Artykuł metodologiczny

Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka

DOI:

10.3791/52826

⸱

2 lipca 2015

 , 
1Department of Plant Physiology and Biophysics, University of Würzburg, 2EPG Systems, Wageningen, The Netherlands

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykres penetracji elektrycznej (EPG) jest dobrze znaną techniką badania zachowań żywieniowych owadów noszących stylet. W tym artykule przedstawiamy nowe zastosowanie EPG jako nieinwazyjnego narzędzia do pozyskiwania wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologii elementów sitowych (SE), komórek tworzących naczynia krwionośne łyka u roślin.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości elektrofizjologiczne komórek są często badane in vitro, po oddzieleniu ich od ich rodzimego środowiska. Jednak badanie transmisji elektrycznej między odległymi komórkami w organizmie wymaga nagrań in vivo, wolnych od artefaktów komórek osadzonych w ich naturalnym środowisku. Przesyłanie sygnałów elektrycznych z uszkodzonych do niezranionych obszarów w roślinie od dawna wzbudza zainteresowanie botaników. Łyko, żywa część układu krwionośnego rośliny, która jest rozsiana po całej roślinie, została postulowana jako główna tkanka w transmisji elektrycznej u roślin. Brak odpowiednich metod elektrofizjologicznych stwarza wiele wyzwań dla badania właściwości elektrycznych komórek łyka in vivo. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie podejście do elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej elementów sitowych (SE), które wykorzystuje żywe mszyce lub inne owady żywiące się łykiem pluskwiak, zintegrowane w obwodzie wykresu penetracji elektrycznej (EPG). Wszechstronność, solidność i dokładność tej metody umożliwiły rejestrowanie i szczegółowe badanie sygnałów elektrycznych indukowanych raną w SE żył centralnych rośliny Arabidopsis thaliana1. Tutaj pokazujemy, że elektrody EPG można łatwo wdrożyć do wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologicznych SE w żyłach brzeżnych, a także do badania zdolności SE do reagowania sygnałami elektrycznymi na kilka bodźców zewnętrznych. Podejście EPG zastosowane do elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej SE może być zastosowane do wielu różnych gatunków roślin, w dużej liczbie kombinacji roślina/owad i w wielu celach badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do wytwarzania sygnałów elektrycznych na duże odległości jest korzystną cechą organizmów wielokomórkowych, która pozwala na skuteczne reakcje na bodźce zewnętrzne. Ta cecha wyewoluowała niezależnie u roślin i zwierząt, a zatem reprezentuje przypadek ewolucji zbieżnej. Biorąc pod uwagę, że sygnały elektryczne są sprzężone z ważnymi funkcjami u zwierząt, takimi jak przekaźnictwo nerwowe i skurcze mięśni, podstawy molekularne, mechanizm transmisji i funkcja sygnałów elektrycznych wywołanych bodźcem u zwierząt są przedmiotem intensywnych badań. W przeciwieństwie do tego, sygnalizacja elektryczna indukowana bodźcem w roślinach spotkała się z niewielkim zainteresowaniem badawczym. Chociaż rośliny nie mają nerwów ani mięśni, wydaje się, że istnieje wystarczająco dużo dowodów, aby założyć, że sygnały elektryczne wywołane bodźcem u roślin odgrywają kluczową rolę w ich reakcjach na czynniki środowiskowe.

