Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Podsumowanie

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej. Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej. Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Streszczenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki PS) są przedmiotem intensywnych badań ze względu na ich rolę w medycynie regeneracyjnej i badaniach przesiewowych leków. Jednak do wykorzystania ogniw PS w tych zastosowaniach wymagane byłoby opracowanie systemu hodowli masowej. Hodowla zawiesinowa jest jedną z obiecujących metod hodowli do masowej produkcji komórek PS, chociaż niektóre kwestie, takie jak kontrolowanie agregacji i ograniczanie naprężeń ścinających z pożywki, są nadal nierozwiązane. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy metodę enkapsulacji alginianu wapnia (Alg-Ca) za pomocą dyszy współosiowej. Ta metoda może łatwo kontrolować rozmiar kapsułek poprzez współprzepływ gazu N₂. Kontrolowana średnica kapsułki musi być większa niż 500 μm, ponieważ zbyt duże natężenie przepływu gazu_N2 powoduje rozpad kropel, a tym samym kapsułek o niejednorodnych rozmiarach. Co więcej, niskie stężenie Alg-Na i CaCl₂ powoduje powstawanie kapsułek niesferycznych. Chociaż kapsułka Alg-Ca bez powłoki Alg-PLL łatwo się rozpuszcza, umożliwiając gromadzenie komórek, mogą one również potencjalnie wyciekać z kapsułek pozbawionych powłoki Alg-PLL. Rzeczywiście, powłoka alginiatowo-PLL może zapobiegać wyciekom komórkowym, ale jest również trudna do złamania. Technologia ta może być wykorzystana do badań niszy komórek macierzystych, a także do masowej produkcji komórek PS, ponieważ enkapsulacja może modyfikować mikrośrodowisko otaczające komórki, w tym macierz zewnątrzkomórkową i stężenie wydzielanych czynników.

Wprowadzenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki iPS) są obecnie źródłem intensywnych badań ze względu na ich rolę w medycynie regeneracyjnej. Jednak do regeneracji tkanek potrzebne są ogromne ilości komórek. Na przykład około miliarda komórek trzustki potrzebnych pacjentowi z cukrzycą typu 1¹. Jednak konwencjonalna hodowla talerzowa jest w stanie uzyskać tylko 1 × 10⁵ komórek/^cm2, co wymaga 1 m² powierzchni hodowli, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek trzustki pochodzących z komórek macierzystych do leczenia pacjenta z cukrzycą typu 1. W związku z tym w medycynie regeneracyjnej konieczne jest opracowanie systemu do masowej hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, takiego jak mikronośnik² i hodowla zawiesinowa. Hodowla zawiesinowa stanowi obiecującą metodę hodowli masowej, ale kontrolowanie agregacji komórek jest wyzwaniem w bezpośrednich hodowlach zawiesinowych ludzkich komórek iPS³. Rzeczywiście, zawieszone komórki są narażone na naprężenia ścinające, które powodują uszkodzenie komórek³ lub różnicowanie⁴.

Badania nad enkapsulacją na bazie hydrożelu zostały przeprowadzone w celu rozwiązania problemów związanych z hodowlą zawiesiny. W kapsułkach hydrożelowych komórki są chronione przed przepływem pożywki. Poprzednie doniesienia udokumentowały stosowanie różnych rodzajów hydrożelu, w tym agarozy⁵, PEG⁶ i alginianu (Alg), do enkapsulacji komórkowej. Hydrożel Alg-Ca jest jednym z najbardziej użytecznych hydrożeli do enkapsulacji komórek, ponieważ hydrożel Alg-Ca powstaje natychmiast po wrzuceniu roztworu alginianu do roztworu CaCl₂ i jest również łatwo trawiony przez enzymy lub odczynniki chelatujące.

