldrichCLS3527-100EA
Poli-lizynaSigma-AldrichP7280
DPBS, bez wapnia, bez magnezuLife Technologies21600010
Siarczan heparanuSigma-AldrichH4777
TrypsynaLife Technologies
Ogniwa HeLaATCCCCL-2
Nano Drop ND-1000 Zestaw do oczyszczania Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCRQIAGEN28104
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN28704
25300054 Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
  2. Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
  3. Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
  4. Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
  5. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  6. Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
  7. Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
  8. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
  9. Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
  10. Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
  11. Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
  12. Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
  13. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
  14. Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
  15. Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
  16. Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
  17. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
  18. Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
  19. Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
  20. Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755(2014).
  21. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
  22. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
  23. Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
  24. Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
  25. Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
  26. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
  27. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
  28. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  29. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
  30. Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
  31. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  32. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
  33. Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
  34. Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
  35. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
  36. Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
  37. Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przep ywowaoczyszczanie bia ekfuzja gen wekspresja bakteryjnatransdukcja kom rekbia ko fluorescencyjnedostarczanie do cytozolu
Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.