Wykres penetracji elektrycznej (EPG) jest dobrze znaną techniką badania zachowań żywieniowych owadów noszących stylet. W tym artykule przedstawiamy nowe zastosowanie EPG jako nieinwazyjnego narzędzia do pozyskiwania wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologii elementów sitowych (SE), komórek tworzących naczynia krwionośne łyka u roślin.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Właściwości elektrofizjologiczne komórek są często badane in vitro, po oddzieleniu ich od ich rodzimego środowiska. Jednak badanie transmisji elektrycznej między odległymi komórkami w organizmie wymaga nagrań in vivo, wolnych od artefaktów komórek osadzonych w ich naturalnym środowisku. Przesyłanie sygnałów elektrycznych z uszkodzonych do niezranionych obszarów w roślinie od dawna wzbudza zainteresowanie botaników. Łyko, żywa część układu krwionośnego rośliny, która jest rozsiana po całej roślinie, została postulowana jako główna tkanka w transmisji elektrycznej u roślin. Brak odpowiednich metod elektrofizjologicznych stwarza wiele wyzwań dla badania właściwości elektrycznych komórek łyka in vivo. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie podejście do elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej elementów sitowych (SE), które wykorzystuje żywe mszyce lub inne owady żywiące się łykiem pluskwiak, zintegrowane w obwodzie wykresu penetracji elektrycznej (EPG). Wszechstronność, solidność i dokładność tej metody umożliwiły rejestrowanie i szczegółowe badanie sygnałów elektrycznych indukowanych raną w SE żył centralnych rośliny Arabidopsis thaliana1. Tutaj pokazujemy, że elektrody EPG można łatwo wdrożyć do wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologicznych SE w żyłach brzeżnych, a także do badania zdolności SE do reagowania sygnałami elektrycznymi na kilka bodźców zewnętrznych. Podejście EPG zastosowane do elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej SE może być zastosowane do wielu różnych gatunków roślin, w dużej liczbie kombinacji roślina/owad i w wielu celach badawczych.
Wprowadzenie
Zdolność do generowania dalekosiężnych sygnałów elektrycznych jest korzystną cechą organizmów wielokomórkowych, która umożliwia efektywne reagowanie na bodźce zewnętrzne. Cecha ta ewoluowała niezależnie u roślin i zwierząt, stanowiąc tym samym przykład ewolucji konwergentnej. Biorąc pod uwagę, że sygnały elektryczne są sprzężone z istotnymi funkcjami u zwierząt, takimi jak przekazywanie impulsów nerwowych i skurcze mięśni, molekularne podstawy, mechanizm przekazywania oraz funkcja indukowanych bodźcami sygnałów elektrycznych u zwierząt są przedmiotem intensywnych badań. W przeciwieństwie do tego, indukowana bodźcami sygnalizacja elektryczna u roślin była rzadziej przedmiotem zainteresowania badawczego. Chociaż rośliny nie posiadają nerwów ani mięśni, wydaje się, że istnieje wystarczająco dużo dowodów, aby założyć, że indukowane bodźcami sygnały elektryczne u roślin odgrywają kluczową rolę w ich reakcjach na czynniki środowiskowe.
