Mysi model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza na tętnicy szyjnej i naczyniu krezkowym

Podsumowanie

Model zakrzepicy indukowanej FeCl₃ u myszy jest opisany tutaj. Przedstawiono metodę monitorowania wzrostu skrzepliny za pomocą obserwacji mikroskopowej przyżyciowej naczynia krezkowego oraz pomiaru przepływu krwi w tętnicy szyjnej.

Streszczenie

Ciężka zakrzepica i jej niedokrwienne konsekwencje, takie jak zawał mięśnia sercowego, zatorowość płucna i udar mózgu, są głównymi problemami zdrowotnymi na całym świecie. Uszkodzenie chlorkiem żelaza jest obecnie dobrze znaną techniką szybkiego i dokładnego wywoływania tworzenia się skrzeplin w odsłoniętych żyłach lub tętnicach o małej i dużej średnicy. Model ten odegrał kluczową rolę w badaniach nad patofizjologią zakrzepicy, w odkrywaniu i walidacji nowych leków przeciwzakrzepowych oraz w zrozumieniu mechanizmu działania tych nowych leków. W tym miejscu przedstawiono zastosowanie tej techniki na naczyniu krezkowym i tętnicy szyjnej u myszy. Metoda opisuje sposób znakowania krążących leukocytów i płytek krwi barwnikiem fluorescencyjnym oraz obserwacji za pomocą mikroskopii przyżyciowej na odsłoniętej krezce ich nagromadzenia na uszkodzonej ścianie naczynia, co prowadzi do powstania skrzepliny. Na tętnicy szyjnej niedrożność spowodowaną tworzeniem się skrzepu mierzy się poprzez monitorowanie przepływu krwi za pomocą sondy dopplerowskiej.

Wprowadzenie

Badanie mechanizmów związanych z rozwojem zakrzepicy i ocena skuteczności leków przeciwzakrzepowych wymaga dobrze ugruntowanych eksperymentalnych modeli zwierzęcych. Jako pierwsze wykorzystano duże modele zwierzęce, ponieważ zapewniają one duże naczynia bardziej podobne do ludzi niż gryzoni¹. Jednak wysokie koszty, wymagane większe obiekty i trudności w genetycznej manipulacji nimi są głównymi wadami ich stosowania, a duże zwierzęta są obecnie ograniczone do późnych badań przedklinicznych, gdy wstępne testy na gryzoniach dały rozstrzygające wyniki². Dzięki szerokiej dostępności szczepów transgenicznych i knockout oraz ich niewielkim rozmiarom, które minimalizują ilość leków przeciwzakrzepowych wymaganych do testów in vivo, myszy są głównie wykorzystywane do badań nad zakrzepicą. Dlatego u myszy opracowano kilka modeli zaburzeń zakrzepowych³.

Wiele znanych modeli zakrzepicy narusza warstwę wewnętrzną ściany naczynia, po czym następuje ekspozycja podśródbłonkowej macierzy zewnątrzkomórkowej na przepływ krwi, powodując powstawanie skrzepów krwi⁴. Skrzepliny mogą wynikać z ekspozycji kolagenu, który wyzwala aktywację płytek krwi i/lub z ekspozycji czynnika tkankowego, który aktywuje kaskadę krzepnięcia⁵. Następnie stosuje się kilka technik, aby osiągnąć początkowe uszkodzenie naczynia. Pierangeli i wsp. opracowali model mechanicznego zakłócenia za pomocą narzędzia mikrochirurgicznego na żyle udowej⁶. Kikushi i wsp. opisano model, który polega na podaniu związku fotoreaktywnego (Rose Bengal), który gromadzi się w dwuwarstwie lipidowej komórek śródbłonka, a następnie na specyficznym wzbudzeniu ściany naczynia za pomocą zielonego światła (540 nm)⁷. Uraz może być również wywołany przez krótkie, impulsowe oświetlenie laserowe o dużej intensywności⁸. Inna technika po raz pierwszy opracowana na tętnicy szyjnej szczurów polega na miejscowym stosowaniu chlorku żelaza (FeCl₃)⁹. W tym przypadku denudacja naczyń wynika z wolnych rodników generowanych przez FeCl₃, który powoduje peroksydację lipidów i niszczenie komórek śródbłonka¹⁰. Uraz indukuje ekspresję kilku cząsteczek adhezyjnych, wywołując adhezję i agregację płytek krwi, a także rekrutację leukocytów. Wykazano, że leukocyty, zwłaszcza neutrofile, odgrywają kluczową rolę w aktywacji kaskady krzepnięcia krwi prowadzącej do zakrzepicy¹¹. Ta metoda dobrze nadaje się do odtwarzania kaskady krzepnięcia; Badacze muszą pamiętać, że w tym modelu mysim zakrzepica jest zwykle wywoływana w zdrowych naczyniach, podczas gdy zakrzepica u ludzi występuje głównie u chorych, np. naczynia miażdżycowe.