Łyko, żywy składnik układu krwionośnego rośliny, zostało postulowane jako główny substrat do transmisji sygnałów elektrycznych wywołanych bodźcem, z obszarów stymulowanych/uszkodzonych do niestymulowanych/nieuszkodzonych2. Głównymi komórkami w łyku są elementy sita (SE), stosunkowo proste, wydłużone komórki. Końce SE są połączone z innymi SE, tworząc ciągły system rur sitowych o niskim oporze, który jest rozprowadzany po całej instalacji. Istnieje jednak bardzo niewiele badań nad właściwościami elektrycznymi tych wysoce wyspecjalizowanych komórek. W tych poprzednich badaniach naukowcy uzyskali dostęp do SE za pomocą szklanych mikroelektrod3 lub szklanych elektrod, które były sprzężone z wprowadzonymi do roślin styletami mszyc, po stylektomii (cięciu)4. Mikroelektrody szklane są wykonane ze szklanych kapilarek, które są wciągane z jednej strony pod wpływem ciepła do cienkiej końcówki o średnicy mniejszej niż 1 μm, a następnie napełniane roztworem KCl. Drut Ag / AgCl lub platynowy, włożony do szklanej elektrody wypełnionej KCl, jest następnie podłączany do wejścia wzmacniacza, a elektroda referentna jest wkładana do kąpieli otaczającej interesujące ogniwo, kończąc obwód. Ten układ rejestruje różnicę potencjału między zewnątrzkomórkową elektrodą referencyjną a wewnątrzkomórkową elektrodą pomiarową, tj. potencjałem błonowym komórki5. Dzięki tej metodzie Umrath dokonał pierwszego wewnątrzkomórkowego zapisu z komórki roślinnej, używając alg Nitella6,7. Nitella jest stosunkowo prostym organizmem z dużymi komórkami, a zatem podatnym na wewnątrzkomórkowe eksperymenty elektrofizjologiczne. W przeciwieństwie do tego, wprowadzenie wewnątrzkomórkowych elektrod szklanych do małych komórek wielokomórkowych, trójwymiarowych roślin naziemnych jest technicznie wymagające, wymaga wysoko wykwalifikowanego badacza, a także wyrafinowanego sprzętu do wizualizacji, mikromanipulacji i wibracji. Chociaż szklane elektrody nadają się do rejestrowania z powierzchownych komórek roślin, takich jak komórki naskórka korzenia8, wewnątrzkomórkowe zapisy z komórek głęboko osadzonych w tkance rośliny, takich jak SE, z dużym prawdopodobieństwem powodują reakcje wywołane uszkodzeniem, myląc wyniki. W 1989 roku Fromm i Eschrich poinformowali o zastosowaniu alternatywnej metody, zwanej "metodą mszyc", w której szklane elektrody są sprzężone z mszycami po stylektomii4. Metoda na mszyce jest mało inwazyjna, ponieważ elastyczne stylety nie powodują uszkodzeń tkanek ani komórek, tak jak robią to szklane elektrody. Styliaki mszyc są wielkim wynalazkiem natury w zakresie penetracji roślin, a mszyce są znacznie bardziej wykwalifikowane niż ludzie w znajdowaniu SE. Niestety, ta metoda na mszyce jest również bardzo wymagająca pod względem wiedzy technicznej i sprzętu. Ponadto powodzenie każdego eksperymentu, w którym stosuje się tę technikę, zależy całkowicie od tego, czy mszyce są w trybie żerowania - z stabilnie włożonym sztyftem do SE w momencie stylektomii. Patrząc wstecz, można zauważyć, że szanse na powodzenie tej techniki można było zwiększyć, dodając do zestawu eksperymentalnego instrument, który pozwala określić, czy sztyft mszyc znajduje się w SE podczas stosowania stylektomii.

