Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

18.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52830

⸱

5 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School for Mental Health and Neuroscience, Maastricht University, 2Department of Neurosciences, Institut d'Investigació Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Synteza ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest pierwszym krokiem w badaniach mających na celu rozwikłanie patofizjologicznych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem autoprzeciwciał. Opracowaliśmy protokół wytwarzania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) z komórek B posortowanych krwią, w tym izolację komórek B, klonowanie przeciwciał i syntezę in vitro.

Streszczenie

Znalezienie nowych metod generowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych to aktywna dziedzina badań, która jest ważna zarówno dla nauk podstawowych, jak i stosowanych, w tym dla rozwoju immunoterapeutyków. Jednak techniki identyfikacji i wytwarzania takich przeciwciał są zwykle żmudne, a czasami para łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciał ulega dysocjacji. Tutaj opisujemy stosunkowo prosty, nieskomplikowany protokół wytwarzania ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu unieśmiertelnienia wirusem Epsteina-Barr (EBV) i aktywacji receptora Toll-podobnego 9. Przy odpowiednim barwieniu limfocyty B wytwarzające przeciwciała mogą być izolowane w celu późniejszego unieśmiertelnienia i ekspansji klonalnej. Transkrypty przeciwciał wytwarzane przez unieśmiertelnione klony komórek B mogą być amplifikowane metodą PCR, sekwencjonowane jako odpowiadające im pary łańcuchów ciężkich i lekkich i klonowane do wektorów ekspresyjnych immunoglobulin. Przeciwciała uzyskane za pomocą tej techniki mogą być potężnymi narzędziami do badania odpowiednich ludzkich odpowiedzi immunologicznych, w tym autoimmunizacji, i stworzyć podstawę dla nowych terapii.

Wprowadzenie

Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie metodologii generowania i charakteryzowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG uzyskanych z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).

Zainteresowanie badaniem ludzkich przeciwciał wzrosło w wielu różnych dziedzinach badań. W szczególności wiele grup badawczych interesuje się patologią wywoływaną przez autoprzeciwciała1-3. Sklonowaliśmy i scharakteryzowaliśmy autoprzeciwciała chorobotwórcze1. Badanie autoprzeciwciał może pomóc w identyfikacji ich celów i opracowaniu strategii terapeutycznych, np. z wykorzystaniem przeciwciał konkurencyjnych4. Co więcej, badanie ludzkich przeciwciał może być również interesujące w innych dziedzinach badań, tj. w celu oceny odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu5, scharakteryzowania profilu przeciwciał osób, które były narażone i stały się odporne na określone patogeny6 lub w celu zbadania, które przeciwciała znajdują się w naturalnym repertuarze7,12.

Kilka technik zostało opracowanych do generowania rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych8-12; większość z nich wykorzystuje wyświetlanie fagów i unieśmiertelnianie komórek B. Wykorzystanie wyświetlania fagów jest szeroko stosowane do odkrywania nowych przeciwciał13. Ma jednak poważną wadę, a mianowicie, że pary łańcuchów ciężkich i lekkich ludzkiej immunoglobuliny ulegają dysocjacji w tym procesie. Produkcja hybrydomy z ludzkimi komórkami B lub transformacja EBV przezwycięża tę wadę.

Używamy zakażenia limfocytów B grasicy EBV w połączeniu ze stymulacją poliklonalnych komórek B za pomocą receptora Toll-like 9 (TLR-9)6,12.

W tym artykule szczegółowo opisujemy technologię, której używamy do rozwoju ludzkich przeciwciał IgG, z pełnym przeglądem wszystkich etapów od izolacji PBMC do wytworzenia przeciwciał in vitro. Protokół ten może być stosowany do analizy dowolnego rodzaju profilu IgG u ludzi. W naszym laboratorium limfocyty B wytwarzające przeciwciała IgG zostały pomyślnie oddzielone od reszty PBMC po sortowaniu. Pięćdziesiąt posortowanych limfocytów B8 można następnie posiać na płytkach wielodołkowych i unieśmiertelnić przez aktywację EBV i TLR-9 w celu klonalnej ekspansji pojedynczych komórek B. Jako komórki żywicielskie wykorzystano fibroblasty z ludzkiej embrionalnej tkanki płucnej, linii komórkowej wi38, która ułatwia wizualizację unieśmiertelnionych limfocytów B. Z tych limfocytów B sekwencje ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobuliny można uzyskać metodą PCR, a geny przeciwciał sklonować w wektorach ekspresyjnych immunoglobuliny G i wytworzyć in vitro. Za pomocą tej techniki można badać pojedyncze przeciwciała z dokładnie taką samą sekwencją przeciwciał, jaka znajduje się u dawcy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano świadomą zgodę od uczestników badania. Badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną.