Ponieważ ten model jest bardzo prosty do wdrożenia i skuteczny również u myszy, jest obecnie najczęściej używanym modelem zakrzepicy w badaniach in vivo na małych zwierzętach. Ponadto technika ta daje możliwość wywołania powstawania skrzeplin w różnych naczyniach. Naczyniami docelowymi mogą być tętnice lub żyły o dużej średnicy (tętnica szyjna, kość udowa, żyła główna) lub małej średnicy (krezka, krezka)^12–14. Ostatnio zastosowano go również na bliższej środkowej tętnicy mózgowej w celu opracowania modelu udaru¹⁵. Powstawanie zakrzepicy można bezpośrednio obserwować za pomocą mikroskopii przyżyciowej po znakowaniu fluorescencyjnym płytek krwi i leukocytów lub monitorować poprzez pomiar spadku przepływu krwi za pomocą sondy temperatury lub sondy dopplerowskiej^12,16,17. Następnie można zbadać kilka parametrów, takich jak czas okluzji, czas tworzenia skrzepliny lub wielkość skrzepliny. Różnice fizjologiczne między badanymi naczyniami skutkują znacznymi różnicami w uzyskanych skrzeplinach. Dlatego badacze zwykle wybierają naczynie docelowe zgodnie z parametrami, które chcą zmierzyć i/lub ustawieniem choroby, które chcą zbadać. Zazwyczaj model tętnicy szyjnej jest bardziej odpowiedni dla badań nad zakrzepicą tętnic związanych z zawałem mięśnia sercowego lub udarem, podczas gdy badania nad żyłą główną są bardziej istotne dla badań nad zakrzepicą żył głębokich. Dostępność różnych naczyń decyduje również o metodzie stosowanej do pomiaru wzrostu skrzepliny. Na przykład naczynia krezkowe są łatwo dostępne, co sprawia, że model ten dobrze nadaje się do przyżyciowej obserwacji mikroskopowej i badania dynamiki powstawania skrzepliny. Tętnica szyjna jest mniej dostępna, ale większa, co umożliwia pomiary przepływu krwi i stanowi doskonały model do badania zakrzepicy okluzyjnej.

Model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza zapewnił ogromny postęp w zrozumieniu tej patologii. Został wykorzystany w wielu badaniach koncentrujących się na roli czynnika von Willebranda w powstawaniu zakrzepicy^18,19. W połączeniu z technikami modyfikacji genetycznej umożliwiło to identyfikację wielu specyficznych genów zaangażowanych w zaburzenia zakrzepowe. Lamrani i wsp. na przykład wykazały, że knock-in genu^{JAK2 V617F} jest związany z przyspieszonym tworzeniem się niestabilnego skrzepu²⁰. Zhang i in. zbadali fizjologiczne implikacje receptora płytkowego P2Y12 i wykazali, że myszy transgeniczne z nadekspresją specyficznie tego receptora tylko w płytkach krwi, wykazywały szybsze i stabilniejsze tworzenie się skrzepliny w tętnicy krezkowej uszkodzonej FeCl₃²¹. W tej metodzie zbadano również kluczową rolę tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) i aktywatora plazminogenu typu urokinazy (uPA) w procesie degradacji fibryny²². Co więcej, model ten zapewnia również prosty i dokładny sposób testowania zdolności fibrynolitycznych wielu nowych leków in vivo. Na przykład Wang i wsp. wykorzystali ten model do przedklinicznej walidacji nowego rekombinowanego aktywatora plazminogenu ukierunkowanego na aktywowane płytki krwi²³. Metoda ta umożliwiła również walidację białek terapeutycznych wyizolowanych ze śliny kleszczy, nietoperzy wampirów i komarów lub z jadu węży ze specyficzną identyfikacją celu^24-27. Przykłady te pokazują wszechstronność modelu chlorku żelaza. W tym artykule skupiamy się na dwóch metodach i badamy zakrzepicę indukowaną chlorkiem żelaza na dwóch różnych typach naczyń; naczynie krezkowe i tętnica szyjna.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Alfred Medical Research and Education Precinct (E/1534/2015/B). Wszystkie manipulacje chirurgiczne były wykonywane w pełnej narkozy, a zwierzęta nie odczuwały bólu na żadnym etapie. Wszystkie opisane eksperymenty nie są regeneracyjne.

1. Przygotowanie

1. Wytnij cienkie pasma bibuły filtracyjnej (1 mm x 2 mm).
2. Świeżo przygotuj 2 roztwory chlorku żelaza o stężeniu 4% (w/v) i 6% (w/v) rozcieńczone w wodzie dejonizowanej. Przygotować roztwór rodaminy 6G 0,3% w PBS, przefiltrowany przez 0,22 μm.
3. Wytnij mały kawałek (5 mm x 1 cm) z białego plastiku opakowania strzykawki.