W 1964 roku McLean i Kinsey opisali 'elektroniczny system monitorowania' do badania zachowań żywieniowych mszyc w czasie rzeczywistym9,10. W tym systemie mszyca i roślina penetrowana przez sztyft zostały zintegrowane w obwodzie elektrycznym. Później, w 1978 roku, Tjallingii opracował zmodyfikowaną wersję systemu, nazwaną systemem "Wykresu Penetracji Elektrycznej" (EPG)11,12. Podczas gdy pierwotny elektroniczny system monitorowania był czuły tylko na potencjały powodowane przez rezystancję, w przypadku systemu EPG oprócz potencjałów wynikających z oporu (R) u owada można było rejestrować potencjały pochodzące z siły elektromotorycznej (emf), tj. generowane w roślinie lub owadzie. Stanowi to istotną poprawę, ponieważ oba składowe sygnału, emf i R, dostarczają biologicznie istotnych informacji na temat zdarzeń podczas penetracji roślin przez mszyce. To, co sprawia, że przedwzmacniacz EPG jest wrażliwy na komponenty R, to jego stosunkowo niska rezystancja wejściowa wynosząca 1 GΩ, która jest bliska średniej rezystancji rośliny/mszycy. Do instalacji doprowadzane jest niewielkie napięcie niezrównoważenia (rysunek 1, V) wynoszące około +100 mV, które następnie jest dzielone na roślinę i owada z jednej strony, a rezystancję wejściową z drugiej. Napięcia i ich zmiany są mierzone w punkcie (rys. 1A,B) między owadem a rezystorem wejściowym. W związku z tym składowe R reprezentują modulacje napięcia niezrównoważenia mszyc roślinnych, podczas gdy składowe emf stanowią pewną część potencjałów roślinnych na końcu trzpienia i potencjałów powstających u owada. Potencjały roślinne – tutaj najistotniejsze – to głównie potencjały błonowe komórek roślinnych nakłutych przez sztylety mszyc. Potencjały owadów wydają się być głównie potencjałami strumieniowymi spowodowanymi ruchami płynu w dwóch kanałach trzpieniowych, tj. Kanałach pokarmowych i ślinowych; w EPG nie rejestruje się żadnych wewnętrznych potencjałów nerwowych ani mięśniowych. W praktyce końcówka trzpienia funkcjonuje jako końcówka elektrody. Wszystkie komórki roślinne są naładowane ujemnie wewnątrz w stosunku do dodatniego na zewnątrz komórki. Prąd elektryczny (tj. ruch naładowanych jonów w roztworze wodnym) płynący z wnętrza na zewnątrz i odwrotnie jest bardzo ograniczony ze względu na wysoką rezystancję błony komórkowej. Zwykle potencjał spoczynkowy jest utrzymywany na stałym poziomie. Jednak gdy jony ujemne wydostają się na zewnątrz lub jony dodatnie przemieszczają się przez błonę komórkową, potencjał błonowy ulega zmniejszeniu, tj. "depolaryzuje". Depolaryzacja zachodzi w przypadku wzbudzenia komórki. Jony następnie przemieszczają się do środka lub na zewnątrz, gdy określone kanały jonowe w membranie są otwarte lub gdy membrana jest uszkodzona, a jony wyciekają i wydostają się. Wszystkie komórki mają kanały jonowe i pompy w błonie plazmatycznej, które doprowadzają potencjał błonowy do poziomu spoczynkowego poprzez przywrócenie pierwotnego stężenia różnych jonów wewnątrz komórki. Potencjał spoczynkowy i jego zmiany są składowymi pola elektromagnetycznego, dlatego technika EPG nadaje się do ich pomiaru.

figure-introduction-1
Rysunek 1. Elektrody EPG. Elektroda EPG to żywa mszyca zintegrowana z obwodem wykresu penetracji elektrycznej (EPG), której trzpień jest wprowadzany do elementu sitowego (SE) w stabilnym trybie podawania. Jeśli nabijany na sztyft SE jest w spoczynku (panel A), napięcie w obwodzie, zarejestrowane przez EPG, jest stabilne i znajduje się na poziomie potencjału spoczynkowego (panel C, spoczynek). Jeśli SE jest wzbudzony, jego membrana ulega depolaryzacji (panel B), co jest wizualizowane w EPG jako stopniowy wzrost napięcia (panel C, Depolaryzacja). Gdy równowaga jonowa w SE wraca do stanu spoczynku, czyli ulega repolaryzacji, napięcie rejestrowane przez EPG stopniowo spada do poziomu potencjału spoczynkowego (Panel C, Repolaryzacja). W panelu C, "A" i "B" odnoszą się do scenariuszy pokazanych odpowiednio w panelach A i B. V = Regulowane źródło napięcia niezrównoważonego. Ri = Rezystor wejściowy. Równolegle do rezystora zewnętrznego 1 GΩ wzmacniacz posiada wewnętrzny (w wzmacniaczu operacyjnym) rezystor o wysokiej wartości 1,5 TΩ (panele A i B, w kolorze szarym). Za pomocą zdalnego sterowania przełącznikiem przedwzmacniacz EPG można zmienić z trybu normalnego na tryb emf, co pozwala na uzyskanie bardzo dokładnych wartości napięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W następnej sekcji udostępniamy czytelnikowi podstawowy protokół przeprowadzania eksperymentów EPG, który jest ważny zarówno dla badań skoncentrowanych na owadach, jak i na roślinach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla mszyc

Uwaga: Wybór gatunków roślin i mszyc do zapisów EPG zależy od celu badań. Do badań nad Arabidopsis thaliana odpowiednia jest mszyca Brevicoryne brassicae.