Tutaj ustaliliśmy stabilny proces enkapsulacji alginianów dla komórek iPS za pomocą dyszy współosiowej. Wykorzystując przepływ gazu_N2 do tworzenia kropel, możliwe jest zamknięcie komórek w jednolitych kapsułkach bez konieczności stosowania innych odczynników, takich jak olej. W tej metodzie natężenie przepływu N₂ i stężenie zarówno CaCl₂, jak i alginianu są głównymi warunkami pracy wpływającymi na rozmiar, kształt i jednorodność kapsułek. Niniejszy raport pokazuje optymalizację tych warunków pracy dzięki zastosowaniu kamery szybkoobrotowej i mikroskopu.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotuj 10 mM bufor HEPES. Dostosuj pH do 7,0 przy RT i dodaj NaCl do 0,9%.
2. Przygotować 5% roztwór alginianu i 10 mM roztwór EDTA, mieszając sól fizjologiczną buforowaną przez HEPS przygotowaną w 1.1. Dostosuj pH do 7,0 przy RT.
3. Odczynniki (1.1, 1.2) należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
4. Przygotować żelatynowe szalki o średnicy 60 mm wyłożone 1,2 − 2,0 × 10⁶ mysich komórek fibroblastów zarodkowych (MEF), które traktuje się jako komórki żywicielskie przez inkubację w DMEM zawierającym 10% FBS kwalifikowanego przez ES i 10 μg/ml mitomycyny C przez 90 - 120 min.
5. Utrzymuj indukowane przez myszy pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) na naczyniu z komórkami zasilającymi w obecności 5 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 20% FBS kwalifikowanego przez ES, 50 μM 2-merkaptoetanolu, aminokwasów endogennych i antybiotyków (100 jednostek/ml sodu penicyliny G, 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B).
6. Wysiewać 4 × 10⁵ komórek iPS na pokrytej żelatyną szalce o średnicy 60 mm i inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Zmieniaj pożywkę hodowlaną codziennie podczas inkubacji. Po 3 – 4 dniach hodowli trypsynizować komórki przez 1 minutę za pomocą 500 μl 0,05% trypsyny zawierającej 0,02% EDTA w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Następnie odłącz komórki, stukając dziesięć razy w naczynie hodowlane.
7. Dodać 2,5 ml DMEM z 10% FBS kwalifikowanym przez ES i antybiotykami (po dysocjacji mysich komórek iPS na pojedyncze komórki przez trzykrotne pipetowanie mikropipetą 1 000 μl), odwirować zawiesinę komórek przy 160 × g przez 3 minuty, usunąć supernatant i policzyć komórki. Po zliczeniu komórek ponownie wysiewaj zebrane komórki na naczyniu pokrytym żelatyną i inkubuj przez 30 minut, aby wyizolować komórki iPS od komórek MEF. Po zliczeniu komórek (zwykle można zebrać 1 – 3 × 10⁶ komórek/szalkę), ponownie zasiej 4 × 10⁵ komórek iPS na szalce.

2. Enkapsulacja komórek w kapsułkach hydrożelowych alginianowych

1. Zebrać komórki zgodnie z tą samą procedurą, opisaną w ppkt 1.5 i 1.6. Po odwirowaniu w stężeniu 160 × g przez 3 minuty, trzykrotnie przepłukać osad komórek iPS roztworem soli fizjologicznej buforowanym przez HEPES. Po ponownym zawieszeniu komórek w soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES, przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 40 μm w celu usunięcia dużych agregatów, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać dyszę.
2. Wymieszać 2 ml zawiesiny komórkowej z solą fizjologiczną buforowaną przez HEPES i 3 ml 5% roztworu Alg-Na. Na koniec otrzymuje się 5 ml zawiesiny komórkowej w 3% roztworze Alg-Na. Gęstość komórek jest pożądana powyżej 10⁶ komórek/ml.
3. Po zebraniu zawiesiny komórek do strzykawki o pojemności 5 ml zainstalować współosiową dyszę (Rysunek 1A, B) na strzykawce i ustawić je na pompie strzykawkowej. Emitować przepływ gazu N₂ (mniejszy niż 1 l/min) przez zewnętrzną igłę dyszy współosiowej i wyrzucić zawiesinę komórek przez dyszę wewnętrzną.
4. Zebrać kropelki do 250 ml 0,5% roztworu CaCl₂ i odczekać 10 – 20 minut na żelowanie, mieszając przy 60-90 obr./min.