1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)

  1. Odwirować 25 ml heparynizowanej krwi uczestników w stężeniu 900 x g przez 15 minut, tak szybko, jak to możliwe po ekstrakcji krwi. Jeśli krwi jest mniej, odpowiednio zmniejsz ilość odczynników. Wykonaj wszystkie następne kroki w okapie.
  2. Przenieś serum do czystej tubki. Może być stosowany w późniejszych etapach do zamrażania PBMC lub w przypadku pacjentów autoimmunologicznych do testowania autoprzeciwciał.
  3. Rozcieńczyć krew 10 ml pożywki RPMI 1640 i ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę iw dół.
  4. Dodać 15 ml roztworu zawierającego polisacharozę i ditrizoinian sodu (1,077 g/ml) do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Delikatnie nałożyć krew na wierzch roztworu w kroku 1.4, zbliżając do siebie dwa otwory probówek, aż oba płyny zetkną się bardzo powoli, a następnie powoli zdekantować zawiesinę PBMC na wierzch probówki o pojemności 50 ml. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla dobrego oddzielenia PBMC.
  6. Odwirować probówkę otrzymaną w kroku 1.5 przy 400 x g bez hamulca w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  7. Po odwirowaniu odzyskać pipetą biały pierścień, który pojawia się w środkowej części probówki, która zawiera PBMC.
  8. Umyj komórki 25 ml pożywki RPMI 1640.
  9. Wirować 300 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  10. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 10 ml RPMI 1640. Ponownie odwirować jak w kroku 1.9.
  11. Policz PBMC z komorą Neubauera, jak wcześniej podawano14.
  12. Przetworzyć PBMC jak w sekcji 2 lub przechowywać je do późniejszego wykorzystania w następujący sposób: 10 milionów PBMC do zamrożenia na probówkę kriowialną rozcieńczoną w 1 ml 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 90% surowicy otrzymanej w kroku 1.2. Zamrażać stopniowo i do długiego przechowywania w ciekłym azocie.

2. Barwienie PBMC do sortowania CD22+ i IgG+ według cytometrii komórkowej

  1. Umieścić PBMC w kolbie do hodowli komórkowej o średnicy 25 cm z 6 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 (uzupełnionej L-glutaminą, 10 mM buforem HEPES, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej) i pozwolić im odzyskać O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  2. Zatkać sterylne probówki FACS sterylnym 4% roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem albuminy (PBS) O/N. Umyć probówki dwukrotnie PBS i napełnić je 500 μl kompletnego podłoża RPMI 1640. Użyj tych probówek do odzyskania komórek po sortowaniu.
  3. Zebrać PBMC do probówki i odwirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Ponownie zawieś komórki w buforze etykietowania (patrz kroki 2.5 i 2.6) i policz je14. Bufor znakujący to sterylna 2% płodowa surowica bydlęca i 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w PBS.
  5. Przygotować 3 probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) po 10 5 komórek każda i ponownie zawiesić je w 100 μl buforu do znakowania. Rurki te posłużą do zdefiniowania bramek sortowania.
    1. Do pierwszej probówki dodać 5 μl przeciwciała anty CD22 PerCP (zalecane w karcie katalogowej producenta), do drugiej probówki 20 μl przeciwciała anty IgG PE (zalecane w karcie katalogowej producenta), a do trzeciej probówki nie wrzucać nic. Inkubować na lodzie i w ciemności przez 30 minut.
  6. Ponownie zawiesić 5 milionów komórek w 200 μl buforu znakującego w probówce FACS i dodać 10 μl anty CD22 PerCP i 40 μl anty IgG PE. Inkubować komórki na lodzie i ciemności przez 30 minut. Jeśli pożądane jest sortowanie większej liczby komórek, należy zwiększyć skalę wszystkich odczynników.
  7. Odwirować komórki przy 400 x g z niskim hamulcem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Delikatnie zdekantować supernatant.
  9. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu do znakowania. Odwirować komory przy 400 x g z niskim hamowaniem przez 5 minut przy wilgotności względnej. Powtórzyć kroki 2.7 i 2.8
  10. Delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 μl kompletnej pożywki RPMI.
  11. Przepuść komórki przez filtr 0,45 μm. Komórki są gotowe do sortowania.