  1. Tylne mszyce B. brassicae w szklarni na Brassica oleracea. Rośliny używane do hodowli mszyc należy przechowywać w klatkach, aby uniknąć zanieczyszczenia innych roślin. Rośliny do hodowli mszyc i rośliny doświadczalne (w naszym przypadku B. oleracea i A. thaliana) należy przechowywać w oddzielnych pomieszczeniach, aby uniknąć zanieczyszczenia roślin doświadczalnych mszycami.
  2. Przenoś mszyce na świeże rośliny mniej więcej co 2 tygodnie, zanim spowodują znaczne uszkodzenia roślin lub osiągną przeludnienie. Przenieś 10-20 dorosłych mszyc do świeżej rośliny hodowlanej, aby zainicjować nową kolonię.
  3. Regularnie monitoruj rośliny hodowlane pod kątem zanieczyszczenia niechcianymi gatunkami mszyc, innymi owadami roślinożernymi, parazytoidami mszyc i grzybami, które mogą wpływać na zdrowie kolonii mszyc.
  4. Zbieraj dorosłe, bezskrzydłe mszyce do tygodnia po ich ostatnim linieniu w celu nagrania EPG.
  5. Po eksperymentach zwróć rośliny doświadczalne, które nie były używane, do komory wzrostu, ponieważ często mają one potomstwo, które zostało wyprodukowane podczas nagrywania, co może nieumyślnie zanieczyścić inne rośliny.