Floem, żywy komponent układu przewodzącego roślin, został uznany za główny substrat dla transmisji indukowanych bodźcem sygnałów elektrycznych, przesyłanych z obszarów stymulowanych/uszkodzonych do obszarów niestymulowanych/nieuszkodzonych2. Głównymi komórkami floemu są elementy sitowe (SEs) – stosunkowo proste, wydłużone komórki. Końce SEs są połączone z innymi SEs, tworząc ciągły, niskooporowy system rurek sitowych rozprzestrzeniony w całej roślinie. Istnieje jednak bardzo niewiele badań nad właściwościami elektrycznymi tych wysoce wyspecjalizowanych komórek. W tych wcześniejszych badaniach naukowcy uzyskiwali dostęp do SEs za pomocą szklanych mikroelektrod3 lub szklanych elektrod sprzężonych z wprowadzonymi do rośliny stylletami mszyc, po przeprowadzeniu stylektomii (odcięcia)4. Szklane mikroelektrody wykonuje się z kapilar szklanych, których jeden koniec jest rozciągany pod wpływem ciepła do postaci cienkiej końcówki o średnicy mniejszej niż 1 µm, a następnie napełnia się je roztworem KCl. Przewód Ag/AgCl lub platynowy, wprowadzony do szklanej elektrody wypełnionej KCl, jest następnie podłączany do wejścia wzmacniacza, a elektrodę odniesienia umieszcza się w kąpieli otaczającej badaną komórkę, zamykając obwód. Taki układ rejestruje różnicę potencjałów między zewnątrzkomórkową elektrodą odniesienia a wewnątrzkomórkową elektrodą pomiarową, tj. potencjał błonowy komórki5. Za pomocą tej metody Umrath wykonał pierwszy zapis wewnątrzkomórkowy z komórki roślinnej, wykorzystując algi Nitella6,7. Nitella jest stosunkowo prostym organizmem o dużych komórkach, a zatem podatnym na eksperymenty z zakresu elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej. W przeciwieństwie do tego, wprowadzenie wewnątrzkomórkowych elektrod szklanych do małych komórek wielokomórkowych, trójwymiarowych roślin lądowych jest technicznie wymagające, wymaga wysoko wykwalifikowanego badacza, a także zaawansowanego sprzętu do wizualizacji, mikromanipulacji i antywibracyjnego. Chociaż elektrody szklane nadają się do rejestracji sygnałów z komórek powierzchniowych roślin, takich jak komórki epidermy korzenia8, zapisy wewnątrzkomórkowe z komórek głęboko osadzonych w tkance roślinnej, takich jak SEs, najprawdopodobniej wywołują odpowiedzi indukowane uszkodzeniem, co zafałszowuje wyniki. W 1989 roku Fromm i Eschrich zgłosili zastosowanie alternatywnej metody, zwanej „metodą mszycą”, w której elektrody szklane są sprzężone ze stylletami mszyc po stylektomii4. Metoda mszyca jest małoinwazyjna, ponieważ elastyczne styllety nie powodują uszkodzeń tkanek ani komórek, w przeciwieństwie do elektrod szklanych. Styllety mszyc są genialnym naturalnym rozwiązaniem do penetracji roślin, a mszyce są znacznie sprawniejsze od ludzi w odnajdywaniu SEs. Niestety, ta metoda mszyca jest również bardzo wymagająca pod względem wiedzy technicznej i wyposażenia. Ponadto sukces każdego eksperymentu z zastosowaniem tej techniki zależy całkowicie od tego, czy mszyca w momencie stylektomii znajduje się w trybie żerowania – ze stylletem stabilnie wprowadzonym do SE. Patrząc wstecz, można zauważyć, że szanse na sukces tej techniki można by zwiększyć, dodając do układu eksperymentalnego instrument pozwalający zidentyfikować, czy styllet mszycy znajduje się w SE w momencie przeprowadzania stylektomii.
W 1964 roku McLean i Kinsey opisali „elektroniczny system monitorowania” do badania zachowań żerowania mszyc w czasie rzeczywistym9,10. W systemie tym mszyca i roślina przebita stylitem zostały włączone do obwodu elektrycznego. Później, w 1978 roku, Tjallingii opracował zmodyfikowaną wersję tego systemu, zwaną systemem „elektrycznego wykresu penetracji” (Electrical Penetration Graph – EPG)11,12. Podczas gdy pierwotny elektroniczny system monitorowania był czuły jedynie na potencjały wynikające z rezystancji, w systemie EPG, oprócz potencjałów wynikających z rezystancji (R) owada, można było rejestrować potencjały siły elektromotorycznej (sem), t.j. generowane w roślinie lub w owadzie. Stanowi to istotną poprawę, ponieważ oba komponenty sygnału, sem i