3. Sortowanie komórek B CD22+ i IgG+

  1. Użyj 3 probówek kontrolnych, aby ustalić żywotność komórek. W kontrolce bez barwienia użyj wykresu punktowego do przodu i rozmiaru, aby zdefiniować bramkowanie limfocytów. Elementy sterujące z CD22 PerCP i anty-IgG PE służą do ustawiania bramek i bramki sortującej. Wykonaj następujące wcześniej zgłoszone dane15.
    Uwaga: Bramka to zestaw limitów wartości (granic), które służą do odizolowania określonej grupy zdarzeń cytometrycznych, w naszym przypadku komórek, z dużego zbioru. W przypadku bramki sortującej wartości graniczne pozwalają na odtworzenie zdarzeń cytometrycznych, komórek, które znajdują się wewnątrz zdefiniowanych granic: CD22+ i IgG+.
  2. Jako probówkę zbiorczą do sortowania należy użyć zablokowanych probówek z 500 μl kompletnego podłoża RPMI 1640, uzyskanego w kroku 2.2.
  3. Przejdź do sortowania podwójnie dodatniego15: CD22+ IgG+. Zanotuj ostateczną liczbę komórek w każdym warunku. Posortuj komórki na wierzchu komórek podajnika tak szybko, jak to możliwe.

4. Napromienianie komórek zasilających

Uwaga: Przygotuj komórki zasilające między 1 - 3 dniami przed sortowaniem. Potrzeba co najmniej 5,000 komórek wi38 na studzienkę w 96-dołkowej płytce okrągłej. Wykonaj kroki 4.1, 4.2 i 4.4 w okapie.

  1. Hodować komórki wi38 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w kompletnym pożywce RPMI 1640 (tak samo jak w przypadku PBMC), aż do osiągnięcia pożądanej liczby komórek.
  2. Napromieniuj je na 50 Grayów, postępując zgodnie z protokołem opisanym wcześniej16 . Przeprowadzić napromienianie, gdy komórki wi38 zostaną wytrypsynizowane i ponownie zawieszone w kompletnym pożywce RPMI, lub z wi38 dołączonym do kolby hodowlanej i trypsynizowanym po napromieniowaniu. Postępuj zgodnie z metodą trypsynizacji wskazaną przez dostawcę komórek wi38. Napromienić liczbę komórek niezbędną do pokrycia studzienek potrzebnych do posiewu komórek B IgG+ (1% całkowitego PBMC obliczonego w kroku 1.11).
  3. Płytka 90 μl zawierająca 5 000 napromieniowanych komórek wi38 w każdym dołku 96 okrągłych płytek dołkowych. Pozostaw studzienki w zewnętrznym rzędzie płytki puste (ponieważ szybciej odparowują) i używaj tylko 60 dołków na środku płytki do posiewania komórek. Napełnij zewnętrzne studzienki, które otaczają płytkę, 200 μl PBS.
  4. Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 do momentu, gdy będą potrzebne.