2. Okablowanie owadów do nagrywania EPG

  1. Do wykonania elektrod przeciw owadom należy zaopatrzyć się w mosiężne kołki łączące (gwoździe, Ø 1,2 mm), cienki drut miedziany (Ø 0,2 mm), bardzo cienki drut złoty (Ø ok. 20 μm), klej srebrny na bazie wody, prosty mały kołek lutowniczy z płynem lutowniczym i drutem lutowniczym z rdzeniem żywicznym, mikroskop stereoskopowy z 10-krotnym powiększeniem, małe nożyczki lub skalpel, dwa cienkie kleszczyki oraz arkusz lub pudełko styropianowe. Uwaga: Przydatny może być mikser wirowy. Uwaga: Protokół krok po kroku dotyczący wykonywania elektrod przedstawiono na rysunku 2.
  2. Do zwalczania mszyc i nakładania kleju zaopatrz się: w mały i miękki pędzel do akwareli z włosia wielbłąda (rozmiar 2 lub mniejszy) oraz szpilki do owadów, takie jak te używane do zbierania owadów, chociaż może również działać cienka igła do szycia lub wykałaczka. Krok 4 pokazuje, jak rozpocząć nagrywanie EPG.
  3. Krok 1.
    Uwaga: Kroki 1 i 2 poniżej pokazują, jak przygotować elektrody przeciw owadom bez mszycy. Krok 3 pokazuje, jak podłączyć mszycę do elektrody. Mocowanie próżniowe mszycy jest zalecane podczas okablowania, ale nie zawsze jest wymagane w przypadku gatunków wolno poruszających się (np. B. brassicae).
    1. Włącz lutowniczą i stopij trochę drutu lutowniczego na jej końcówce (Rysunek 2A). Zwilż mosiężnego styku złącza odrobiną płynu lutowniczego (Rysunek 2B) i zanurz go w stopionym lutownicy (Rysunek 2C).
    2. Nałóż osłonę ze stopionego lutu na jeden koniec kawałka cienkiego drutu miedzianego o długości 1-2 cm (rysunek 2D). Następnie przyłóż kołek i drut miedziany do gorącej (Rysunek 2E) i odsuń je razem, aby ostygły i zestaliły się (Rysunek 2F).
  4. Krok 2.
    1. Dokładnie wstrząsnąć (lub wirować) fiolkę ze srebrnym klejem przez kilka minut, aż do uzyskania gładkiej emulsji. Wytnij (nożyczkami lub skalpelem) kilka kawałków złotego drutu (o długości około 1,5 cm) na płytce przedmiotowej mikroskopu stereoskopowego (rysunek 2G).
    2. Weź mosiężny kołek z przylutowanym drutem miedzianym (wykonany w sekcji 2.3) i zanurz wolny koniec drutu miedzianego w małym srebrnym zbiorniku na klej, który po otwarciu zgromadzi się wewnątrz wieczka fiolki (Rysunek 2H). Uwaga: Potrzebna jest tylko mała kropla.
    3. Przesuń zanurzony w kleju koniec drutu miedzianego na kawałek złotego drutu, jednocześnie podnosząc jeden koniec, aby uniknąć rozmazywania kleju na płytce obiektu mikroskopu stereoskopowego. Spróbuj nałożyć na siebie drut miedziany i złoty na kilka mm (Rysunek 2I), rozprowadzając klej wzdłuż zakładki dwóch drutów.
    4. Poczekaj, aż klej wyschnie na tyle, aby druty były razem. Sprawdź kontakt kleju po wyschnięciu i dodaj trochę świeżego kleju za pomocą małego szpilki lub innego kawałka drutu miedzianego, jeśli niektóre części połączonych drutów pokazują części bezklejowe.
    5. Gdy elektroda owadzi jest gotowa, przechowuj ją, na przykład włożoną do kawałka styropianu.
      Uwaga: Długość złotego drutu określi swobodę ruchu mszycy: jeśli jest zbyt krótka (mniej niż 5 mm), mszyca może czuć się ograniczona i nie będzie zachowywać się normalnie; Jeśli jest zbyt długa (>2 cm), mszyca będzie się swobodnie poruszać. Mszyce mają tendencję do przenoszenia się na przyosiową stronę liści, jeśli im się na to pozwoli. Jeśli złoty drut dotknie liścia, sygnał zostanie zwarty.
  5. Krok 3.
    1. Mszyca może być utrzymywana na miejscu za pomocą odsysania światła, przy użyciu próżni; w takim przypadku należy zainstalować urządzenie ssące pod mikroskopem stereoskopowym. Umieść otwór ssący na środku pola.
    2. Dokładnie wstrząsać fiolką ze srebrnym klejem przez kilka minut (lub wirować), aż powstanie gładka emulsja. Zbierz mszycę za pomocą małego pędzla.
    3. Włącz urządzenie ssące i zamontuj mszycę na otworze ssącym (Rysunek 2J), z tyłem brzucha zwróconym do eksperymentatora. Drobną szczoteczką usuń wosk powierzchniowy z brzucha (obfity w mszyce kapuściane).
    4. Otwórz fiolkę z klejem i zwilż szpilkę bardzo małą kroplą srebrnego kleju (Rysunek 2K). Nałóż kroplę srebrnego kleju na tylną część brzucha mszycy (ryc. 2L-M). Pozostaw tę kroplę do całkowitego wyschnięcia przez kilka minut, energicznie potrząśnij ponownie fiolką z klejem i dodaj drugą kroplę srebrnego kleju na pierwszą. Uwaga: Chociaż srebrny klej jest przewodnikiem elektrycznym, nie powoduje znacznych uszkodzeń naskórka owada.
    5. Po zamknięciu fiolki z klejem włóż wolny koniec złotego drutu do mokrej kropli i utrzymuj drut nieruchomo, pozwalając klejowi całkowicie wyschnąć (Rysunek 2N). Unikaj rozmazywania kleju na nogach lub czułkach i wyrzuć mszycę, jeśli tak się stało.
    6. Wyłącz urządzenie mocujące ssanie i ostrożnie podnieś owada (Rysunek 2O). W razie potrzeby użyj cienkiej szczotki, aby pomóc w podnoszeniu mszycy z urządzenia ssącego.
      Uwaga: Okablowanie B. brassicae nie wymaga próżni, ponieważ można je podłączyć do kawałka precyzyjnej tkanki laboratoryjnej, której szorstka powierzchnia zapewnia mszycy wystarczającą przyczepność, aby nie została podniesiona po nałożeniu kropli mokrego kleju na jej brzuch. Po wyschnięciu kleju można usunąć mszycę z tkanki za pomocą cienkiej szczotki.
    7. Włóż mosiężny kołek z przewodowym owadem do styropianu i w razie potrzeby kontynuuj okablowanie wszystkich innych owadów, które mają być używane podczas sesji nagraniowej EPG.
      Uwaga: Te protokoły okablowania mszyc działają dla nas dobrze. Użytkownik może znaleźć własną metodę okablowania mszyc.
  6. Krok 4.
    1. Umieść rośliny w klatce Faradaya (Rysunek 2P) na nieprzewodzącym podłożu: użyj szalek Petriego lub szklanego lub plastikowego talerza.
    2. Włóż elektrodę roślinną do gleby każdej doniczki. Włóż mosiężny styk przewodowego owada do złącza wejściowego przedwzmacniacza EPGAMPLIFIER (Rysunek 2Q). Uwaga: elektroda gruntowa nie odpowiada elektrodzie uziemiającej stosowanej w innych technikach elektrofizjologicznych. Posiada napięcie niezrównoważenia potrzebne do regulacji i kompensacji napięć polaryzacji elektrod.
    3. W interfejsie oprogramowania do akwizycji Stylet+, ze stałą częstotliwością próbkowania 100 Hz, wprowadź nazwę pliku, określ czas nagrywania i wpisz tekst, aby określić szczegóły eksperymentu (zabieg, gatunki roślin/owadów itp.) w wierszach komentarza 2 i 3.
    4. Opuść owady na odpowiednie miejsce lądowania rośliny i rozpocznij sesję nagrywania, klikając przycisk Start w interfejsie oprogramowania akwizycyjnego (Stylet+).
      Uwaga 1: w konfiguracji EPG można używać jednocześnie maksymalnie 8 kanałów. Można użyć jednej elektrody EPG lub kilku elektrod EPG na instalację.
      Uwaga 2: gdy badanie koncentruje się na zachowaniu mszyc, rozpocznij rejestrację przed dostępem mszyc przez rośliny, aby uniknąć pominięcia pierwszych czynności penetracji roślin.
    5. W celu zbadania elektrofizjologicznych reakcji SE na bodźce, należy odczekać co najmniej 10 minut po wejściu mszycy w fazę łyka, aby upewnić się, że mszyca znajduje się w długotrwałej fazie spożycia łyka i że linia podstawowa sygnału jest stabilna. Dopiero wtedy rozpocznij dowolny eksperyment ze stymulacją roślin.