2. Tworzenie się skrzepliny tętniczki krezki obserwowane przez mikroskopię przyżyciową

1. Zważyć 10-12 tygodniowego samca myszy typu dzikiego C57Bl/6 i odpowiednio znieczulić mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Monitorować głębokość znieczulenia poprzez reakcję na uszczypnięcie palca, ogona i/lub skóry, reaktywność spowodowaną uszczypnięciem rogówki i powiekowej oraz brak ruchu wąsów. W razie potrzeby wstrzyknąć drugą dawkę ketaminy (50 mg/kg) w celu utrzymania znieczulenia zwierzęcia. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Umieść mysz na małej szalce Petriego umieszczonej na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C.
   UWAGA: Chociaż wstrzyknięcie IP może powodować ból u zwierząt, czas trwania tego dyskomfortu będzie minimalny (mniej niż 3 sekundy). Ból i dyskomfort związany z iniekcjami zostanie zminimalizowany dzięki zastosowaniu doświadczonego i kompetentnego personelu oraz odpowiedniej wielkości igły (25 G). Po wykonaniu wszystkich procedur należy poddać eutanazji wszystkie zwierzęta za pomocą przedawkowania ketaminy i ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
2. Wykonaj nacięcie linii środkowej brzucha o długości około 3 cm w skórze i ostrożnie przeciąć otrzewną.
3. Umieść mysz z boku szalki Petriego, delikatnie wyeksterioryzuj jej jelita i ostrożnie rozprowadź krezkę za pomocą 2 wacików, aby wyprowadzić odpowiednie naczynie na powierzchnię szalki Petriego. Dokładnie wysuszyć delikatną wycieraczką.
   UWAGA: Aby ograniczyć ruch naczyń krezkowych, papaweryna może być stosowana w celu zahamowania perystaltyki jelit
.
4. Namocz ogon myszy w ciepłej wodzie, aby rozszerzyć naczynia krwionośne i wstrzyknij 30 μl rodaminy 6G (0,3%) do żyły ogonowej myszy za pomocą strzykawki 29 G, aby oznaczyć leukocyty i płytki krwi.
5. Umieść szalkę Petriego pod odwróconym mikroskopem i skup się na wybranej tętniczce za pomocą kanału jasnego pola.
6. Namocz pasmo bibuły filtracyjnej 6% (w/v) chlorkiem żelaza (III) i nałóż bibułę filtracyjną na tętniczkę za pomocą dwóch kleszczyków: pierwszy do przytrzymania bibuły filtracyjnej, drugi do delikatnego dociśnięcia jej do obszaru zainteresowania. Obserwuj tworzenie się skrzepliny w ciągu pierwszych 10 sekund po nałożeniu bibuły filtracyjnej.
   UWAGA: Dość często dochodzi do uszkodzenia otaczającego mikrokrążenia, a precyzja osadzania bibuły filtracyjnej i delikatny nacisk są dlatego ważne jest, aby ograniczyć ten problem.
7. Obserwuj tworzenie się skrzepliny za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (kanał TRITC: wzbudzenie piku 557 nm, emisja piku 576 nm), przez bibułę filtracyjną. Obserwuj krążące leukocyty i płytki krwi, które wchłonęły rodaminę 6G, a zatem ich agregacja do skrzepliny jest łatwa do zidentyfikowania.
8. Zdejmij bibułę filtracyjną po 1 minucie ekspozycji na chlorek żelaza (III) i kontynuuj monitorowanie tworzenia się skrzepliny. Umyj naczynie PBS.
9. Obserwuj i rejestruj dynamiczne tworzenie się skrzepliny podkreślone znakowaniem płytek krwi i leukocytów za pomocą rodaminy 6G. Uchwyć obrazy i zmierz rozmiar skrzepliny. Przedstawione obrazy uzyskano za pomocą odwróconego mikroskopu przyżyciowego, choć obiektywnego 4X, w kanale fluorescencyjnym TRITC.
10. Po wykonaniu wszystkich procedur należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy i ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.