5. Poszycie posortowanych PBMC, infekcja EBV i wzrost

  1. Rozcieńczyć posortowane PBMC, aby pokryć 50 komórek w 50 μl kompletnego podłoża RPMI 1640 na studzienkę na basenie na 96 okrągłych płytek dołkowych (uprzednio posianych napromienionymi komórkami wi38). Czynności wykonywane w kapturze przystosowanym do pracy z EBV.
    Uwaga: zakażenie 50 komórek na studzienkę jest zoptymalizowane i zwiększa prawdopodobieństwo wytworzenia przeciwciała monoklonalnego8, jednak zaleca się sprawdzenie tego za pomocą PCR, jak opisano wcześniej1,6.
  2. Dodać 60 μl supernatantu EBV (zawierającego 3 - 4 x 108 kopii wirusa/ml) do każdej studzienki na okrągłej płytce96 dołków 17. Należy zachować ostrożność podczas pracy z EBV.
  3. Dodać 1 μg/ml CpG (ODN2006) do dołka.
  4. Pozostawić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  5. Wizualnie monitoruj klon rosnący pod mikroskopem po tygodniu.
    Uwaga: Kilka przykładów wzrostu komórek B można zobaczyć poniżej w sekcji wyników. Zauważ, że tempo wzrostu klonów może się różnić i może być potrzebny dodatkowy czas, aby zacząć dostrzegać pewną masę komórkową rosnącą w środku studni.
  6. Po 1st dwa tygodnie monitoruj klon rosnący pod mikroskopem świetlnym i przejdź do pierwszej wymiany pożywki. Powoli odpipetować 90 μl pożywki z górnej części dołka i zebrać na czystej 96-dołkowej płytce. (Limfocyty B leżą na dnie studni, więc nie ma ryzyka ich zasysania).
    1. Dodać do każdej studzienki 100 μl kompletnej pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1 μg/ml CpG (ODN2006) i 50 U/ml IL2. Jeśli klony rosną, przeanalizuj tę pierwszą wymianę pożywki za pomocą ELISA, jak w kroku 6.
  7. Monitoruj uprawę klonów i zmień pożywkę po 3 i 4 tygodniu ponownego wzrostu, pobierając 90 μl pożywki i dodając 100 μl kompletnej pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1 μg/ml CpG (ODN2006) i 50 U/ml IL2. Pobrany supernatant należy wykorzystać do monitorowania produkcji IgG metodą ELISA, jak w kroku 6.
    Uwaga: Po miesiącu wzrost klonów powinien być widoczny poprzez obserwację agregatów okrągłych komórek, które zwykle leżą w środku studni z okrągłym dnem.
  8. Na tym etapie zmień nośnik w taki sam sposób, jak w poprzednich tygodniach, ale tylko z kompletnymi nośnikami RPMI 1640. Dobrym wskaźnikiem, aby wiedzieć, kiedy jest właściwy moment na zmianę podłoża, jest kolor nośnika, jeśli staje się żółtawy, komórki wymagają wymiany nośnika.
  9. Gdy 96-dołkowe płytki zawierają duże klony (około 5 x 105 komórek), przenieś je do płaskiego dołka 24-dołkowej płytki. Dodaj 300 μl kompletnej pożywki RPMI 1640 do nowej studzienki. Ponownie zawiesić 96-dołkowy klon, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do nowego dołka, rozprowadzając je jednorodnie. W razie potrzeby dodaj nowe multimedia.
    1. Gdy studzienki 24-dołkowej płytki są pełne komórek (około 5 x 106 komórek), przenieś do płaskiego dołka z 6-dołkową płytką. Dodać 2 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 do nowego dołka. Ponownie zawiesić komórki na płytce 24-dołkowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie rozprowadzić je jednorodnie w nowej studzience.
  10. Dodaj multimedia w razie potrzeby. Jeżeli komórki nie mają być utrzymywane w hodowli, należy je otopić w granulkach o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać supernatanty do badania ELISA. Przemyć osad komórek raz 1 x PBS, ponownie odwirować przy 400 x g przez 5 minut i przechowywać w suchym miejscu w temperaturze -80 °C do ekstrakcji RNA.
    1. Gdy komórki w 6-dołkowej płytce zaczną się zlewać (około 20 x 106 komórek), przenieś je na płytkę hodowlaną o średnicy 60 mm. Dodać 4 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 do nowej płytki. Ponownie zawiesić komórki na płytce 6-dołkowej i przenieść je tak, jak to zrobiono w krokach 5.9 i 5.10.
  11. W razie potrzeby dodaj nowe multimedia. Na tym etapie należy zamrozić komórki w stężeniu 10 – 30 milionów/ml w 90% surowicy płodu cielęcego i 10% DMSO. Jeśli potrzebna jest większa ilość komórek, kontynuuj ekspansję klonów na płytkach o większej powierzchni.