3. Leczenie kapsułkami alginianowymi (opcjonalnie)

1. Kapsułki Alg-Ca inkubować w 0,05 % (w/v) roztworze poli-l-lizyny (PLL) przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Po umyciu kapsułek solą fizjologiczną buforowaną przez HEPES należy je inkubować w DMEM zawierającym 10% FBS w celu zneutralizowania ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Wykorzystaj je jako kapsułki powlekane (Rysunek 1C).
3. Inkubować kapsułki w buforowanym przez HEPES roztworze soli fizjologicznej zawierającym 10 mM EDTA przez 5 minut. Kapsułki poddane działaniu EDTA są wykorzystywane jako puste kapsułki (ryc. 1C).

4. Hodowla i zbieranie komórek w kapsułkach alginianowych

1. Inkubować zamknięte komórki przy prędkości 75 obr./min, wytrząsając w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 10 dni.
2. Zebrać i inkubować kapsułki w 10 mM EDTA w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 10 minut. Zebrać komórki z kapsułek alginianowych bez poddawania działaniu PLL przez odwirowanie w temperaturze 1 000 × g przez 3 min.
3. Jeśli kapsułki alginianowe są traktowane PLL, należy rozbić membranę Alg-PLL, pipetując około dziesięć razy w górę i w dół za pomocą igły dołączonej do strzykawki i odwirować ją przy 1000 - 5000 × g przez 5 minut. Średnica igły powinna być mniejsza niż rozmiar kapsułki, a w tym eksperymencie używa się igieł 25 G (260 μm) (600 μm)
4. Po odwirowaniu zbierz osady komórkowe wyłącznie z uszkodzonych błon Alg-PLL, jeśli chcesz pobrać próbki mRNA z komórek. Pozostałe błony Alg-PLL mogą uniemożliwiać oczyszczanie mRNA.

Wyniki

W protokole 2.5 wydalony roztwór alginianu tworzy kulisty kształt natychmiast po wydaleniu (Rysunek 2A - H). Jeśli zawiesina jest wydalana z natężeniem przepływu N₂ mniejszym niż 1 l/min, wielkość kropel jest jednolita (rysunek 2I). Jeśli jednak przepływ_N2 jest większy niż 1 l/min, kropla rozpada się (rysunek 2G, biała strzałka), a wielkość kropelek staje się niejednorodna (rysunek 2J). Biorąc to pod uwagę, trudno jest przygotować k...

Dyskusja

Kulturę enkapsulacyjną można porównać z kulturami w zawiesinie bezpośredniej. Hodowla zawiesinowa jest prostszą metodą pozyskiwania dużych ilości pluripotencjalnych komórek macierzystych niż metody enkapsulacji. Jednak kontrolowanie agregacji komórek w hodowli zawiesinowej jest nadal trudne. W metodzie enkapsulacji agregacja komórek jest ograniczona w kapsułkach i dlatego może być dobrze kontrolowana. Poprzednia publikacja wykazała, że otorbione komórki tworzyły agregaty o jednolitej wielkości, podczas gdy duże skupiska ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fibroblasty zarodków myszy	Cell Biolabs	SNL 76/7
Mysia pluripotencjalna komórka macierzysta	RIKEN Bio centrum resorcyjne	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM o wysokiej stężeniu glukozy	GIBCO	11995
ES kwalifikowany  FBS	GIBCO	16141079
Antybiotyki przeciwbakteryjne	GIBCO	15240
Aminokwas nieistotny	GIBCO	11140
2-merkaptoetanol	GIBCO	21985-023
Czynnik hamujący białaczkę ESGRO Merck	Millipore	ESG1107
Trypsyna / EDTA	GIBCO	25300
Igła 26 G/16 G	Hoshiseido
10 ml Strzykawka	TERUMO	SS-10ESZ
Sód  Chlorek	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Alginian sodu	Wako	194-09955
Chlorek wapnia	Wako	039-00475
Poli-L-lizyna (MW = 15 000 - 30 000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Pompa Sylinge	JAKO JEDEN
Mikroskop	Olympus	IX71
Mikroskop	Leica	DM IRB
Hispeed kamera	nac technologia obrazu	Memrecam HX-3