R, dostarczają biologicznie istotnych informacji o zdarzeniach podczas penetracji rośliny przez mszyce. To, co czyni przedwzmacniacz EPG czułym na komponenty R, to jego stosunkowo niska rezystancja wejściowa wynosząca 1 GΩ, która jest bliska średniej rezystancji układu roślina/mszyca. Do rośliny przyłożone jest niewielkie napięcie przesunięcia (Rysunek 1, V) wynoszące około +100 mV, które następnie dzieli się pomiędzy roślinę i owada z jednej strony, a rezystancję wejściową z drugiej. Napięcia i ich zmiany są mierzone w punkcie (Rysunek 1A,B) między owadem a rezystorem wejściowym. Zatem komponenty R reprezentują modulacje napięcia przesunięcia wynikające z rezystancji roślina-mszyca, podczas gdy komponenty sem stanowią pewną część potencjałów roślinnych na końcówce stylitu oraz potencjałów wywołanych w owadzie. Potencjały roślinne — tutaj najistotniejsze — to głównie potencjały błonowe komórek roślinnych przebitych stylitami mszycy. Potencjały owada wydają się być głównie potencjałami strumieniowymi wywołanymi ruchami płynów w dwóch kanałach stylitu, t.j. kanale pokarmowym i ślinowym; w EPG nie rejestruje się wewnętrznych potencjałów nerwowych ani mięśniowych. W praktyce końcówka stylitu pełni funkcję końcówki elektrody. Wszystkie komórki roślinne są naładowane ujemnie wewnątrz w stosunku do dodatniego zewnętrza komórki. Prąd elektryczny (t.j. ruch naładowanych jonów w roztworze wodnym) płynący z wnętrza na zewnątrz i vice versa jest bardzo ograniczony ze względu na wysoką rezystancję błony komórkowej. Normalnie potencjał spoczynkowy pozostaje stały. Jednak gdy jony ujemne przemieszczają się na zewnątrz lub jony dodatnie do wnętrza poprzez błonę komórkową, potencjał błonowy ulega zmniejszeniu, t.j. następuje „depolaryzacja”. Depolaryzacja zachodzi w przypadku pobudzenia komórki. Jony przemieszczają się wtedy do wewnątrz lub na zewnątrz, gdy otwierają się specyficzne kanały jonowe w błonie lub gdy błona zostanie uszkodzona i jony wyciekają na zewnątrz i do wewnątrz. Wszystkie komórki posiadają w błonie plazmatycznej kanały jonowe i pompy, które przywracają potencjał błonowy do poziomu spoczynkowego poprzez odtworzenie pierwotnego stężenia różnych jonów wewnątrz komórki. Potencjał spoczynkowy i jego zmiany są komponentami sem, w związku z czym technika EPG nadaje się do ich pomiaru.
Rysunek 1. Elektrody-EPG. Elektrodą-EPG jest żywa mszyca zintegrowana z obwodem elektrycznego grafu penetracji (EPG), której stylcie jest wprowadzony do elementu sitowego (SE) w stabilnym trybie żerowania. Jeśli przebity stylctem SE jest w stanie spoczynku (panel A), napięcie w obwodzie rejestrowane przez EPG jest stabilne i znajduje się na poziomie potencjału spoczynkowego (panel C, Rest). Jeśli SE zostanie pobudzony, jego błona ulega depolaryzacji (panel B), co w EPG objawia się jako stopniowy wzrost napięcia (panel C, Depolarization). W miarę jak równowaga jonowa w SE powraca do stanu spoczynku, tzn. gdy następuje repolaryzacja, napięcie rejestrowane przez EPG stopniowo spada do poziomu potencjału spoczynkowego (panel C, Repolarization). W panelu C oznaczenia „A” i „B” odnoszą się odpowiednio do scenariuszy przedstawionych w panelach A i B. V = regulowane źródło napięcia offsetowego. Ri = rezystor wejściowy. Równolegle do zewnętrznego rezystora 1 GΩ, wzmacniacz posiada wewnętrzny (w wzmacniaczu operacyjnym) rezystor o wysokiej wartości 1.5 TΩ (panele A i B, kolor szary). Poprzez zdalne sterowanie przełącznikiem można zmienić przedwzmacniacz EPG z trybu normalnego na tryb emf, co pozwala na uzyskanie bardzo dokładnych wartości napięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
W następnej sekcji przedstawiamy czytelnikowi podstawowy protokół przeprowadzania eksperymentów EPG, który jest aktualny zarówno dla badań koncentrujących się na owadach, jak i na roślinach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla mszyc
Uwaga: Wybór gatunku rośliny i mszycy do rejestracji EPG zależy od celu badań. W przypadku badań nad Arabidopsis thaliana odpowiednim gatunkiem mszycy jest Brevicoryne brassicae.