6. Test ELISA do wykrywania przeciwciał IgG

  1. Dozować 50 μl/basenik do płytki ELISA z kozim przeciwciałem F(ab)2 przeciwko ludzkiemu Fc, rozcieńczonym 1 200 w buforze powlekającym. Bufor powlekający zawiera 50 mM Na2CO3 pH 9,6.
  2. Uszczelnić płytki plastikową naklejką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Alternatywnie inkubować w temperaturze 4 °C O/N.
  3. Przemyć każdą studzienkę 6 razy 200 μl buforu do mycia. Bufor myjący zawiera 0,05% Tween-20 w 1 x PBS. Nie dotykać ani nie drapać powierzchni studzienki, na której związało się przeciwciało.
  4. Blok z buforem blokującym, 100 μl/basenik. Bufor blokujący zawiera 4% beztłuszczowego mleka w proszku w PBS. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  5. Nie prać. Wyrzuć bufor blokujący i uderz talerzem 3 razy do góry nogami o ręcznik papierowy, aby usunąć resztki płynu.
  6. Inkubuj supernatanty i standardy klonów.
    1. W pierwszym badaniu należy rozcieńczyć supernatanty klonów otrzymane w kroku 5.6 lub 5.7 1/3 w RPMI. Dla wzorców rozcieńczyć roztworem IgG dla pożywki RPMI, aby otrzymać: 1 000 ng / ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62,5 ng / ml, 31,25 ng / ml, 15,6 ng / ml i ślepą próbę. Użyć 50 μl/basenik i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Przeanalizuj dalsze rozcieńczenia supernatantu klonu, aby przetestować powinowactwo przeciwciał, takie jak 1/10 lub 1/100.
  7. Umyj tak, jak w kroku 6.3.
  8. Użyć 50 μl/studzienkę koziej F (ab)2 anty-ludzkiej peroksydazy IgG Fc sprzężonej rozcieńczonej w stosunku 1:20 000 w buforze inkubacyjnym. Bufor inkubacyjny zawiera 1% BSA i 0,02% Tween 20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
  9. Umyj tak, jak w kroku 6.3.
  10. Dodać 100 μl/studzienkowy roztwór substratu zawierający 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB). Inkubować przez 10 minut, aż w studzienkach utworzy się stabilny niebieski kolor. Ostrożnie; Nie czekaj zbyt długo!
  11. Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl 2 M H2SO4. Zmierzyć absorpcję przy 450 nm, w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji.
    Uwaga: Wszystkie supernatanty klonów z 3 odchyleniami standardowymi w stosunku do ślepej próby zostaną uznane za dodatnie na obecność ludzkich przeciwciał IgG. W celu potwierdzenia dodatnich klonów test ELISA należy powtórzyć co najmniej trzy razy w różnych supernatantach tego samego klonu. Ponadto, aby wykluczyć możliwość niespecyficznej reaktywności krzyżowej, zaleca się upewnienie się, że nie ma sygnału, gdy supernatanty są inkubowane w niepowlekanych, ale zablokowanych studzienkach. Na tym etapie można przeprowadzić test detekcyjny w celu zbadania swoistości antygenowej przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przed przejściem do sekcji 7.

7. Izolacja RNA i synteza pierwszej nici cDNA wytwarzających klony IgG

  1. Jak tylko produkcja IgG zostanie potwierdzona przez ELISA, wyekstrahuj RNA klonu.
  2. Do ekstrakcji RNA z komórek rosnących w krokach 5.7 lub 5.9 należy użyć zestawu do bezpośredniej syntezy cDNA komórek w indeksie górnym III, który umożliwia uzyskanie DNA z 10 000 komórek do jednej komórki.
  3. Do ekstrakcji RNA z większych ilości komórek lub z osadu przechowywanego w kroku 5.11 należy użyć zestawu do izolacji RNA o wysokiej czystości. Na tym etapie mogą być również odpowiednie inne systemy ekstrakcji RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. W przypadku numerów komórek od 1 x 106 do 1 x 104 należy użyć systemu odwrotnej transkrypcji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Można również stosować inne systemy do syntezy pierwszej nici cDNA.

8. 1i 2 PCR do amplifikacji ciężkich i lekkich łańcuchów klonów komórek B wytwarzających IgG