3. Powstawanie skrzepliny w tętnicy szyjnej oceniane na podstawie pomiaru prędkości przepływu krwi

1. Zważyć 10-12 tygodniowego samca myszy C57Bl/6 i odpowiednio znieczulić mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
2. Zamocuj mysz pod mikroskopem operacyjnym za pomocą taśmy klejącej na nogach, na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C.
3. Zrób małą poduszkę z jednej wycieraczki i przyklej ją pod głową myszy, aby lekko unieść głowę. Użyj pętli z nici ze szczypcami, aby pociągnąć pysk w dół (użyj górnych zębów). Spowoduje to odsłonięcie obszaru tętnicy szyjnej w celu łatwego dostępu.
4. Wykonaj małe nacięcie skóry o głębokości 5 mm bezpośrednio pod szczęką, w dół do mostka.
5. Wypreparuj powięź i wyizoluj fragment lewej lub prawej tętnicy szyjnej wspólnej powyżej rozwidlenia.
6. Ostrożnie wprowadź pęsetę między tętnicę a nerw, aby je rozdzielić. Nie należy naruszać nerwu biegnącego w pobliżu tętnicy i unikać zbytniego dotykania tętnicy szyjnej, ponieważ może to spowodować uszkodzenie naczynia. Odizolować odcinek co najmniej 5 mm tętnicy.
7. Dokładnie osusz obszar tętnicy za pomocą wycieraczek, aby uniknąć zakłóceń płynu z FeCl₃.
8. Umieść mały biały plastikowy kawałek pod izolowaną częścią wspólnej tętnicy szyjnej, aby FeCl₃ nie wsiąkł w otaczające tkanki. W tym celu użyj drugich kleszczy, aby przyłożyć kawałek do pierwszego, a następnie powoli wsuń plastikowy papier pod tętnicę.
9. Namocz kawałek bibuły filtracyjnej 4% (w/v) lub 6% (w/v) chlorku żelaza i umieść go wokół tętnicy.
10. Po 3 minutach ekspozycji zdejmij bibułę filtracyjną, spłucz PBS i osusz obszar wycieraczkami.
11. Umieść sondę przepływu Dopplera wokół naczynia w miejscu urazu i zacznij rejestrować zmiany przepływu. W zdrowej tętnicy szyjnej dorosłej myszy przepływ wynosi zwykle około 1 ml/min. Uwaga! Kontakt sondy z chlorkiem żelaza spowoduje jej uszkodzenie, dlatego należy unikać jakiegokolwiek kontaktu. Przedstawione dane uzyskano za pomocą przepływomierza Transonic System Inc., modułu okołonaczyniowego TS420 wyposażonego w sondę przepływu Nano Doppler 0,5 PBS.
    UWAGA: Stężenie chlorku żelaza może modyfikować kinetykę tworzenia się skrzepliny, co skutkuje różnymi czasami okluzji. Zatem ekspozycja na 6% (w/v) chlorku żelaza daje szybszą okluzję niż ekspozycja na 4% (w/v) chlorek żelaza.
12. Po wykonaniu wszystkich procedur należy poddać eutanazji wszystkie zwierzęta za pomocą przedawkowania ketaminy i ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy i ostrożnie wyczyścić sondę Dopplera.

Wyniki

Fluorescencyjna mikroskopia intravitalna krezki wykaże gromadzenie się znakowanych Rodaminą 6G płytek krwi i leukocytów wzdłuż ściany naczynia uszkodzonego przez FeCl₃. Postępujące tworzenie się częściowego zakrzepu jest monitorowane w naczyniu krezki o średnicy 200 µm (Rysunek 1). Zakrzep pojawia się powoli i jest wyraźnie identyfikowalny po pierwszej minucie ekspozycji na FeCl₃ (Rysunek 1, t = 60 sec). 40 sec po usunięciu papieru filtracyjnego nasączonego FeCl

Dyskusja

Model zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza jest doskonałym narzędziem badawczym. Jak wykazano w tym badaniu, jest on niezwykle łatwy do wdrożenia, a gdy jest stosowany w połączeniu z mikroskopią przyżyciową lub przepływomierzem dopplerowskim, zapewnia dobre monitorowanie tworzenia się skrzepliny w czasie rzeczywistym. Dostosowując czas ekspozycji i stężenie FeCl₃, daje również możliwość wytwarzania skrzeplin nieokluzyjnych lub okluzyjnych.

Jednak ta metoda ma również pewne ograni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bibuła chromatograficzna Whatman	GE Healthcare	3030917
Chlorek żelaza (III) 40% (w/v)	VWR	24212.298
Rodamina 6G	Sigma	R4127
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX81
Cyfrowy czarno-biały aparat	Przepływomierz	XM10
	Transonic	TS420
Nano-dopplerowska sonda przepływu	Transonic	0,5 PBS
Ketamina	Hospira	0409-2051-05
Ksylazyna (Rampun)	Bayer	75313
Szalka Petriego	Sarstedt	82.1472
Strzykawka insulinowa (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Aplikatory z bawełnianą końcówką	BSN medical	211827A
Nici dysilkowe	Dynek Dynek Pty Ltd	CS30100
Bufor fosforanowy Dulbecco sól fizjologiczna (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Poduszka grzewcza	Kirchner	T60

dopplerowski Olympus