- Hoduj mszyce B. brassicae w szklarni na Brassica oleracea. Rośliny wykorzystywane do hodowli mszyc należy trzymać w klatkach, aby uniknąć zanieczyszczenia innych roślin. Rośliny do hodowli mszyc oraz rośliny eksperymentalne (w naszym przypadku B. oleracea i A. thaliana) należy przechowywać w oddzielnych pomieszczeniach, aby zapobiec przypadkowemu przeniesieniu mszyc na rośliny eksperymentalne.
- Przenoś mszyce na świeże rośliny mniej więcej co 2 tygodnie, zanim spowodują one znaczne uszkodzenia rośliny lub osiągną nadmierną populację. W celu zainicjowania nowej kolonii przenieś 10-20 dorosłych mszyc na świeżą roślinę hodowlaną.
- Regularnie monitoruj rośliny hodowlane pod kątem zanieczyszczenia niepożądanymi gatunkami mszyc, innymi owadami roślinożernymi, pasożytnikami mszyc oraz grzybami, które mogą wpływać na kondycję kolonii mszyc.
- Do rejestracji EPG zbieraj dorosłe, bezskrzydłe mszyce do jednego tygodnia po ich ostatnim linieniu.
- Po zakończeniu eksperymentów niewykorzystane rośliny eksperymentalne należy zwrócić do komory wzrostu, ponieważ często znajdują się na nich potomstwo powstałe podczas rejestracji, które mogłoby nieumyślnie zanieczyścić inne rośliny.
2. Okablowanie owadów do rejestracji EPG
- Aby wykonać elektrody dla owadów, należy przygotować mosiężne piny łączące (gwoździe, Ø 1,2 mm), cienki drut miedziany (Ø 0,2 mm), bardzo cienki drut złoty (Ø ok. 20 µm), klej srebrowy na bazie wody, prostą małą lutownicę z topnikiem i drutem lutowniczym z rdzeniem kalafoniowym, stereomikroskop z powiększeniem 10X, małe nożyczki lub skalpel, dwie precyzyjne pęsety oraz arkusz lub pudełko ze styropianu. Uwaga: użyteczny może być mikser wirowkowy (vortex). Uwaga: protokół krok po kroku dotyczący wykonania elektrod przedstawiono na Rysunku 2.
- Do manipulacji z mszycami i nakładania kleju należy przygotować: mały i miękki pędzelek akwarelowy z włosia wielbłąda (rozmiar 2 lub mniejszy) oraz szpilki entomologiczne, takie jak te stosowane w kolekcjach owadów, choć równie dobrze sprawdzi się cienka igła do szycia lub wykałaczka. Krok 4 pokazuje, jak rozpocząć pomiar EPG.
- Krok 1.
Uwaga: kroki 1 i 2 poniżej opisują sposób przygotowania elektrod dla owadów bez udziału mszycy. Krok 3 pokazuje, jak podłączyć mszycę do elektrody. Podczas montażu drutów zaleca się próżniową unieruchomienie mszycy, choć nie zawsze jest to wymagane w przypadku gatunków wolno poruszających się (np. B. brassicae).- Włączyć lutownicę i roztopić niewielką ilość drutu lutowniczego na jej grocie (Rysunek 2A). Zwilżyć głowicę mosiężnego pinu łączącego topnikiem lutowniczym (Rysunek 2B) i zanurzyć ją w roztopionym spoiwie lutowniczym (Rysunek 2C).
- Na jednym końcu kawałka cienkiego drutu miedzianego o długości 1-2 cm nałożyć warstwę roztopionego spoiwa lutowniczego (Rysunek 2D). Następnie przyłożyć pin i drut miedziany do gorącego grota lutownicy (Rysunek 2E), a potem odsunąć je, aby ostygły i zastygły (Rysunek 2F).
- Krok 2.
- Fiolkę z klejem srebrowym energicznie wstrząsać (lub mieszać w vortexie) przez kilka minut, aż powstanie gładka emulsja. Na przedmiotowym stoliku stereomikroskopu wyciąć (nożyczkami lub skalpelem) kilka kawałków złotego drutu (o długości około 1,5 cm) (Rysunek 2G).
- Wziąć mosiężny pin z przylutowanym drutem miedzianym (wykonany w sekcji 2.3) i zanurzyć wolny koniec drutu miedzianego w małym zbiorniczku kleju srebrowego, który zgromadził się pod nakrętką fiolki po jej otwarciu (Rysunek 2H). Uwaga: potrzebna jest tylko mała kropla.