  1. Z cDNA klonów komórek, uzyskanym w kroku 5.6 i 5.7 i dodatnim w teście IgG ELISA w kroku 6, należy przeprowadzić PCR ze starterami wymienionymi w Tabeli 1.
  2. Ustaw niezależne PCR dla każdego łańcucha IgG ciężkiego, kappa i lambda. Przygotuj roztwór podstawowy ze starterami do przodu i do tyłu w równych stężeniach. Dodać je do reakcji przy końcowym stężeniu 0,4 μM.
  3. Użyj 1 μl syntezy cDNA, aby przeprowadzić 1ST PCR. Tutaj wykonaj 20 μl reakcji, korzystając z instrukcji producenta Takara Taq. Alternatywnie użyj innych polimeraz.
  4. Umieścić 1. PCR w następujących warunkach cyklu: 94 °C przez 5 minut; (50 cykli: 94 °C przez 30 sekund; 58 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 45 sekund; 72 °C przez 7 minut; pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C. Włączyć do reakcji próbę ślepą w celu wykrycia ewentualnych zanieczyszczeń.
  5. Przygotować 1x TBE (89 mM tris-boranu i 2 mM EDTA). W objętości 100 ml 1x TBE dodać 1 g agarozy (1% żelu agarozowego). Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej przez około 1 minutę, aż agaroza się rozpuści. Następnie dodać 4 μl 10 mg/ml bromku etydyny (lub równoważnego barwnika DNA) i wymieszać.
    1. Wlej zawartość do tacy i poczekaj, aż się spolimeryzuje. Uruchom 5 μl mieszanki PCR w żelu, aby uwidocznić prążki. Ciężkie fragmenty łańcucha powinny mieć około 400 - 550 pz, podczas gdy lekkie łańcuchy powinny mieć około 300 - 400 pz. Jeśli prążki nie zostaną wykryte, przejdź również do 2. PCR.
  6. Użyj 1 μl pierwszej mieszaniny PCR, aby przeprowadzić 2. PCR. Użyć tych samych odczynników, co w kroku 8.2, ale z użyciem odpowiedniej mieszanki starterów (patrz Tabela 1). W przypadku 2. PCR należy zastosować następujące warunki: 94 °C przez 5 min; (50 cykli: 94 °C przez 30 sekund; 56,5 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 55 sekund); 72 °C przez 7 min; pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C. Włączyć do reakcji próbę ślepą w celu wykrycia ewentualnych zanieczyszczeń PCR.
  7. Przygotować żel agarozowy zgodnie z opisem w ppkt 8.5. Uruchom żel, aby zobrazować produkt PCR, jak w punkcie 8.5.1 Użyj amplifikacji, które zawierają fragmenty o odpowiedniej wielkości do klonowania w kroku 9 i wytwórz przeciwciała w kroku 10.
  8. Sekwencjonować DNA, stosując 10 μl reakcji zawierającej: 100 ng 2. PCR, 0,2 μM startera lub mieszaniny starterów, 1 μl terminatora i 1 μl buforu. Przeprowadzić reakcję sekwencjonowania w następujących warunkach: (25 cykli: 96 °C przez 10 sekund; 50 °C przez 5 sekund i do 60 °C przez 4 minuty); 60 °C przez 7 min; pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C.
  9. Oczyść reakcje sekwencjonowania za pomocą mikrospinowych kolumn G50 zgodnie z instrukcjami producenta. Oceń sekwencje podwiązania w automatycznym analizatorze sekwencji, jak opisano wcześniej18 . Elektroferogramy powinny być czyste i odpowiadać pojedynczej sekwencji immunoglobuliny.
    Uwaga: Jeśli produkty PCR wykazują niejasne lub mieszane sekwencje immunoglobulin, rozważ ich sklonowanie za pomocą systemu TopoTA, aby uzyskać izolowane sekwencje, a następnie przejdź do kroku 9.