figure-protocol-1
Rysunek 2. Wykonywanie elektrod EPG z mszycami lub innymi owadami pluskwiakowymido zapisów wykresu penetracji elektrycznej (EPG). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Panele A-I, kroki wymagane do przygotowania elektrod EPG bez mszycy. Najpierw rozpuść kawałek lutownicy na końcówce lutowniczej (A). Następnie zanurz główkę mosiężnego kołka w kropli płynu lutowniczego (B) i zetknij ją ze stopionym metalem na końcówce lutowniczej (C). Natychmiast po tym kroku należy przyłożyć koniec drutu miedzianego do końcówki lutowniczej, aby przykleić go do łba mosiężnego kołka (E-F). Skalpelem lub ostrzem odetnij kawałek złotego drutu (G). Zanurz wolny koniec drutu miedzianego (połączonego na drugim końcu z mosiężnym kołkiem) na srebrnym kleju (H) i szybko połącz z nim złoty drut (I) zanim srebro wyschnie. Złoty drut jest doskonałym przewodnikiem i może być spolaryzowany. W rzeczywistości w większości przypadków polaryzacja jest zbyt mała, aby można ją było wykryć, a jeśli tak, to można ją skompensować napięciem niezrównoważenia (V).

Panele J-O, kroki potrzebne do podłączenia mszycy (lub innego owada z pluskwią) do elektrody. Najpierw ostrożnie podnieś mszycę za pomocą cienkiego pędzla akwarelowego i umieść ją na otworze odsysającego odkurzacza (J). Włącz pompę próżniową i zakryj otwór zaworu powietrza kawałkiem papieru, aby zastosować ssanie. Zanurz końcówkę szpilki owada w srebrnym kleju (K) i umieść małą kropelkę kleju na brzuchu mszycy, pod mikroskopem stereoskopowym (L-M). W ciągu następnych ~20 sekund, zanim kropla srebrnego kleju na mszycy wyschnie, włóż koniec złotego drutu elektrody owada do mokrej kropli srebrnego kleju i trzymaj go na miejscu przez 1-3 minuty, aż srebrny klej całkowicie wyschnie na powietrzu (N). W tym momencie wyłącz ssanie, usuwając kawałek papieru, który zakrywa otwór zaworu powietrza urządzenia ssącego i ostrożnie usuń mszycę z urządzenia ssącego: podnoszenie mszycy po okablowaniu często wymaga pomocy drobnej szczotki (O).

Panel P pokazuje przegląd całego zestawu EPG w klatce Faradaya, a Panel Q pokazuje przegląd kombinacji roślina i mszyca dla EPG. Patrz sekcja 2 powyżej, aby uzyskać bardziej szczegółowe wyjaśnienie tego procesu.