- Przesunąć zanurzony w kleju koniec drutu miedzianego do kawałka złotego drutu, lekko go unosząc, aby uniknąć rozmazania kleju na stoliku stereomikroskopu. Należy doprowadzić do nałożenia się drutu miedzianego i złotego na odcinku kilku mm (Rysunek 2I), rozprowadzając klej wzdłuż miejsca styku obu drutów.
- Odczekać, aż klej wyschnie na tyle, by utrzymać druty razem. Po wyschnięciu sprawdzić kontakt kleju i w razie stwierdzenia miejsc wolnych od kleju w miejscu połączenia drutów, dodać świeży klej za pomocą małego pinu lub innego kawałka drutu miedzianego.
- Po przygotowaniu elektrody dla owada należy ją przechowywać, na przykład włożoną w kawałek styropianu.
Uwaga: długość złotego drutu determinuje swobodę ruchów mszycy: jeśli jest zbyt krótki (mniej niż 5 mm), mszyca może czuć się ograniczona i nie będzie zachowywać się naturalnie; jeśli jest zbyt długi (>2 cm), mszyca będzie poruszać się swobodnie. Mszyce mają tendencję do przemieszczania się na stronę adaksjalną liści, jeśli mają taką możliwość. Jeśli złoty drut dotknie liścia, nastąpi zwarcie sygnału.
- Krok 3.
- Mszyca może być utrzymywana w miejscu za pomocą lekkiego ssania próżniowego; w tym przypadku należy zainstalować urządzenie ssące pod stereomikroskopem. Otwór ssący należy umieścić w centrum pola widzenia.
- Fiolkę z klejem srebrowym energicznie wstrząsać przez kilka minut (lub mieszać w vortexie), aż powstanie gładka emulsja. Chwycić mszycę za pomocą małego pędzelka.
- Włączyć urządzenie ssące i umieścić mszycę na otworze ssącym (Rysunek 2J), tak aby grzbiet odwłoka był zwrócony w stronę eksperymentatora. Za pomocą precyzyjnego pędzelka usunąć wosk powierzchniowy z odwłoka (obfity u mszyc kapuśnianych).
- Otworzyć fiolkę z klejem i zwilżyć pin bardzo małą kroplą kleju srebrowego (Rysunek 2K). Nanieść kroplę kleju srebrowego na grzbiet odwłoka mszycy (Rysunek 2L-M). Pozostawić tę kroplę do całkowitego wyschnięcia przez kilka minut, ponownie energicznie wstrząsnąć fiolką z klejem i dodać drugą kroplę kleju srebrowego na pierwszą. Uwaga: mimo że klej srebrowy jest przewodnikiem elektrycznym, nie powoduje on znaczących uszkodzeń kutykuli owada.
- Po zamknięciu fiolki z klejem wsunąć wolny koniec złotego drutu w mokrą kroplę i trzymać drut nieruchomo do całkowitego wyschnięcia kleju (Rysunek 2N). Unikać rozmazania kleju na odnóżach lub czułkach; w takim przypadku należy odrzucić daną mszycę.
- Wyłączyć urządzenie do unieruchomienia próżniowego i ostrożnie podnieść owada (Rysunek 2O). W razie potrzeby użyć precyzyjnego pędzelka, aby pomóc w podniesieniu mszycy z urządzenia ssącego.
Uwaga: montaż drutów u B. brassicae nie wymaga próżni, ponieważ można to wykonać na kawałku precyzyjnej chusteczki laboratoryjnej, której chropowata powierzchnia zapewnia mszycy wystarczającą przyczepność, dzięki czemu nie zostanie ona podniesiona po naniesieniu kropli mokrego kleju na odwłok. Po wyschnięciu kleju mszycę można podnieść z chusteczki za pomocą precyzyjnego pędzelka. - Włożyć mosiężny pin z podłączonym owadem do styropianu i w razie potrzeby kontynuować montaż drutów u wszystkich pozostałych owadów, które mają zostać użyte w sesji pomiarowej EPG.
Uwaga: opisane protokoły montażu drutów u mszyc sprawdzają się w naszej praktyce. Użytkownik może opracować własną metodę montażu.