9. Klonowanie i sekwencjonowanie ciężkich i lekkich łańcuchów produkujących klony IgG

  1. Przygotować 1 μg DNA wektorów pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 i pFUSEss-CHIg-hG1.
  2. Strawić te wektory za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Użyj funkcji EcoRI i BsiWI dla pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI i AvrII dla pFUSE2ss-CLIg-hl2 oraz EcoRI i NheI dla pFUSEss-CHIg-hG1. Użyj 3 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego na 1 μg DNA wektora.
    1. Trawić jednym enzymem i oczyszczać strawiony produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Trawić drugim enzymem i oczyszczać za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (zgodnie z protokołem producenta). Wytnij interesujący nas fragment z żelu agarozowego. Przygotuj żel agarozowy jak w kroku 8.5.
  3. Trawić 2. produkty PCR produkującego klonu IgG: EcoRI i BsiWI do amplifikacji łańcucha kappa, EcoRI i AvrII do amplifikacji łańcucha lambda oraz EcoRI i NheI do amplifikacji łańcucha ciężkiego. Trawić jednym enzymem i oczyszczać strawiony produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Trawić za pomocą drugiego enzymu i oczyszczać strawiony produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Użyj tych samych jednostek enzymów i ilości DNA, co w kroku 9.2.
  4. Zligować fragmenty PCR wewnątrz wektorów za pomocą ligazy DNA T4 16 °C O/N zgodnie z zaleceniami producenta. Stosowany stosunek powinien wynosić 1 : 2 (wektor : wstaw).
  5. Użyj 1 μl ligacji do przekształcenia bakterii DH5α. Postępuj zgodnie z warunkami producenta DH5α dotyczącymi transformacji. Rozprzestrzeniaj bakterie w płytkach blasticydyny lub zeocyny, w zależności od rodzaju użytego wektora. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
  6. Hoduj pojedyncze kolonie i ekstrahuj DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Stosować do hodowli pojedynczej kolonii i ekstrakcji DNA zgodnie z zaleceniami producenta, z zestawu do miniprepu DNA. Przeanalizuj je przez trawienie enzymami używanymi do przygotowania wektorów i insertów, jak w krokach 9.2 i 9.3.
  7. Zsekwencjonuj DNA, używając 100 ng wektora, jak to zrobiono w krokach 8.8 i 8.9.

10. Wytwarzanie przeciwciał w komórkach HEK

  1. Hoduj komórki HEK w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 1% L-glukozą, 1% penicyliną/streptawidyną (DMEM+) do zbiegu 75% na 150 mm płytce do hodowli komórkowej. Wykonaj kroki w okapie od 10.1 do 10.7.
  2. Przed transfekcją należy wymienić pożywkę na pożywkę, jak poprzednio, ale bez płodowej surowicy cielęcej.
  3. Dla każdej transfekcji łańcucha ciężkiego należy przygotować mieszaninę do transfekcji z 2,5 ml DMEM (bez surowicy), 9 μg wektora z łańcuchem ciężkim, 6 μg wektora z łańcuchem lekkim i 100 μl roztworu polietyleniminy (PEI) (z 1 μg/μl roztworu). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Delikatnie dodać 2,5 ml mieszanki do transfekcji przygotowanej w kroku 10.3 do komórek HEK na płytce. Rozkołysz talerzem, aby rozprowadzić równomiernie.
  5. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.
  6. Zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę bez płodowej surowicy cielęcej.
  7. Zbierz podłoże z płytek 4 dni później.
    Uwaga: Przeciwciała w pożywce można wykorzystać do scharakteryzowania ich reaktywności in vitro i in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bramkowanie sortowania po barwieniu komórek pozytywnych dla CD22 i IgG przedstawiono na Rysunku 1. Na tym obrazie wybrano obszar komórek podwójnie pozytywnych – limfocytów B produkujących przeciwciała IgG – aby posortować wszystkie te komórki do oddzielnej probówki. W analizie około 1% całkowitej liczby PBMC odpowiada tej populacji podwójnie pozytywnej. Liczba uzyskanych posortowanych komórek będzie zależeć od liczby komórek uzyskanych w sekcji 1.

Różne wyniki po 5 tygodniach ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym manuskrypcie szczegółowo przedstawiono wszystkie etapy wytwarzania przeciwciał IgG z ludzkich PBMC. Protokół ten ma pewne zalety w porównaniu z poprzednio opublikowanymi technikami. Jedną z zalet jest to, że wytworzone przeciwciało utrzymuje ciężkie i lekkie łańcuchy odpowiadające oryginalnej parze w klonie limfocytów B. Identyfikacja przeciwciał IgG może być przeprowadzona u każdego rodzaju ludzkiego dawcy i nie ma potrzeby zaostrzenia odpowiedzi immunologicznej z powodu szczepienia5. Zastosowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Kontrakt badawczy Miguel Servet (ISCIII CD14/00032) do (G.N.-G.). Stypendium Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych "Graduate School of Translational Neuroscience Program" (022005019) do (C.H.).

Granty od Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) i Association Française contre les Myopathies to (P.M.-M.); a także przez Veni Fellowship Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (916.10.148), stypendium Brain Foundation of the Netherlands (FS2008(1)-28) oraz Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (dla M.L.).