Małe litery to etykiety odnoszące się do elementów potrzebnych do wykonania elektrod EPG: a: śruba lutownicza; B: stopiony metal lutowniczy; C: płyn lutowniczy; D: Mosiężny kołek łącznika (gwóźdź); E: drut miedziany; f: Ø 18μm złoty drut; g: urządzenie ssące; h: mszyca; I: Klej do srebra na bazie wody; j: Klatka Faradaya; K: Elektroda roślinna; l: złącze wejściowe (BNC) przedwzmacniacza EPG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W poprzednim badaniu, zaimplementowaliśmy technikę elektrody EPG w celu scharakteryzowania sygnałów elektrycznych wytwarzanych w SE żyły środkowej podczas ataku gąsienicy1. Żyła środkowa jest preferowanym miejscem wprowadzania dla konwencjonalnych elektrod szklanych, a także dla elektrod szklanych, ponieważ jest gęsta SE i stosunkowo wytrzymała, a zatem podatna na utrwalenie potrzebne do wdrożenia tych technik. W tym przypadku wykorzystaliśmy wszechstronność elektrody EPG w celu zebrania informacji elektrofizj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół wykonywania zapisów wykresu penetracji elektrycznej (EPG). Technika EPG jest dobrze znana, ma 100-200 aktywnych użytkowników na całym świecie i została wdrożona w wielu badaniach na różne tematy, na przykład: a) odporność roślin żywicielskich na mszyce i inne owady przenoszące stylety13; b) mechanizmy przenoszenia wirusów roślinnych i patogenów14; c) sposób działania insektycydów (toksyczność i zmiany zachowania)15; d) EPG były nawet przydatne do w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WFT uruchomił EPG Systems jako działalność emerytalną i jest z nią powiązany finansowo.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VSR był wspierany przez IIF Marie Curie Grant (WOUND IN EARTH, akronim od: Sygnały elektryczne indukowane ranami u Arabidopsis thaliana).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mosiężne kołki łącznikoweEPG Systems/hardw.shopΦ 1,2 mm
Cienki drut miedzianyEPG Systems/hardw.shopok. Φ 0,2 mm
Cienki drut złotyEPG SystemsΦ 18 µ m
Skleppłynami lutowniczymipasującymi do drutu lutowniczego
Drut lutowniczy z rdzeniem żywicznymSklep
Styropiandowolny
Klej srebrny na bazie wodyEPG Systemsprzepis w: www.epgsystems.eu
Chusteczki papieroweKimberly-Clark5511
Śruba lutowniczadowolny
mikroskop stereoskopowyHund Wetzlarminimalne powiększenie to 10X
Małe nożyczkiFine Science Tools14088-10
SkalpelFine Science Tools10050-00
Cienkie kleszczeFine Science Tools11231-20
VortexA. HartensteinL46
Pędzle akwarelowedowolnyNumer 1 lub 2
Urządzeniepatrz opis w: www.epgsystems.eu
Szpilki do owadówdowolnenr 1 lub 2
Solidny stół
KlatkaRęcznie robiony
komputerFujitsu Siemens
Oprogramowanie do akwizycji danychEPG SystemsStylet+d
Giga-4 (-8) Kompletny systemEPG Systems
zawiera:
Główna skrzynka sterownicza z wyjściemDi155/Di71012/14 bit, szybkość 100  Sondy EPG Hz (softw. fixed)
4 (8)50x przedwzmacniacz DC
Zaciski obrotowe na pręcie
Zasilaczbipolarny, 230/115 VAC do -/+8 VDC
Elektrody i
Dodatkowe testowe i uziemiające 
zz narzędziami do zasysania powietrza Faradaya USB prądu stałego zakładowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
  2. Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
  3. Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
  4. Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
  5. Brette, R., Destexhe, A. Intracellular Recordings. Handbook of Neural Activity Measurement. Brette, R., Destexhe, A. , Cambridge University Press. 44-91 (2012).
  6. Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
  7. Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
  8. Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
  9. Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582(1964).
  10. McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
  11. Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
  12. Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
  13. Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
  14. Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
  15. Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
  16. Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Elektrofizjologia ykaerowanie mszycrejestracje wewn trzkom rkoweuszkadzanie ro linprzesy anie sygna w elektrycznychArabidopsis thalianamonta obwodu EPGstymulacja element w sitowych

Powiązane artykuły