- Krok 4.
- Umieścić rośliny w klatce Faradaya (Rysunek 2P) na nieprzewodzącym podłożu: należy użyć szalek Petriego lub płyty szklanej lub plastikowej.
- Włożyć elektrodę roślinną do gleby w każdej doniczce. Wsunąć mosiężny pin owada z drutami do wejścia przedwzmacniacza EPG (Rysunek 2Q). Uwaga: elektroda glebowa nie odpowiada elektrodzie uziemiającej stosowanej w innych technikach elektrofizjologicznych. Posiada ona napięcie przesunięcia niezbędne do regulacji i kompensacji napięć polaryzacji elektrod.
- W interfejsie oprogramowania akwizycyjnego Stylet+, przy stałej częstotliwości próbkowania 100 Hz, wpisać nazwę pliku, określić czas pomiaru i wpisać szczegóły eksperymentu (zabieg, gatunek rośliny/owada, itp.) w liniach komentarza 2 i 3.
- Opuścić owady na odpowiednią powierzchnię lądowania na roślinie i rozpocząć sesję pomiarową, klikając przycisk Start w interfejsie oprogramowania akwizycyjnego (Stylet+).
Uwaga 1: w układzie EPG można jednocześnie używać maksymalnie 8 kanałów. Można zastosować jedną lub kilka elektrod EPG na roślinę.
Uwaga 2: gdy celem badania jest zachowanie mszyc, należy rozpocząć pomiar przed dostępem mszyc do rośliny, aby nie pominąć pierwszych aktywności związanych z penetracją rośliny. - W celu badania odpowiedzi elektrofizjologicznych SE na bodźce, należy odczekać co najmniej 10 min po wejściu mszycy w fazę floemu, aby upewnić się, że mszyca znajduje się w fazie trwałego pobierania treści floemu, a linia bazowa sygnału jest stabilna. Dopiero wtedy należy rozpocząć jakikolwiek eksperyment z pobudzaniem rośliny.
Rycina 2. Wykonanie elektrod EPG z mszycami lub innymi owadami z rzędu półskrzydłych do rejestracji elektrycznego wykresu penetracji (EPG). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Panele A-I, kroki niezbędne do przygotowania elektrod EPG bez mszycy. Najpierw roztopić kawałek spoiwa na grocie lutownicy (A). Następnie zanurzyć główkę mosiężnej pinezki w kropli topnika (B) i dotknąć nią roztopionego metalu na grocie lutownicy (C). Bezpośrednio po tym kroku przyłożyć koniec miedzianego drutu do grotu lutownicy, aby przytwierdzić go do główki mosiężnej pinezki (E-F). Za pomocą skalpela lub ostrza odciąć kawałek złotego drutu (G). Zanurzyć wolny koniec miedzianego drutu (połączonego drugim końcem z mosiężną pinezką) w srebrnym kleju (H) i szybko przyłączyć do niego złoty drut (I), zanim srebro wyschnie. Złoty drut jest doskonałym przewodnikiem i może ulec polaryzacji. W rzeczywistości w większości przypadków polaryzacja jest zbyt mała, aby można ją było wykryć, a jeśli tak jest, można ją skompensować za pomocą napięcia offsetu (V).
Panele J-O, etapy niezbędne do połączenia mszycy (lub innego owada z rzędu półskrzydłych) z elektrodą. Najpierw ostrożnie podnieś mszycę za pomocą cienkiego pędzla akwarelowego i umieść ją na wlocie urządzenia do ssania próżniowego (J). Włącz pompę próżniową i zakryj otwór zaworu powietrznego kawałkiem papieru, aby wytworzyć ssanie. Zanurz końcówkę szpilki entomologicznej w srebrnym kleju (K), a następnie, korzystając ze stereomikroskopu (L-M), nanieś małą kroplę kleju na górną część odwłoka mszycy. W ciągu kolejnych ~20 s, zanim kropla srebrnego kleju na mszycy wyschnie, wprowadź koniec złotego drutu elektrody do mokrej kropli srebrnego kleju i przytrzymaj go przez 1-3 min, aż srebrny klej całkowicie wyschnie na powietrzu (N). W tym momencie wyłącz ssanie, usuwając kawałek papieru zakrywający otwór zaworu powietrznego urządzenia ssącego, i ostrożnie zdejmij mszycę z urządzenia: podniesienie mszycy po zamocowaniu elektrody często wymaga pomocy cienkiego pędzla (O).