Dziękujemy Jozien Jaspers za pomoc w sortowaniu komórek B za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich10771roztwór zawierający polisarozę i ditrizoan sodu
Sorter komórek FACSAria II BD Nauki Biologiczne 
96 Płytki mikrodołkowe z dnem w kształcie litery U Costar3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średni Gibco, Life Technologies12633-020
30% v/v Supernatant linii komórkowej B95-8 zawierający EBV   ATCCCRL-16123,4 x 108 kopii/ml
CpG2006 Ogniwa InvivogenODN 7909
Wi38 Sigma-Aldrich90020107
Interleukina-2Roche 
Płytki ELISAGreiner Bio-One, Microlon655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment kozy anty-ludzki IgG, Fcγ Fragment specyficzny (niesprzężony)Jackson ImmunoResearch109-006-008
4% beztłuszczowe mleko w proszku (Blotting Grade Blocker) Biorad170-6404
IgG Człowiek SigmaI 2511LUDZKA IgG oczyszczona immunoglobulina, 5,6 mg / ml
Kozia F(ab)2 antyludzka IgG Fcγ (sprzężone z peroksydazą (PO))Jackson ImmunoResearch109-036-008
Czytnik ELISA (Perkin Elmer 2030) Perkin Elmer 2030-0050
Przeciw-ludzka IgM, przeciw-ludzka IgM, Fc5&mikro sprzężona peroksydazą;   Jackson ImmunoResearch309-035-095
SuperScript III System bezpośredniej syntezy cDNA komórek Invitrogen 18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700Applied Biosystems
Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości Roche11828665001
Zestaw systemu odwrotnej transkrypcji PromegaA3500
Rekombinowana polimeraza DNA TaqStartery TAKARAR001A
(2 μ l)Sigma
Ultraczysta Agaroza Invitrogen16500-500
100 bpdrabinka Invitrogen15628-019
Ilość Jeden 4.5.2 (Gel Doc 2000)Biorad170-8100
QIAquick PCR Zestaw do sekwencjonowaniaQIAGEN28106
BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystems4337455
0,1 ml płytka reakcyjna (MicroAMP Optical 96-well)Applied Biosystems4346906
Analizator genetyczny ABI300 Applied Biosystems4346906
DH5α kompetentne komórki (E. coli)Invitrogen18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 pz)Invivogenpfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 pz) Invivogenpfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 pz)Invivogenpfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 pz) Pożywka SOC Invivogenpfuse2ss-hcll2
Invitrogen15544-034
Pożywka agarowa na bazie LB uzupełniona o Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)PłynneInvivogen fas-zn-s
Terrific Broth (TB) uzupełnione Zeocyną (Fast-Media Zeo TB)Zestaw Invivogenfas-zn-l
DNA Miniprep kit Omega Bio TechnologyD6942-02
Nanodrop (spektrofotometr ND1000)Pożywka
LB uzupełniona blastycydyną (Fast-Media Blast Agar)Invivogenfas-bl-s
Terrific Broth (TB) uzupełnione blastycydyną (Fast-Media Blast TB)Invivogenfas-bl-l
EcoRINowa Anglia BiolabsR0101S20,000 U/ml, w 10x NEBuffer EcoRI
NheINew England BiolabsR0131S10,000 U/ml, w 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA drabinka NewEngland BiolabsN3200S0,1-10,0 kb, 1,000 μ g/ml
XmaINew England BiolabsR0180S10 000 U/ml, w 10x buforze CutSmart 
BsiWINew England BiolabsR0553S10 000 U/ml, w 10x NEBuffer 3.1
AvrIINew England BiolabsR0174S5 000 U/ml, w 10x CutSmart Buffer 
FastAP Termoczuła fosfataza alkalicznaThermo ScientificEF06511 U/&mikro; l, w 10x FastAP Buffer
DH5α kompetentne komórki Invitrogen18263-012
PE Mysz Anti-Human IgGBD Pharmingen555787
anty-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22Fisher scientificBDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN27106
BigDye Terminator v3.1Applied Biosystems4337455
10799068001Zestaw do oczyszczania cyklu podłoże na bazie agarowa na bazie Nanodrop Płynne podłoże na bazie

Bibliografia

  1. Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
  2. Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
  3. Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
  4. Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
  5. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  6. Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
  7. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  8. Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
  9. Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
  10. Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
  13. Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
  14. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).
  15. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
  16. Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
  17. Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321(2011).
  18. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uniezale nianie EBVaktywacja receptora Toll podobnego 9izolacja limfocyt w Bcytometria przep ywowadetekcja metod ELISAamplifikacja PCRklonowanie immunoglobulinbadania nad autoimmunizacj

Powiązane artykuły