Panel P przedstawia ogólny widok całej konfiguracji EPG wewnątrz klatki Faradaya, a panel Q przedstawia ogólny widok kombinacji roślina-mszyca do EPG. Szczegółniejsze wyjaśnienie tego procesu znajduje się w powyższej sekcji 2.
Małe litery to etykiety odnoszące się do elementów niezbędnych do wykonania elektrod EPG: a: lutownica; b: stopiony metal lutowniczy; c: topnik do lutowania; d: mosiężny pin łączący (gwóźdź); e: miedziany drut; f: złoty drut Ø 18µm; g: urządzenie ssące; h: mszyca; i: wodny klej srebrowy; j: klatka Faradaya; k: elektroda roślinna; l: złącze wejściowe (BNC) przedwzmacniacza EPG.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W poprzednim badaniu zastosowaliśmy technikę elektrod EPG w celu charakterystyki sygnałów elektrycznych generowanych w SE żyłki głównej podczas ataku gąsienic1. Żyłka główna jest preferowanym miejscem insercji konwencjonalnych elektrod szklanych, jak również elektrod ze szklanym styletem, ponieważ charakteryzuje się dużym zagęszczeniem SE i jest stosunkowo wytrzymała, co ułatwia unieruchomienie niezbędne do zastosowania tych technik. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy wszechstronność elektrod EPG w celu zebran...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół wykonywania zapisów wykresu penetracji elektrycznej (EPG). Technika EPG jest dobrze znana, ma 100-200 aktywnych użytkowników na całym świecie i została wdrożona w wielu badaniach na różne tematy, na przykład: a) odporność roślin żywicielskich na mszyce i inne owady przenoszące stylety13; b) mechanizmy przenoszenia wirusów roślinnych i patogenów14; c) sposób działania insektycydów (toksyczność i zmiany zachowania)15; d) EPG były nawet przydatne do w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
WFT uruchomił EPG Systems jako działalność emerytalną i jest z nią powiązany finansowo.
Podziękowania
VSR był wspierany przez IIF Marie Curie Grant (WOUND IN EARTH, akronim od: Sygnały elektryczne indukowane ranami u Arabidopsis thaliana).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mosiężne kołki łącznikowe | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1,2 mm | |
| Cienki drut miedziany | EPG Systems/hardw.shop | ok. Φ 0,2 mm | |
| Cienki drut złoty | EPG Systems | Φ 18 µ m | |
| Sklep | płynami lutowniczymi | pasującymi do drutu lutowniczego | |
| Drut lutowniczy z rdzeniem żywicznym | Sklep | ||
| Styropian | dowolny | ||
| Klej srebrny na bazie wody | EPG Systems | przepis w: www.epgsystems.eu | |
| Chusteczki papierowe | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Śruba lutownicza | dowolny | ||
| mikroskop stereoskopowy | Hund Wetzlar | minimalne powiększenie to 10X | |
| Małe nożyczki | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Skalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Cienkie kleszcze | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Pędzle akwarelowe | dowolny | Numer 1 lub 2 | |
| Urządzenie | patrz opis w: www.epgsystems.eu | ||
| Szpilki do owadów | dowolne | nr 1 lub 2 | |
| Solidny stół | |||
| Klatka | Ręcznie robiony | ||
| komputer | Fujitsu Siemens | ||
| Oprogramowanie do akwizycji danych | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Kompletny system | EPG Systems | ||
| zawiera: | |||
| Główna skrzynka sterownicza z wyjściem | Di155/Di710 | 12/14 bit, szybkość 100 Sondy EPG Hz (softw. fixed) | |
| 4 (8) | 50x przedwzmacniacz DC | ||
| Zaciski obrotowe na pręcie | |||
| Zasilacz | bipolarny, 230/115 VAC do -/+8 VDC | ||
| Elektrody i | |||
| Dodatkowe testowe i uziemiające |
Bibliografia
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular Recordings. Handbook of Neural Activity Measurement. Brette, R., Destexhe, A. , Cambridge University Press. 44-91 (2012).
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582(1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
